一种光激活I型光敏剂及其制备方法和应用

本发明属于生物成像治疗材料技术领域，具体涉及一种光激活i型光敏剂及其制备方法和应用。

背景技术：

荧光成像介导的肿瘤光动力治疗(fpdt)具有药物实时示踪、时空分辨率高以及无创治疗等优势，使得其在癌症精准治疗中具有重要的地位。pdt中起主要作用的是光生活性氧物种(ros)，其生成机制为光敏剂(ps)受光激发后形成激发单线态(¹ps*)，然后通过isc路径形成激发三线态(³ps*)，³ps*以能量传递形式给单线态氧而形成了ii型单线态氧(³o2)，以电子转移方式形成了i型ros(o2^-·，ho·，h2o2等)。这两个过程是竞争关系且以能量传递方式占主导地位。然而，在实际的肿瘤治疗当中，由于肿瘤细胞的快速分化，导致肿瘤微环境中氧含量低(乏氧环境)，而ii型¹o2的形成需要不断的消耗氧气，此消彼长，导致了ii型ros在试剂的肿瘤治疗应用中受限。尽管有相继推出了一系列改性方案(肿瘤输送o2，催化剂载体原位生成o2等)，但这些外来手段难以控制氧含量导致了副作用(氧过高导致的癫痫、催化剂生物降解难、毒性大等)。相比较于³o2，i型自由基ros具有更高的光毒性和极低的氧依赖性，是一种pdt效率更高的材料。

然而，正如前面所说，由于两个过程的竞争关系，导致i型光敏剂难以设计、有机材料体系十分匮乏。大多数的i型光敏剂主要以无机材料为主(tio2和zno)，但存在激发光源为紫外光以及生物降解性等问题，在生物应用中具有局限性；目前报道的纯有机体系主要是卟啉和罗丹明等衍生物，但这两种材料都是典型的acq体系。aie的发光机制是抑制非辐射跃迁通道以促进辐射跃迁和隙间窜越通道，从而可以同步提高荧光效率和激发三线态转化效率，非常有利于设计兼具聚集发光和ros的材料体系。因此基于aie思想去设计i型光敏剂是解决以上问题的关键所在。

四苯乙烯(tpe)除了具有典型的aie特性外，还因其在溶液中光化学反应实现光激活而得到广泛研究，其中顺二苯乙烯可通过在空气中紫外线辐射下的光环化反应转变为二氢菲。此后，人们致力于提高tpe及其衍生物的光环化效率，例如引入树突支链，引入给电子醚基团，将阳离子引入芳族体系等。为开发更多功能性光活化材料提供了清晰的设计思路。此外，光化学反应中涉及的自由基过程的最新研究进展使我们对此光化学反应过程中电子流向有了更好的了解，极大的拓展了其应用范围。近年来，研究者提出了一种可行的分子工程方法，通过富电子阴离子-π⁺aiegens强ict实现激发态pss的有效电子捕获，从而增加自由基ros的转化，来设计i型光敏剂的产生。然而，ⅰ型光敏剂的结构特征尚不明确，其结构-功能关系库亟待补充。

技术实现要素：

基于以上现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种光激活i型光敏剂。

本发明另一目的在于提供上述提供一种光激活i型光敏剂的制备方法。

本发明再一目的在于提供上述一种光激活i型光敏剂在生物成像、前期诊断和临床医学治疗等领域中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种光激活i型光敏剂，具有式i结构：

其中，r1为氢、羟基、胺基、烷基链或取代烷基链；r2为烷基链或取代烷基链，所述取代烷基链的末端氢被羟基、胺基取代；x为阴离子。

优选的，所述阴离子为bf4^-、pf6^-、i^-、br^-、cl^-或hso3^-。

优选的，所述烷基链为直链或支链烷基。

优选的，所述烷基链为乙基、丙基、丁基、异丁基或叔丁基。

优选的，所述光激活i型光敏剂通过光化学反应实现光激活。

上述光激活i型光敏剂的制备方法，包括以下步骤：

以4,4’-二r1基二苯甲酮，四溴化碳和三苯基磷为原料，通过corey-fuchs反应得到1,1-双(4-r1基苯基)-2,2-二溴乙烯，然后与对甲酰基苯硼酸进行suzuki反应，得到的四苯乙烯类醛基化合物，再与对甲氧基内炔、r2nh2在催化剂下进行c-h活化一锅反应得到所述光激活i型光敏剂。

