一种基于水凝胶的可控3D拉伸训练生物反应器

一种基于水凝胶的可控3d拉伸训练生物反应器


背景技术：

1.人体中的所有活细胞都在经受多种力学载荷和形变。力学因素在包含硬组织(例如，骨等组织)和软组织(例如，软骨、肌腱/韧带等组织)在内的受力组织的发育、维持、退变和修复再生中起着关键作用。由此，开发可靠的模型来研究生理和病理载荷条件下组织内细胞的力学生物学可为预防和治疗组织损伤和退行性病变提供重要的研究数据和科学见解。水凝胶(亲水性聚合物网络)具广泛的力学特质，如柔性水凝胶在一定范围内具备弹性和可拉伸的形变等，一些柔性水凝胶还具有高度的生物兼容性，不仅可以模拟组织细胞的三维生物微环境，力学的载荷还可以通过水凝胶的形变传递到其包封的细胞上。
2.在体外的细胞和组织长期培养过程中向研究主体施加一定程度的力学刺激可以模拟体内的生物力学环境，并且在体外施加的力学单因素的可控模型可减少利用动物模型进行力学因素相关研究的研究系统的复杂性。
3.许多商业实体提供生物反应器，为细胞培养物和生物材料提供可控力学载荷，所述商业实体包含：(北卡罗来纳州伯灵顿)、bose(特拉华州纽卡斯尔)、biss组织生长技术公司(biss tissue growth technologies，印度班加罗尔)和(加拿大安大略省滑铁卢)。
4.例如，的张力系统是由计算机调节的生物反应器，所述生物反应器对体外气动变形膜上培养的细胞施加周期性或静态应变。ta测试仪器将生物反应器室与力学测试仪器相结合，在无菌细胞培养环境内为工程化组织和生物材料提供载荷、表征和组织生长培养液。尽管在这些系统中已经提供了细胞培养基，但是培养基的体积通常不足以长时间维持细胞活性。此外，培养基很难添加或去除，并且在动态压缩期间难以对样品进行观察。这些生物反应器仅适用于平面细胞培养或以组织水平施加力学载荷。
5.再如，提供了弹性材料的疲劳测试平台，包括了各种样本附件(包含螺旋驱动夹具、弹簧加载夹具和多点穿刺抓具)的竖直和水平测试。在这类系统中用于固定和伸展弹性材料的夹具对低力学强度水凝胶材料的低控制力和样品破坏力限制了其在柔性水凝胶材料和三维细胞-水凝胶构建体中的应用。
6.本发明可为生物医学工程学研究提供更可靠的可控三维力学微环境的研究平台。


技术实现要素：

7.本发明涉及一种用于在三维(3d)细胞和/或组织培养物中，更具体地说，在基于水凝胶-磁体组合的细胞和/或组织培养物中，诱导可控拉伸应变的装置和方法。通过所述装置和方法，可伸展水凝胶在磁场中发生形变以向水凝胶包封的细胞和/或组织施加拉伸应变。本装置的优势是：载荷条件可控；使用方便；适用于柔性水凝胶和多种细胞和组织的长期培养和载荷；易于样本加载、力学加载、添加和去除生长培养基、添加生物活性剂，并允许对测试中的样品进行实时监测和追踪。
8.本发明进一步提供了一种用于测试基于水凝胶的构建体的柔性材料的疲劳性能的装置和方法，更具体地说，基于水凝胶-磁体的组合系统，通过所述装置和方法，可令水凝胶在磁场中伸展产生应变，以此向水凝胶施加可控的周期性的拉伸应变。所述装置和方法可以用于通过测量张力、杨氏模量和/或质量变化和/或鉴定所述基于水凝胶的构建体的形态变化来确定所述基于水凝胶的构建体的柔性材料的疲劳/抗疲劳性能。
附图说明
9.图1a到图1c示出了3d拉伸训练生物反应器的水凝胶构建体的制造。(图1a)为了使基于水凝胶的构建体成形，通过软光刻方法制备了pdms模具1，所述模具具有立方体凹面部分2(长
×
宽
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高为2
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0.7
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0.6cm)和三个连接的薄凹面部分3(长
×
宽
×
高为1
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0.3
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0.15cm)。(图1b)在水凝胶成形并取出之后，所得水凝胶构建体4具有一个锚定点2，所述锚定点的内部嵌入有圆柱形管5(长度2cm，直径2mm)以便将整个水凝胶生物反应器锚定在培养皿中；以及三个臂3，每个臂3的自由端处固定有磁珠6(直径50-100μm，5-10毫克/臂)，所述三个臂被设计用于包封细胞并接受远程拉伸载荷。(图1c)示出了用于制造水凝胶构建体的详细步骤的流程图，其包含放置每个元件的顺序和整合所有元件的方法。
10.图2示出了3d细胞拉伸训练生物反应器的加载装置8。加载装置8的全景视图显示了其所包含的每个组件。控制器10允许对参数进行程序编辑以控制平台12的移动速度和移动距离。平台12用于固持细胞培养皿。磁体13被固定在导轨11上以通过磁场向嵌入有磁珠6的水凝胶构建体4提供拉伸载荷。控制器10具有一个用于精确显示平台的移动距离的屏幕14，以及用于程序编辑和精确控制平台12的移动的按钮15-19。在精确控制下，平台12沿滚轴20在导轨滑块11的左侧朝向和远离固定磁体13周期性地移动。
