猕猴桃转录因子AcNAC4及其在果实酯类芳香物质合成中的应用

猕猴桃转录因子acnac4及其在果实酯类芳香物质合成中的应用
技术领域
1.本发明主要属于植物分子生物学技术领域，更具体地，涉及猕猴桃转录因子acnac4及其在果实酯类芳香物质合成中的应用。


背景技术：

2.植物果实富含维生素，矿物质，膳食纤维等营养物质，是人类主要的食物来源。果实含有丰富的营养物质，是人类主要的食物来源。风味是果实的内在品质之一，其主要是由味觉和嗅觉构成，前者以甜酸味为主，与糖、有机酸等物质的种类和含量有关，后者主要取决于挥发性香气成分的种类与含量。香气成分是评价果实品质的重要指标，不仅能客观反映不同果实的风味特点和成熟程度，还与人类营养和健康密切相关。果实的挥发性香气成分的构成是十分复杂的，目前已经从不同的植物中鉴别出近2000种香气成分。随着消费者对果实品质要求的日益提高，香味研究也日益受到重视。香气成分是大量挥发性化合物的复杂混合物，不同种类果实的香气物质差异巨大。因此，关于果实香气成分等风味物质的研究一直是植物学领域研究的重要内容。但目前对于猕猴桃果实酯类芳香物质合成调控的研究还很少。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种猕猴桃转录因子acnac4及其在果实酯类芳香物质合成中的应用，以解决至少一个上述技术问题。
4.为解决上述问题，作为本发明的一个方面，提供了一种猕猴桃转录因子acnac4基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5.本发明还提供了一种猕猴桃转录因子acnac4基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6.本发明还提供了一种用于猕猴桃acnac4基因构建超表达载体的引物，所述引物包括正向引物acnac4
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f、和反向引物acnac4
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r，所述acnac4
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f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述acnac4
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r的核苷酸序列如seq id no.4所示。
7.本发明还提供了一种用于猕猴桃acnac4基因构建vigs载体的引物，所述引物包括正向引物acnac4
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f、和反向引物acnac4
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r，所述acnac4
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f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述acnac4
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r的核苷酸序列如seq id no.6所示。
8.本发明还提供了一种基于qrt
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pcr方法检测红阳猕猴桃acnac4基因表达水平所用引物，所述引物包括正向引物acnac4
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fq、和反向引物acnac4
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rq，所述acnac4
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fq的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述acnac4
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rq的核苷酸序列如seq id no.8所示。
9.本发明提出了重要的转录因子，研究猕猴桃果实生长发育过程中香气物质的合成调控机制，对于通过生物学手段保持其特有风味、改善其果实品质均具有重要意义，其通过比较不同猕猴桃果实中转录因子acnac4的表达水平和果实酯类芳香物质的含量，证明转录
因子acnac4和猕猴桃果实酯类芳香物质的合成存在一定的调控关系；利用植物分子生物学手段和遗传学实验，通过瞬时注射猕猴桃果实进一步证明转录因子acnac4能够调控猕猴桃果实酯类芳香物质的合成。
附图说明
10.图1示意性地示出了不同品种猕猴桃中acnac4基因表达水平检测及比较；
11.图2示意性地示出了不同品种猕猴桃中酯类香气物质的合成水平检测及比较；
12.图3示意性地示出了本发明所述过表达acnac4基因的红阳猕猴桃转基因材料中acnac4基因表达水平显著提高；
13.图4示意性地示出了本发明所述沉默表达acnac4基因的红阳猕猴桃转基因材料中acnac4基因表达水平acaat10表达水平显著降低；
14.图5示意性地示出了本发明所述过表达acnac4基因的红阳猕猴桃转基因材料酯类香气物质的合成水平显著提高；
15.图6示意性地示出了本发明所述沉默表达acnac4基因的红阳猕猴桃转基因材料酯类香气物质的合成水平显著降低。
具体实施方式
16.以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
17.本发明提出了重要的转录因子，研究猕猴桃果实生长发育过程中香气物质的合成调控机制，对于通过生物学手段保持其特有风味、改善其果实品质均具有重要意义，其通过比较不同猕猴桃果实中转录因子acnac4的表达水平和果实酯类芳香物质的含量，证明转录因子acnac4和猕猴桃果实酯类芳香物质的合成存在一定的调控关系；利用植物分子生物学手段和遗传学实验，通过瞬时注射猕猴桃果实进一步证明转录因子acnac4能够调控猕猴桃果实酯类芳香物质的合成。
18.本发明的目的在于提供猕猴桃转录因子acnac4及其在果实酯类芳香物质合成中的应用。本发明提供了一种猕猴桃转录因子acnac4基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；
19.还提供了一种猕猴桃转录因子acnac4基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；
20.还提供了一种用于猕猴桃acnac4基因构建超表达载体的引物，所述引物包括正向引物acnac4
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f、和反向引物acnac4
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r，所述acnac4