优选的，利用光化学反应过程中的电子转移过程诱导i型活性氧的产生，提供了一种i型光敏剂的制备策略。

优选的，suzuki反应所用的溶剂体系为常用的溶剂体系，优选为甲苯/水/乙醇；四氢呋喃/水等，反应温度为60℃～150℃。溶剂用量及催化剂用量为常规的suzuki反应用量即可。

优选的，所述c-h活化一锅反应所用催化剂为二氯(五甲基环戊二烯基)合铑(iii)二聚体、无水醋酸铜、四氟硼酸银。

上述光激活i型光敏剂在细胞凋亡监测中的应用。

优选的，所述细胞凋亡的监测，具体为：在细胞培养基中加入所述的光激活i型光敏剂，然后用白光光源光照后在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察。

优选的，光诱导所述含光激活i型光敏剂产生活性氧触发细胞凋亡，此过程中荧光强度的变化与细胞状态变化一一对应。

上述光激活i型光敏剂在对细胞死亡后产生的凋亡小体的示踪以及生物诊断中的应用。

上述光激活i型光敏剂在微生物成像以及杀伤中的应用。

优选的，所述微生物成像中的微生物为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌，所述微生物杀伤能力归结于其暗毒性和光毒性的协同作用。

优选的，所述微生物成像，具体为：在微生物培养基中加入所述的光激活i型光敏剂，在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察。

优选的，所述微生物杀伤，具体为：将所述的不同浓度的含光激活i型光敏剂材料加入微生物培养皿上，经过一段时间培养后，在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察。

本发明通过在四苯乙烯上接上引入异喹啉盐阳离子以及甲氧基，从而提高四苯乙烯的光致关环效率，实现很好的光化学主导的光激活现象。结合i型活性氧产生的机理(电子转移)，可以利用光化学过程中的电子转移过程实现良好的i型活性氧产生能力。由于其光激活特性以及活性氧产生能力，其可以通过荧光强度的改变实现对光动力治疗过程中的细胞凋亡过程进行自我监控。此外，由于其离子特性，此材料与革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌均具有良好的结合与杀伤能力。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明的光激活i型光敏剂是通过光化学反应的方法实现光激活，利用此反应过程的电子转移可诱导i型活性氧的产生；

(2)本发明的化合物可以作为一种光驱动的细胞凋亡引发剂，可触发细胞凋亡并通过荧光强度的变化实现对细胞凋亡过程中细胞状态的监测；

(3)本发明的光激活i型光敏剂，具有良好的活性氧产生能力，可以应用于光动力治疗。

(4)本发明的光激活i型光敏剂，具有良好细菌结合能力特性，可以广泛应用于在细菌成像与抗菌等领域。

附图说明

图1为实施例1光激活i型光敏剂在365nmuv灯下光照不同时间后的荧光强度变化曲线图。

图2为实施例1光激活i型光敏剂在在365nmuv灯下光照不同时间后的核磁变化谱图。

图3a为实施例1光激活i型光敏剂在与dcfh作用后的荧光变化曲线图。

图3b为实施例1光激活i型光敏剂在与abda作用后的吸收变化曲线图。

图3c为实施例1光激活i型光敏剂在与hpf作用后的荧光变化曲线图。

图3d为实施例1光激活i型光敏剂在与bmpo作用后的epr图。

图4为实施例1光激活i型光敏剂在细胞中光照诱导细胞凋亡后不同时间段的荧光成像图。

图5为实施例1光激活i型光敏剂与细菌染色对比图。

图6为实施例1光激活i型光敏剂对金黄色葡萄球菌的平板抗菌实验统计结果图。

图7为实施例1光激活i型光敏剂对大肠杆菌的平板抗菌实验统计结果图。

图8为实施例1光激活i型光敏剂对白色念珠菌的平板抗菌实验统计结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式和保护范围不限于此。下列实施例中使用的试剂均可从商业渠道获得。