11.图3a到图3c示出了3d细胞拉伸训练生物反应器的优化和生物相容性。(图3a)为了优化水凝胶构建体的拉伸参数，使用甲基丙烯酰化明胶(gelma)作为示例水凝胶，并且在拉力载荷下可以实现10-45％的伸长。(图3b)使用活/死细胞染色来评估水凝胶构建体的生物相容性，从而示出了细胞嵌入到gelma构建体中之后的活力。(图3c)使用流式细胞术测试拉力加载下的细胞活力。拉伸载荷15天后，从水凝胶构建体中分离细胞并用碘化丙锭染色。与静态对照组相比，周期性拉伸载荷并不影响细胞活力。
12.图4a到图4b示出了3d拉伸训练生物反应器的应用。(图4a)使用半月板(膝关节中具有力学敏感性的纤维软骨组织)祖细胞作为实例来验证生物反应器的应用。通过番红o染色(一种将软骨ecm蛋白聚糖染成红色的组织学染色方法)评估细胞在具有和没有拉伸载荷的情况下的细胞外基质(ecm)分泌。(图4b)ecm分泌的面积分数表明，与静态对照组相比，ecm分泌在拉伸载荷下显著增加。结果证明了所设计的3d拉伸训练生物反应器在生物医学研发中的实际应用。
13.图5示出了如何在包封于水凝胶中的细胞上施加周期性拉伸应变——通过以下步骤的装置设计原理：a)将细胞接种在水凝胶(gelma)中，并且通过uv交联将磁珠固定在凝胶臂自由端；b)磁珠朝向磁场方向拉伸细胞-水凝胶臂；c)通过去除磁场来回复细胞-水凝胶构建体使其免于伸展。
14.图6示出了使用生物反应器向基于水凝胶的构建体提供精确可控的周期性拉伸负荷。
15.图7a到图7c示出了周期性施加拉力如何加速水凝胶降解。(图7a)在第0天、第5天、第10天和第15天具有或没有拉力载荷的情况下的细胞-水凝胶构建体的组织结构。用天狼猩红对gelma水凝胶进行染色；标尺＝100μm。(图7b)根据天狼猩红染色(粗纤维为红色，细纤维为粉红色)估计在具有和没有拉伸载荷情况下细胞-gelma构建体的孔隙率，表明周期性拉伸应变显著增强了gelma水凝胶降解(6个凝胶构建体/组，从每个构建体采集3个高倍视野以量化，*p《0.05)。(图7c)在具有和没有拉伸载荷的情况下细胞-gelma构建体的孔径和分布的定量测量，其表示gelma降解情况。
16.图8a到图8b示出了细胞力学反应和细胞衰老情况。(图8a)通过流式细胞术测定细胞表面标志物，指明在拉伸载荷下细胞分化(cd90/73/105)和力学感知(cd29/49e/44)增加(代表性数据，实验重复》3次)。(图8b)sa-β-gal染色结果示出了在15天的周期性拉伸载荷后衰老细胞较少。
17.图9a到图9b示出了生物反应器优化和细胞活力。(图9a)通过拉伸测试获得的杨氏模量对gelma浓度进行优化(n＝3-6，平均
±
sd)：具有60％取代度的10％gelma是最稳定的软水凝胶。(图9b)分离人半月板祖细胞并通过集落形成方法从汇集的半月板细胞(n＝9，3批次)中筛选所述人半月板祖细胞，并且通过结晶紫染色观察集落形成单元(cfu)。
具体实施方式
18.定义
19.本文提供的范围被理解为所述范围内所有值的简写。例如，1到20的范围被理解为包含来自下组的任何数、数的组合或子范围，所述组由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，以及前述整数之间的所有中间的十进制值，例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别设想了从所述范围的任一终点延伸的“嵌套式子范围”。例如，1到50的示例性范围的嵌套式子范围可以包括一个方向上的1到10、1到20、1到30以及1到40，或另一个方向上的50到40、50到30、50到20以及50到10。
20.如本文所使用的，“减少”意指负变化，而“增加”意指正变化，其中负变化或正变化至少为0.001％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
21.与“包含(including)”或“含有(containing)”同义的过渡性术语“包括(comprising)”是包含性的或开放性的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。相比之下，过渡性短语“由
……
组成”不包括权利要求中未指定的任何元素、步骤、或成分。过渡性短语“基本上由
……
组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤“以及不会实质上影响所要求保护的发明的一个或多个基础和新颖特性的那些材料或步骤”。术语“包括”的使用设想了“由”或“基本上由”一个或多个所述组件“组成”的其它实施例。