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f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述acnac4
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r的核苷酸序列如seq id no.4所示；
21.还提供了一种用于猕猴桃acnac4基因构建vigs载体的引物，所述引物包括正向引物acnac4
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f、和反向引物acnac4
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r，所述acnac4
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f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述acnac4
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r的核苷酸序列如seq id no.6所示；
22.还提供了一种基于qrt
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pcr方法检测红阳猕猴桃acnac4基因表达水平所用引物，所述引物包括正向引物acnac4
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fq、和反向引物acnac4
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rq，所述acnac4
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fq的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述acnac4
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rq的核苷酸序列如seq id no.8所示。
23.本发明中涉及的植物材料包括红阳猕猴桃、红什猕猴桃、黄金果猕猴桃、软枣猕猴桃，所有猕猴桃均采自四川省自然资源科学研究院什邡科研基地的猕猴桃种质资源圃。
24.菌株：超表达载体pbi121由本实验室保存；vigs载体ptrv1和ptrv2由本实验室保存；dh5α大肠杆菌转化菌株和gv3101农杆菌转化菌株均购自擎科新业生物技术有限公司。
25.实施例1猕猴桃acnac4基因表达水平检测
26.不同品种的猕猴桃挑选大小均一、色泽均匀、无病虫害和机械伤害且成熟度相对一致,所有样品于采收当日及时运抵实验室，并及时用液氮处理样品，并保存于﹣80℃超低温冰箱中备用。
27.按照果实rna提取试剂盒说明书分别提取不同果实样品的rna，将rna去除基因组，并进行反转录得到cdna模板，稀释至100ng/ml，
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20℃保存待用。果实rna提取试剂盒购于天根生化科技根公司,反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技股份有限公司。反转录步骤如下，在反应管中直接加入4.0μl的5
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hiscript ii qrt supermix ii和6.0μl的rna样品，使用移液枪轻轻吹打混匀，pcr程序：50℃15min，85℃5s。产物储存于
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20℃，cdna应避免反复冻融。
28.运用primer5软件设计qrt
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pcr引物，按照qpcr试剂盒提供的实验步骤，利用实时荧光定量pcr仪(bio
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rad公司)检测acnac4的基因表达水平。使用猕猴桃acactin基因作为内参并设置三个生物学重复。qrt
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pcr试剂盒购自诺唯赞生物科技股份有限公司。
29.结果表明，四种猕猴桃当中，acnac4在红阳猕猴桃中的相对表达量最高，而红什猕猴桃、黄金果猕猴桃、软枣猕猴桃当中acnac4基因的表达水平差距不大(图1)。检测不同品种猕猴桃当中酯类香气物质的含量,即丁酸甲酯(ethyl butanoate)和丁酸乙酯(methyl butanoate)，红阳猕猴桃中酯类物质的含量显著高于别的品种，另外三种猕猴桃含量相差不大(图2)，这与acnac4基因表达水平一致，证明转录因子acnac4能够调控猕猴桃果实酯类芳香物质的合成。
30.实施例2acnac4基因超表达及vigs载体构建及侵染
31.利用序列表中的超表达及vigs载体构建引物(seq id no.3/4/5/6)，以红阳猕猴桃cdna作为模板，进行pcr扩增，获得pcr产物。纯化后的pcr产物经过双酶切分别连接到超表达载体pbi121及vigs载体ptrv2上，然后将构建好的载体pbi121
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acnac4和ptrv2
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acnac4分别转入dh5α大肠杆菌和gv3101农杆菌感受态。在红阳猕猴桃授粉后100天的果实0.5厘米深度处分别注射农杆菌菌液，acnac4基因超表达试验组包括pbi121
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acnac4菌液，对照组为pbi121空载菌液，基因沉默试验组包括ptrv2
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acnac4菌液和ptrv1菌液，对照组为ptrv2菌液和ptrv1菌液。每个果实注射三个不同部位，并包括六个生物学重复。注射后猕猴桃果实(无皮、无籽)在猕猴桃授粉后140天采集，液氮冷冻，保存于﹣80℃超低温冰箱中待下一步分析。
32.结果显示，与对照相比，注射acnac4基因超表达菌液的猕猴桃果实中acnac4的基因表达水平有显著增加(图3)，同时酯类香气物质(丁酸甲酯和丁酸乙酯)的含量也有显著提高(图5)。而在注射vigs载体的猕猴桃果实中acnac4的基因表达水平显著降低(图4)，检测到的丁酸甲酯和丁酸乙酯水平也显著降低(图6)。这些结果都表明转录因子acnac4能够调控猕猴桃果实酯类芳香物质的合成。
33.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。