实施例1

含光激活i型光敏剂(tidbo)的制备：

合成路线如下：

(1)将二苯甲酮(1.82g，10mmol)，四溴化碳(6.63g，20mmol)和三苯膦(10.5g，40mmol)混合物抽真空充n2三次，然后加入500ml无水甲苯在140℃下反应4天。冷却至室温后，将混合物过滤，用二氯甲烷洗涤，并收集滤液，用水洗涤。分离有机层，用mg2so4干燥，然后通过旋转蒸发仪除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用石油醚作为洗脱剂，得到产物2，为浅白色固体，产率45％。

(2)将2(0.67g，2mmol)放入两口烧瓶(250毫升)，4-甲酰基苯基硼酸(0.31g，2.5mmol)，pd(pph3)4(115mg，0.1mmol)，k2co3(828mg，6mmol)的甲苯溶液(60ml甲苯加入7.5ml乙醇和7.5ml水)，加热至110℃，并在氮气下搅拌过夜。冷却至室温后，分离有机层，并用二氯甲烷(dcm)萃取水层。合并的有机溶液用mg2so4干燥数小时。过滤后，将所得溶液通过旋转蒸发仪浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用dcm作为洗脱剂，得到产物3(0.60g，90.3％)。

(3)将[rhcp*cl2]2(2.0mol％)，agbf4(0.30mmol)，cu(oac)2(0.30mmol)，上一步得到的中间产物(0.15mmol)，4,4'-二甲氧基-二苯乙炔(0.30mmol)和丙胺(0.45mmol)的混合物在2.5ml叔戊醇中在氮气中在110℃下加热搅拌3h。当反应完成时，将混合物冷却并用ch2cl2(10ml)稀释。将混合物通过硅藻土垫过滤，并将硅藻土中用ch2cl2(30ml)和meoh(20ml)洗涤。通过硅胶柱色谱法使用ch2cl2/meoh(100：1，v/v)作为洗脱剂纯化，得到纯净产物。在超声处理下，从ch2cl2/pe混合物中进一步沉淀出固体，并过滤以获得粉末状产物。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.07(s,2h),8.38(d,j＝8.7hz,2h),7.53(dd,j＝8.6,1.4hz,2h),7.35–7.16(m,12h),6.92(t,j＝8.8hz,8h),6.69(s,4h),6.57(d,j＝8.6hz,4h),4.35–4.24(m,4h),3.73(d,j＝13.4hz,12h),1.80(m,4h),0.77(t,j＝7.4hz,6h)。

实施例2

光激活i型光敏剂(tidbon)的制备：

合成路线如下：

(1)将4,4’-n,n二甲基二苯甲酮(2.68g，10mmol)，四溴化碳(6.63g，20mmol)和三苯膦(10.5g，40mmol)混合物抽真空充n2三次，然后加入500ml无水甲苯在140℃下反应4天。冷却至室温后，将混合物过滤，用二氯甲烷洗涤，并收集滤液，用水洗涤。分离有机层，用mg2so4干燥，然后通过旋转蒸发仪除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用石油醚作为洗脱剂，得到产物2，为浅白色固体，产率30％。

(2)将2(0.84g，2mmol)放入两口烧瓶(250毫升)，4-甲酰基苯基硼酸(0.31g，2.5mmol)，pd(pph3)4(115mg，0.1mmol)，k2co3(828mg，6mmol)的甲苯溶液(60ml甲苯加入7.5ml乙醇和7.5ml水)，加热至110℃，并在氮气下搅拌过夜。冷却至室温后，分离有机层，并用二氯甲烷(dcm)萃取水层。合并的有机溶液用mg2so4干燥数小时。过滤后，将所得溶液通过旋转蒸发仪浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用dcm作为洗脱剂，得到产物3(0.40g)。