22.除非明确规定或根据上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“或”被理解为包含性的。除非明确规定或根据上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“一个(a)”、“和(and)”和“所述(the)”被理解为单数的或复数的。
23.除非明确规定或根据上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。“约”可以被理解为在规定的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或
0.01％之内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
24.本发明提供了向水凝胶、细胞和/或组织施加物理力的易于操作的系统和方法。所得细胞和/或组织可以用于分析以限定构型包封在水凝胶中的细胞的生物化学和生物力学反应。本主题的细胞培养拉伸装置和方法可以用于向细胞或组织外植体施加拉伸应变，所述细胞或组织外植体直接包封在水凝胶中或接种在嵌入水凝胶的支架上，使得能够分析细胞对所施加的拉伸应变和界面应力的反应。在存在或不存在各种化学介质的情况下，设计的新颖的力学加载系统允许连续评估多种结果度量，如细胞活力、增殖和代谢活性、细胞形态、细胞外基质活性和细胞信号传导。所述装置能够在基于水凝胶的3d环境中培养细胞和/或组织，并以无接触方式施加力学载荷。本主题的装置和方法在许多领域具有广泛的应用，包含干细胞、基因组学、组织工程、药理学、再生医学和生物技术。本主题的装置可以用作分析医学中正常细胞和病理细胞的力学敏感性反应的工具。
25.拉伸装置和使用方法
26.在本发明的某些实施例中，提供了一种基于水凝胶的拉伸装置，所述拉伸装置可以包含：(i)导轨滑块，所述导轨滑块具有平台和控制器；(ii)磁体，所述磁体固定在导轨滑块上；(iii)模具，所述模具用于构建具有嵌入的磁珠和所述水凝胶的水凝胶构建体；和/或(iiii)放置于平台上的细胞/组织培养皿，其中含有于生长培养基中培养的包封细胞和/或组织的水凝胶构建体。结合各种水凝胶，拉伸装置在可控距离和拉伸范围内为水凝胶提供周期性拉伸应变。在某些实施例中，拉伸装置在可控距离和拉伸范围内为水凝胶包封的细胞提供周期性拉伸应变。
27.在某些实施例中，本发明提供了一种拉伸系统，所述拉伸系统包括具有嵌入的磁珠的水凝胶构建体，其中水凝胶被锚定到锚定点。锚定点可以是细胞培养皿或任何其它类型的容器。拉伸系统可以进一步包括磁体固定的电动导轨滑块(mrs)控制器、可以固持锚定在细胞和/或组织培养容器中的水凝胶构建体的导轨滑块，和/或用于使水凝胶成形的模具。构建体臂可以在磁体-磁珠相互作用提供的磁场下伸长。对于包封在水凝胶中的细胞和/或组织，臂的伸长会使所包封的细胞和/或组织发生形变。
28.根据实施例，本发明提供了一种基于水凝胶的拉伸系统，所述拉伸系统包括具有固定磁体的导轨滑块和对应的控制器。导轨滑块可以是任何允许固定磁体(包含电磁体)与嵌入在水凝胶中的磁性颗粒之间的重复相互作用的替代性装置，包含但不限于轴承滑块、滚轴滑块、转盘、旋转托盘、圆转盘、输送机(例如，带式输送机、链式输送机)、轮子和/或滚轴。在优选实施例中，滑动机制有助于驱动往返运动。在某些实施例中，导轨滑块或替代装置可以具备固持水凝胶和/或细胞/组织培养物的平台。
29.在某些实施例中，导轨滑块或替代装置的运动可以由控制器和电机来调节。控制器允许编辑基于水凝胶的构建体的运动的参数，如控制固持有基于水凝胶的构建体的培养皿的平台沿导轨滑块的运动。控制器可以具有至少一个用于精确显示平台移动距离的屏幕，以及用于程序编辑和精确控制平台的运动的按钮。控制器可以替代性地通过遥控器、智能电话应用和其它相关技术远程调节。在精确控制下，平台可以沿滚轴朝向和远离固定的至少一个磁体周期性地移动。以这种方式，固定磁体向嵌入有磁珠的构建体提供吸引力，从而允许以受控的速度和移动距离向基于水凝胶的构建体施加周期性拉伸应变。替代性地，导轨滑块可以手动操作，而不使用控制器和/或电机。
30.在某些实施例中，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个磁体可以固定在导轨滑块处以提供磁场。磁体可以是常规(永久)磁体或电磁体。磁体可以与嵌入在至少一种水凝胶中的磁珠相互作用，从而导致至少一种水凝胶的周期性伸长，所述水凝胶可以锚定到至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个锚定点。在某些实施例中，磁感应在约0.1特斯拉到约10t、约0.2t到约1.5t、约0.29t到约0.9t、约0.3t或约0.29t的范围内。在其它实施例中，所提供的磁感应水平可以向水凝胶施加既定的拉伸应变。
31.在某些实施例中，拉伸应变可以为约0.005mpa到约10mpa或约0.01mpa到约20mpa。此外，拉伸应变可以为约0.1mpa到约500mpa、约10mpa到约350mpa，或约100mpa到约250mpa。替代性地，拉伸应变可以通过水凝胶、细胞和/或组织的变形来确定。水凝胶、细胞和/或组织的形变百分比可以为0.01％到约20％、约1％到约10％，或约2％到约7.5％形变。在某些实施例中，固定的钕磁体可以用来提供磁场(约0.29t)以吸引嵌入在水凝胶构建体中的磁珠，并对构建体施加周期性拉伸载荷。为了精确控制磁力驱动的水凝胶伸长，可以调整磁珠的体积、锚定点与磁体之间的距离以及磁场强度。在某些实施例中，可以将约5mg到约10mg，优选直径为约50μm到约100μm的磁珠添加到水凝胶的臂中。
32.拉伸系统可以进一步包括包封在水凝胶臂中的细胞和/或组织。包封的细胞和/或组织包含但不限于软骨细胞、肌腱细胞、间充质干细胞、干细胞、骨髓衍生干细胞(bmsc)、半月板祖细胞(mpc)、腱干细胞、干细胞衍生细胞、体细胞、癌细胞、肌肉细胞、神经细胞、肠上皮细胞、类器官和许多其它力学敏感性和反应性细胞以及组织外植体中的一种或多种细胞类型。结合包封的细胞，无接触拉伸系统可以用于研究细胞代谢、细胞分化、功能和细胞分泌。
33.用于水凝胶成形的模具的材料可以包含但不限于硅、玻璃、陶瓷、弹性体，所述弹性体包含但不限于丙烯酸、热塑性聚合物，所述热塑性聚合物包含聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(二甲基硅氧烷)(pdms)、聚苯乙烯、聚氨酯、热固性聚酯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物(cop)、聚(甲基戊二酰亚胺)(pgm1)、酚醛树脂、环氧基聚合物、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)和其它聚合物材料。
34.根据一个方面，本发明提供了包括用于使水凝胶成形的模具的系统；所得水凝胶可以具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个锚定点。锚定点可以是细胞和/或组织培养皿或任何其它类型的容器。如模具所塑形的，水凝胶构建体可以具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个臂。在某些实施例中，细胞和/或组织可以包封在从水凝胶的基底延伸的一个或多个臂中。细胞和/或组织可以在水凝胶中培养，具体表现为在从水凝胶的基底延伸的臂中培养，并且可以与培养皿中的生长培养基进行代谢交换。
35.水凝胶可以在上述模具内固化，或者可以成批固化，并且可以根据需要从模具中分离大批固化块，以用于培养。可以通过任何自由基引发系统进行聚合，包含任何热能系统、氧化还原系统或光化学系统。在优选实施例中，水凝胶是可光交联的甲基丙烯酸酯化明胶。
36.细胞培养皿或任何其它类型的细胞培养容器可以包含但不限于烧瓶、烧杯和试管。细胞培养容器可以是硅、玻璃、陶瓷、弹性体，所述弹性体包含但不限于丙烯酸、热塑性
聚合物，所述热塑性聚合物包含聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(二甲基硅氧烷)(pdms)、聚苯乙烯、聚氨酯、热固性聚酯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物(cop)、聚(甲基戊二酰亚胺)(pgm1)、酚醛树脂、环氧基聚合物、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)和其它聚合材料。具体地，所述装置可以被配置成包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个由玻璃或聚苯乙烯制成的10cm细胞培养皮氏培养皿。
37.根据这一方面的实施例可以包含以下特征中的一个或多个特征。基于水凝胶的拉伸系统可以进一步包括嵌入在至少一个水凝胶可伸展臂中的至少一个额外支架。结合至少一个细胞接种支架，基于水凝胶的拉伸系统可以进一步用于研究细胞上的拉伸应变和界面处的应力。
38.在某些实施例中，水凝胶构建体可以经受一系列周期性拉伸载荷。周期性拉伸载荷可以在约0℃到约100℃、约5℃到约75℃、约10℃到约50℃、约15℃到约30℃、约18℃到约22℃、室温的温度下以至少约0.01hz、约0.1hz、约0.25hz、约0.5hz、约1hz、约1.5hz、约2hz、约2.5hz、约5hz、约10hz、约25hz、约50hz或更高的频率每天施加至少约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约8小时、约12小时、约16小时、约20小时、约23小时或高达24小时。周期性拉伸载荷可以以范围为约0.01hz到约50hz、约0.1hz到约25hz、约0.25hz到约10hz、约0.5hz到约5hz或约0.5hz到约2hz的频率每天施加约1分钟到约24小时、约2分钟到约20小时、约10分钟到约12小时、约30分钟到约8小时或约1小时到约3小时的范围。