(3)将[rhcp*cl2]2(2.0mol％)，agbf4(0.30mmol)，cu(oac)2(0.30mmol)，上一步得到的中间产物(0.15mmol)，4,4'-二甲氧基-二苯乙炔(0.30mmol)和丙胺(0.45mmol)的混合物在2.5ml叔戊醇中在氮气中在110℃下加热搅拌3h。当反应完成时，将混合物冷却并用ch2cl2(10ml)稀释。将混合物通过硅藻土垫过滤，并将硅藻土中用ch2cl2(30ml)和meoh(20ml)洗涤。通过硅胶柱色谱法使用ch2cl2/meoh(100：1，v/v)作为洗脱剂纯化，得到纯净产物。在超声处理下，从ch2cl2/pe混合物中进一步沉淀出固体，并过滤以获得粉末状产物。

hrms:m/z1031.3521(m+,calcd1031.3529)

实施例3

光激活i型光敏剂(tidbo-oh)的制备：

合成路线如下：

(1)将二苯甲酮(1.82g，10mmol)，四溴化碳(6.63g，20mmol)和三苯膦(10.5g，40mmol)混合物抽真空充n2三次，然后加入500ml无水甲苯在140℃下反应4天。冷却至室温后，将混合物过滤，用二氯甲烷洗涤，并收集滤液，用水洗涤。分离有机层，用mg2so4干燥，然后通过旋转蒸发仪除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用石油醚作为洗脱剂，得到产物2，为浅白色固体，产率45％。

(2)将2(0.67g，2mmol)放入两口烧瓶(250毫升)，4-甲酰基苯基硼酸(0.31g，2.5mmol)，pd(pph3)4(115mg，0.1mmol)，k2co3(828mg，6mmol)的甲苯溶液(60ml甲苯加入7.5ml乙醇和7.5ml水)，加热至110℃，并在氮气下搅拌过夜。冷却至室温后，分离有机层，并用二氯甲烷(dcm)萃取水层。合并的有机溶液用mg2so4干燥数小时。过滤后，将所得溶液通过旋转蒸发仪浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用dcm作为洗脱剂，得到产物3(0.60g，90.3％)。

(3)将[rhcp*cl2]2(2.0mol％)，agbf4(0.30mmol)，cu(oac)2(0.30mmol)，上一步得到的中间产物(0.15mmol)，4,4'-二甲氧基-二苯乙炔(0.30mmol)和丙胺(0.45mmol)的混合物在2.5ml叔戊醇中在氮气中在110℃下加热搅拌3h。当反应完成时，将混合物冷却并用ch2cl2(10ml)稀释。将混合物通过硅藻土垫过滤，并将硅藻土中用ch2cl2(30ml)和meoh(20ml)洗涤。通过硅胶柱色谱法使用ch2cl2/meoh(100：1，v/v)作为洗脱剂纯化，得到纯净产物。在超声处理下，从ch2cl2/pe混合物中进一步沉淀出固体，并过滤以获得粉末状产物。

hrms:m/z948.4152(m+,calcd948.4127)

实施例4

实施例1中化合物tidbo的光学性质、活性氧产生能力以及用于细胞凋亡监测、细菌成像以及杀伤应用

(a)tidbo的光激活性质：

tidbo在365nmuv灯下光照不同时间后的荧光光谱图如图1所示，由图1可以看出：随着光照时间的延长，tidbo的荧光强度非常明显的逐渐增加。相对于光照前的tidbo荧光，光照后的tidbo呈现明显的光激活特性。进一步对光激活原因进行研究可以发现，365nmuv灯下光照不同时间后，如图2所示其核磁谱图发生明显的改变，参考之前的文献报道可以发现光照后发生光致关环反应导致其出现光激活现象，表明此为光化学主导的光激活。