在某些实施例中，周期性拉伸载荷可以在以下时间内发生：一天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约15天、约21天、约28天、约35天、约42天、约49天、约56天、约63天、约70天、约77天、约84天、约91天、约98天、约105天、约110天、约112天、约119天、约126天、约133天、约140天、约147天、约154天或更长时间。在某些实施例中，周期性拉伸载荷可以在约1天到约6个月、2天到约5个月、3天到约4个月、4天到约3个月、5天到约2个月或约6天到约1个月的范围内发生。
39.在某些实施例中，所有组织/细胞(静态和拉伸载荷)都可以保持在成软骨条件培养基中置于培养箱(37℃，5％co2)中进行培养，并且可以在第0天、第5天、第10天和第15天被收集以供分析；替代性地，可以每天两次、每天、每隔一天、每三天或每四天收集样品。可以通过活/死细胞染色和/或流式细胞术以本领域已知的方法来评估经过或未经拉伸处理的包封细胞和/或组织的细胞活力。可以分别通过流式细胞术和sa-β-gal染色来评估细胞分化和衰老。为了分离用于染色或流式细胞术的细胞，可以用酶和/或试剂将细胞从水凝胶中分离出来。在某些实施例中，胶原酶可以在培养后从甲基丙烯酸酯化明胶(gelma)水凝胶中释放细胞，包含i型、ii型和iv型胶原酶。在某些实施例中，透明质酸酶可以在培养后从甲基丙烯酸酯化透明质酸(hama)水凝胶中释放细胞。在某些实施例中，柠檬酸钠溶液(优选浓度为ph 6.8下55mm)可以在长期培养后从基于藻酸盐的水凝胶中释放细胞。
40.水凝胶
41.水凝胶(亲水性聚合物网络)具有广泛的力学性质，并且已广泛应用于生物医学领域。在某些实施例中，如甲基丙烯酸酯化明胶(gelma)水凝胶、甲基丙烯酸酯化透明质酸(hama)、藻酸盐和聚(乙二醇)-二丙烯酸酯(pegda)水凝胶等可光交联的水凝胶由于其优越的细胞相容性、低免疫反应性和可调的物理特性而可以用于辅助细胞生长和组织形成的细胞外基质(ecm)模拟软支架，或用作3d打印和组织工程的生物油墨。水凝胶可以包含可以交
联的天然和/或合成聚合物大分子单体。可以改变连接大分子单体的交联的数量或百分比来控制水凝胶的力学性质、化学性质、溶胀比和降解特性。体内交联的降解使得水凝胶更容易生物降解并用于体内应用。另外，水凝胶可以用作用于结合和/或附着各种药剂、组织和/或细胞的基质。水凝胶可以是可注射的和/或可植入的，并且可以呈膜、海绵、凝胶、固体支架、纺成纤维、编织或非编织网、纳米粒子、微粒或任何其它期望构型的形式。水凝胶可以为多肽、多糖和/或合成物的一种或多种化合物的组合物。化合物的实例进一步包含丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯(hema)、琼脂糖、甲基纤维素、透明质酸、甲基丙烯酸酯化明胶、环糊精和/或藻酸盐。细胞-水凝胶构建体可以是体外3d组织培养基本单元，其可以通过将生物活性基序与水凝胶结合或通过向组织培养基添加生物活性分子来用组织特异性生物活性进一步改性。此外，力学载荷可以通过水凝胶的形变传输到包封的细胞，并且这种轻微的力学负荷更接近天然组织物理性质；因此，水凝胶还可以用作媒介物和支架在细胞治疗中保护和递送细胞。考虑到力学活性环境，如gelma等细胞相容性软水凝胶，因其既有的力学支持性及可生物降解特性，能够以相应的生物降解节律帮助组织生长。在某些实施例中，水凝胶本身可以通过水凝胶的形变经受力学载荷，而无需嵌入组织细胞。在优选实施例中，可以使用甲基丙烯酰化明胶(gelma)、胶原和聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(meha)、甲基丙烯酸酯化硫酸软骨素、甲基丙烯酰胺壳聚糖(mac)、甲基丙烯酸酯化藻酸盐、甲基丙烯酸酯和赖氨酸官能化葡聚糖(dex-ma-ly)、甲基丙烯酸酯化结冷胶、甲基丙烯酸酯化乙二醇壳聚糖(megc)、聚(环氧乙烷)(peo)和/或聚(乙二醇)(peg)来构建水凝胶。
42.在某些实施例中，水凝胶和力学加载方法有若干关键的、可修改的参数，如组成和浓度(例如，gelma-60，10％，图9a)、细胞接种密度(例如，5
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106细胞/毫升，图4a到图4b)、凝胶伸长的有效范围(例如，10％-45％的形变，图3a)和周期性加载时间(1小时/天；0、5、10、15天；图7a到图7c、图4a到图4b、图8a到图8b)和力学施加频率(0.5-1hz；图7a到图7c、图4a到图4b、图8a到图8b)。在某些实施例中，可以用不同程度的取代和浓度来制备水凝胶，例如gelma-30/60/90；5％、7.5％、10％、12.5％、15％。在某些实施例中，如果水凝胶是可光交联的水凝胶，则可以向水凝胶中添加光引发剂，例如酰基膦酸锂。光引发剂可以以0.25％w/v溶解在pbs中并在60℃水浴中温育30分钟，并且通过0.22μm过滤器过滤。
43.细胞包封和细胞-水凝胶构建体的建立
44.在某些实施例中，细胞-水凝胶3d构建体可以在设计的模具中构建(图1a到图1c)。简而言之，可以使用例如胰蛋白酶(0.25％edta)孵育将细胞从培养瓶中分离，并以约0.1
×
106细胞/毫升到约25
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106细胞/毫升、1
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106细胞/毫升到约10
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106细胞/毫升或约3
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106细胞/毫升到约6
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106细胞/毫升的细胞浓度重新悬浮在水凝胶溶液(例如，gelma/lap溶液)中，并且在通过软光刻工艺制成的模具中用365nm uv光交联25-30秒。产生的水凝胶构建体可以具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个长
×
宽
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高可选择尺寸为2cm
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7mm
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6mm的锚定点和至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个可选择尺寸为约10mm
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3mm
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1.5mm(长
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宽
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高)的臂；可以将直径为约50μm到约500μm、约50μm到约300μm或约50μm到约100μm的5-10mg磁珠放置在每个臂的末端。在某些实施例中，如果水凝胶构建体包封有细胞和/或组织，则水凝胶构建体可以在基础细胞培养基或成软骨条件培养基中培养，以诱导ecm沉积。
45.对水凝胶构建体周期性地施加力
46.在某些实施例中，除了使用本主题的方法和系统模拟在体内细胞和/或组织上的力之外，本主题的方法和系统还可以用于确定水凝胶疲劳和形变性能。水凝胶可以放置到本发明的系统中，并且可以使用高速相机来记录水凝胶在周期性负荷下之前的松弛和之后的伸长和形变。在某些实施例中，一部分水凝胶疲劳性能可以通过杨氏模量的逐渐变化、改变的凝胶伸长和松弛位点来反映。
47.在一些实施例中，水凝胶在周期性加载之前和之后的张力测试将使用流变仪(kinexus系统，型号：knx2110，马尔文仪器有限公司(malvern instruments ltd.)来执行，所述流变仪用平行力学夹具改装。拉伸力学测试可以以1毫米/秒的延伸速度进行以记录张力，并且可以评估和计算杨氏模量。可进行其它水凝胶降解相关测定，如质量损失(以湿重计)和形态变化。可以通过向水凝胶中引入天然来源的组合物(例如，透明质酸(ha)、硫酸软骨素(cs)和组织源性ecm)来对水凝胶进行修饰。在一些实施例中，可以将纤维蛋白或其它可溶性肌腱衍生去细胞ecm添加到水凝胶中。
48.在某些实施例中，可以使用荧光标记的水凝胶来测定水凝胶构建体(具有或没有细胞/组织；经或未经周期性拉伸负荷)的降解速率。可以通过荧光成像来观察构建体，并且可以每天收集基础培养基并用荧光酶标仪对培养基中荧光释放物进行评估。
49.在某些实施例中，将使用组织学检测来测试在具有或没有周期性拉伸载荷的情况下水凝胶的降解。可以将水凝胶构建体(具有或没有细胞/组织)固定，并嵌入在最佳切割温度化合物中，并以约10μm的厚度冷冻切片。
50.材料和方法
51.人半月板祖细胞的分离和鉴定
52.从经受全膝关节置换术的患者中获得人类半月板标本(共9例供体)。通过胶原酶i孵育分离人半月板细胞，将其进一步扩增并以低密度(10细胞/平方厘米)接种以形成集落。集落筛选后的细胞被指定为半月板祖细胞，并且1-4代用于所有实验。使用结晶紫染色对形成的集落数进行计数，并使用流式细胞术检测干细胞相关表面标志物的表达来鉴定半月板祖细胞。