(b)活性氧(ros)产生能力表征：

将tidbo以pbs缓冲溶液为溶剂配成一定浓度溶液，用不同的活性氧探针对其进行活性氧类型的表征。首先使用的荧光指示剂2,7-二氯二氢荧光素(dcfh)可以检测任何常规类型的ros(图3a)。由于在可见光区域吸收了tidbo，因此选择了10mwcm^-2的白光作为辐照源，以评估ros的产生。延长照射时间后，dcfh和tidbo混合溶液显示出逐渐增加的pl强度，在8分钟内达到约270倍的增强，而在纯dcfh溶液中观察到的排放几乎没有增加，表明高效且快速的ros产生。然后，采用了9,10-蒽二基-双(亚甲基)二氢膦酸(abda)，它可以选择性地对ii型活性氧¹o2响应。如图3b所示，在不同时间的白光照射下，abda与tidbo混合后其在378nm处的吸收峰基本上没变化，表明tidbo的¹o2生成能力较差，即产生ii型活性氧的能力差。因此，高效的ros产生主要归因于光照射后形成的i型ros(自由基为主)，其中o2·-被认为是可以转化为oh的主要前体。通过次级反应。但是，作为o2·-指示剂的二氢罗丹明123(dhr123)一直被称为非选择性探针，灵敏度很低。因此，我们选择了二级产物oh·来验证i型过程，该过程可以通过羟苯基荧光素(hpf)专门检测出来。可以发现，在10mwcm^-2的白光照射16min后，hpf和tidbo的混合溶液中观察到明显的荧光增强，而纯hpf溶液几乎没有发生荧光强度变化(图3c)。tidbo可以有效地产生自由基ros生成。为进一步验证tidbo在光照射下的自由基ros生成，使用了5-叔丁氧基羰基-5-甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(bmpo)作为自旋捕集剂用于评估自由基的形成。如图3d所示，无论是在光照射下的bmpo还是在黑暗中的bmpo+tidbo在epr光谱中均未产生信号，但是在bmpo+tidbo溶液照射后可以观察到明显的epr信号，这与自由基物质的产生能力有关(i型ros)。

(c)tidbo的细胞凋亡监测实验：

将tidbo以一定浓度dmso溶液溶解后滴入细胞培养液中，选择hela细胞作为研究对象，培养一段时间后将细胞在30mw/cm²的led光源下照射10分钟诱导活性氧产生触发细胞凋亡，然后立即采用共聚焦显微镜以在线培养的模式进行细胞成像，如图4所示，发现随着培养时间的延长，细胞内的荧光强度不断增强，同时从明场可以看出细胞形态逐渐变差，细胞开始起泡到细胞完全塌陷，荧光强度逐渐增强，表明其可以通过荧光强度的变化对细胞凋亡过程进行监测。

(d)tidbo用于细菌成像实验

1.菌种(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌)接种在5ml的培养基中，在37℃培养12h。之后菌种以7100转离心1分钟，同时用磷酸盐缓冲液(pbs,10mm,ph＝7.4)冲洗三次，上清液弃去，留下的菌种悬浮在pbs中，然后在600nm下稀释到1.0个光密度(od600＝1.0)。

2.菌种在pbs缓冲溶液中与5μm浓度的tidbo在37℃下共染15分钟，之后以7100转离心1分钟，得到的染色后菌种置于10μlpbs缓冲溶液中，并保存在冰柜中用于激光扫描共聚焦显微镜检测。如图5所示，tidbo对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌都有很好的结合能力。

(e)tidbo用于抗菌实验

将金黄色葡萄球菌(od600＝0.4)稀释5倍后，分别与0.5、1、5、10μm的tidbo避光相互作用10分钟，总体积为500μl，空白组为不含光敏剂分子的空白菌液，于白光(35mw·cm-²)下光照10分钟，对照组于黑暗条件下作用10分钟，之后稀释10⁴倍至1ml，取100μl涂布于nb固体平板培养基上。将平板放置于37℃恒温培养箱培养16小时后，测定平板上菌落的数量。

用相同的条件处理白色念珠菌及大肠杆菌。

tidbo对金黄色葡萄球菌的杀伤效果最好(如图6所示)，对其他两种菌的杀伤效果一般。

上述数据表明，本发明通过利用光化学反应导致光激活过程中的电子转移诱导良好的i型活性氧产生，提供了一种i型活性氧产生的可行性方法。将这类材料在光照下产生活性氧并可以触发细胞凋亡，并且可以利用荧光强度的变化对细胞凋亡过程进行监测。此外，在抗菌方面具有非常大的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。