53.力学载荷和细胞力学生物反应
54.在室温下以0.5hz的频率1小时/天施加周期性拉伸载荷。所有样本(静态和拉力载荷)都保持在基础培养基或成软骨条件培养基中并置于培养箱(37℃，5％co2)中，并在第0天、第5天、第10天和第15天被收集以供分析。通过活/死细胞染色以及流式细胞术来评估经过/未经拉伸处理的包封细胞的细胞活力。分别通过流式细胞术和sa-β-gal染色来评估细胞分化和衰老。
55.分析水凝胶降解和组织特异性ecm重建
56.水凝胶降解和/或组织新生成ecm可通过组织学染色方法进行评估，如天狼猩红(psr)染色用于呈现不同时间点的水凝胶的结构，以及使用例如红番红o染色对软骨ecm蛋白聚糖进行染色以量化随时间推移的细胞周围ecm的沉积。另外，荧光标记的水凝胶和分子追踪工具如荧光非典型氨基酸标记(funcat)染色等可以用于评估水凝胶降解和组织新生成ecm。荧光标签包含例如alexa488；藻红蛋白(pe)；percp-cy5.5；pe-cy7；(别藻蓝蛋白)apc；罗丹明和其衍生物(例如，tritc、tamra、罗丹明b、罗丹明6g、rhbitc、二氢罗丹
明、磺基罗丹明、四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺)；荧光素和其衍生物(例如，fitc、荧光素-5-马来酰亚胺、5-iaf、6-tet、6-fam)；香豆素和其衍生物(例如，7-羟基-4-甲基香豆素、3-氰基-7-羟基香豆素、amc)；和/或绿色荧光蛋白(gfp)。
57.细胞类型、收集和表征
58.已经从人半月板中分离了三批次组织特异性祖细胞(图9b)并将其储存在液氮罐中(根据已建立的标准操作程序从关节置换术中收集和分离)，以研究生物反应器在3d培养的半月板干/祖细胞上的应用。祖细胞是基于其自我更新能力通过集落形成能力所选择。对于半月板祖细胞，来自年龄和性别匹配的供体的细胞被混合成三批次以消除独立样本间的供体差异(详细信息在图9b中列出)。混合后培养1代，将每个批次的分离细胞以低密度接种在t175细胞培养瓶或10cm细胞培养皿(10细胞/平方厘米)上以形成集落。初始接种后十四天，用1％结晶紫溶液对在10cm培养皿上形成的集落进行染色并计数，形成的集落数被计为cfu。能够形成集落细胞被筛选、收集并定义为半月板干/祖细胞，并且传代2-6次用于所有后续实验。对于来自肌腱和其它组织的祖细胞，将执行多集落形成筛选的类似汇集策略，并且将细胞通过cfu和流式细胞术进行鉴定。
59.在本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，在其不与本说明书中的明确阐述不一致的程度上，以全文引用的方式并入本文中，包含所有附图和表格。
60.以下是展示实践本发明的程序的实例。这些实例不应被理解为限制性的。除非另有说明，否则所有百分比均以重量计并且所有溶剂混合物比例均以体积计。
61.实例1——3d拉伸训练生物反应器的水凝胶构建体的制造
62.如图1a所示，细胞培养拉伸装置的一个实施例包含pdms模具1，凹槽通过软光刻方法制造的2.5cm
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2cm
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1cm立方体。凹槽形成了用于使水凝胶成形的凹陷空间，所述凹陷空间包括两个部分：一个尺寸为2cm
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0.7cm
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0.6cm的锚定点2，以及每个臂的尺寸为10mm
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3mm
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1.5mm的三个细胞加载臂3。图1b示出了经由pdms模具1成形的弹性水凝胶构建体4。用于构建体4的水凝胶生物材料应该具有可调节的刚度、可控制的固化，并允许细胞增殖和扩散。合适的水凝胶的实例包含但不限于甲基丙烯酰化明胶(gelma)、胶原和聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)。在成形的基于水凝胶的构建体的锚定点2中存在用于锚定的圆柱管5(直径2mm，长度2cm)，并且直径为50-100μm的5-10mg磁珠6放置于细胞加载臂3的自由端。为了建立基于水凝胶的构建体，首先将圆柱管5固定在pdms模具1中的锚定点2的凹陷空间中，并且将磁珠6定位在每个细胞加载臂3中凹陷空间的自由端处。然后，使用流体水凝胶填充pdms模具1中的锚定点2的凹陷空间并将磁珠6固定在适当位置。流体水凝胶-细胞混合物7填充细胞加载臂3中剩余的凹陷空间。固化后，从pdms模具1中取出成形的嵌入/未嵌入细胞的水凝胶构建体4。
63.实例2——3d细胞拉伸训练生物反应器的加载装置
64.参考图2，细胞培养拉伸加载装置8包括电源9、控制器10、导轨滑块11、平台12和至少一个固定在导轨滑块11左侧的磁体13。控制器10允许对平台11的周期性运动的参数进行程序编辑，并且具有一个用于精确显示平台的移动距离的屏幕14，以及用于对平台12的运动进行程序编辑和精确控制的五个按钮15-19。在精确控制下，平台12沿滚轴20朝向/远离固定的至少一个磁体13周期性地移动。以这种方式，固定磁体13向嵌入有磁珠的构建体4提供吸引力，从而允许以可控的速度和移动距离向基于水凝胶的构建体4施加周期性拉伸应
变。包含3d细胞-水凝胶构建体4的细胞培养皿可以固持在平台12上用于无接触周期性拉伸应变。
65.因此，本发明提供了一种制造无接触细胞拉伸装置的方法，所述无接触细胞拉伸装置可以包含以下三个基础组件：一个或多个用于使水凝胶成形的pdms模具1、一个或多个用于细胞培养和应变接收的嵌入有磁珠的水凝胶构建体4，以及一个用于向水凝胶构建体4施加拉伸应变的细胞拉伸加载装置8。通过进一步结合包封在加载臂3中的细胞，所得组装装置可以提供(a)3d细胞培养环境、(b)用于远程施加拉伸应变的无接触方式，以及(c)用于细胞培养的周期性拉伸应变。另外，根据一些实施例，3d拉伸装置可以用于研究嵌入在基于水凝胶的构建体4加载臂3中的支架的界面应力。
66.实例3——3d细胞拉伸训练生物反应器的优化、生物相容性和适用性
67.半月板撕裂在临床实践中经常遇到，并且虽然部分或完全半月板切除术是一种常见的治疗选项，但造成的半月板损失是骨关节炎发展的危险因素。半月板撕裂的无缝愈合成为研究努力实现的方向，这主要涉及生物相容性水凝胶和组织特异性干细胞/祖细胞的使用。作为承重组织，体内半月板修复的动力学受生物学和生物力学因素的共同控制。为了模拟真实的承重半月板，动态力学载荷是必不可少的，其可以模拟半月板的力学微环境，调节预选生长因子的释放特性，并促进半月板愈合过程。
68.在体外分离、扩增和表征鉴定力学敏感性组织祖细胞-人半月板干细胞/祖细胞(hmespc)，并将其包封在甲基丙烯酰化明胶(gelma)水凝胶中。参考图3a到图4b，以gelma和半月板祖细胞为例，优化水凝胶构建体的伸长参数并评估3d拉伸训练生物反应器的生物相容性。如图3a所示，在加载装置8中的磁体13提供的磁场下，基于gelma的构建体可以被拉长高达45％。图3b到图3c通过活/死细胞染色以及流式细胞术证明了水凝胶构建体的良好生物相容性。与静态对照组相比，细胞活力在周期性拉伸载荷下得以维持。此外，为了验证3d拉伸训练生物反应器的应用，通过番红o染色来评估ecm分泌和沉积并计算面积分数，分别如图4a和图4b所示。结果证明与静态对照组相比，ecm分泌在拉伸载荷下显著增加。
69.为了模拟半月板在体外愈合的力学环境，通过自制的3d生物反应器对水凝胶包封的细胞施加可控的拉伸应变，使得hmespc的3d细胞培养超过15天，其中细胞存活率为94％。我们发现，分离后的hmespc显示出间充质干细胞特征，并且可控的拉伸应变加载增强了gelma包封的hmespc的分化，及细胞外基质(ecm)的分泌和沉积。此外，与静态对照组相比，拉伸处理后观察到较少的细胞衰老。这些发现表明，力学加载有助于半月板衍生的祖细胞分化，抑制细胞衰老，并且是解读细胞和组织水平中生物力学的有前途的先进平台。
70.实例4——解读周期性拉伸负荷如何调节半月板祖细胞行为
71.使用本主题的方法和系统，可以执行独特的实验，并收集了一些结果来解读周期性拉伸负荷如何调节干细胞/祖细胞。例如，已经建立了在15天的周期性拉伸加载后(即，用胶原酶-消化gelma水凝胶的酶)从gelma水凝胶培养物中释放和收集细胞的方法和方案。释放的细胞可以立即通过流式细胞术进行分析，并且已经发现，就干细胞相关的细胞表面标志物(例如，cd90、cd73和cd105)、ecm受体(cd44，透明质酸受体)以及力学传感器配体整合素β1(intb1，也称为cd29)和整合素α5(inta5，也称为cd49e)(图8a)而言，3d周期性拉伸加载改变了包封的细胞表面标志物表达。另外，可以检测从水凝胶中释放的细胞的细胞衰老，并且发现了在周期性拉伸加载后衰老的细胞较少(图8b)。
72.应了解本文所述的实例和实施例仅出于说明的目的，并且将对本领域技术人员建议鉴于此的各种修改或变化并且所述修改或变化将包括在本技术案的精神和范围内及所附权利要求的范围内。另外，本文公开的任何发明或其实施例的任何元素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其它元素或限制(单独地或以任何组合形式)或任何其它发明或其实施例组合，并且设想所有此类组合都在本发明的范围内，而不限于此。