一种表达量提高的截短型ATP7B基因及其应用的制作方法

一种表达量提高的截短型atp7b基因及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达量提高的截短型atp7b基因及其应用。


背景技术：

2.肝豆状核变性也称威尔逊病(wilson disease，wd)，是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传疾病，临床表现主要是进行性肝硬化、肾脏损伤、角膜色素环等。研究证明wd是由于atp7b基因突变导致，该基因编码铜转运p型atp酶(copper-transporting p-type atpase,atp7b)。atp7b是一种表达在多器官的膜蛋白，主要功能是促进铜随血液及胆汁排泄。当atp7b基因发生突变时，通过影响蛋白的合成、折叠、定位及降解等过程使得atp7b蛋白转运功能减弱或缺失，转运铜能力下降，引起血清铜蓝蛋白合成减少、胆管排铜受损。过量的铜蓄积在体内，引起细胞坏死和器官损害，后期严重影响患者的生活质量，最终可引起死亡。wd一经诊断，需要进行长期、综合性的临床治疗，并且要求早治疗、终身治疗、定期随访，中断治疗将很可能恶化为急性肝衰竭。
3.目前wd的治疗方案主要有饮食治疗和药物治疗以及肝移植等。饮食治疗要求患者避免高铜饮食(例如贝类，坚果，巧克力，蘑菇和动物内脏等)。药物治疗主要是建立负铜平衡，采用的药物主要包括金属螯合剂：d-青霉胺和曲恩汀；抑制铜离子吸收药物：锌盐和四硫代钼酸铵(tm)。而饮食治疗由于限制了食物的选择，会影响了患者饮食生活习惯，从而可能导致患者的依从性降低，难以达到预期的治疗效果。
4.在wd发展到晚期肝炎和脑损伤之前进行早期的药物治疗，通常在2-6个月之内，大于90％的患者肝功能和转氨酶会得到很好的改善，持续进行更长时间的治疗，有50％-60％的患者会有神经系统的改善。然而每种药都有不同的疗效和副作用，具体使用方法需要依据患者病情而定，但药物治疗通常是终身的。此外，铜螯合剂药物促进尿铜排出时常常导致严重的副作用，如过敏反应和慢性关节损伤，无法进行长期治疗。另一种治疗方法是肝移植，因为wd主要是一种以肝细胞受损为特征的疾病，而肝脏是铜的主要代谢器官，因此肝脏移植可以被视为wd基因缺陷的表型校正，并可以恢复铜稳态。但肝移植有可能会导致神经系统病情的恶化，此外，肝移植还存在治疗费用高、难以找到合适的供体等困难。因此亟需找到一种治疗wd的新策略。
5.早期有一些研究利用重组腺病毒和慢病毒将atp7b导入wd模型——long-evans cinnamon(lec)大鼠体内来进行基因治疗，结果表明肝脏导入外源atp7b的基因治疗方案是可行的，但此治疗方法却存在一定的不足。例如腺病毒不能整合到宿主细胞染色体中，只能瞬时表达，疗效不持久且经常会引起机体较强的免疫反应。作为基因载体，慢病毒具有容量大、不易诱发宿主免疫反应等优点，但由于慢病毒载体会诱发转基因整合到宿主基因组上，因此应用到人体的安全性有待进一步证实。这些结果都促使研究人员寻找更长久、有效、安全的wd基因治疗策略，基因治疗也是当前治疗wd的研究热点。
6.近年来，基于重组腺相关病毒导入人源的atp7b在动物实验中取得了不错的效果。
通过有肝嗜性的aav8载体将人源atp7b基因导入肝细胞(aav8-atp7b)，补偿突变的atp7b，从而使得atp7b基因能够正常行使其功能，该治疗方法可以有效的改善wd小鼠的尿铜和血清铜蓝蛋白，缓解肝脏病变。但aav的包装量有限，全长的atp7b基因较大，接近aav的包装上限，造成包装困难和产量低下，因此，若能找到一种与全长atp7b有相当排铜功能的截短型atp7b，就有望克服这一限制。
7.综上所述，本发明旨在提供一种新的截短型atp7b基因片段，以缓解上述问题中的至少一项。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型截短型atp7b基因，具体技术方案如下。
9.一种表达量提高的截短型atp7b基因，所述基因的核苷酸序列包括如seq id no.1所示的全长和/或其中的片段。
10.进一步，所述基因的氨基酸序列包括如seq id no.2所示的全长和/或其中的片段。
11.进一步，所述基因的核苷酸序列中包含一段kozak序列。
12.kozak序列是位于真核生物mrna 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是gccaccaugg，可显著增强蛋白质翻译。其中，第4位g的作用较强(以aug起始密码子的a为第1位碱基)；然而，这个规则限定了起始密码子紧邻的氨基酸编码种类只能是缬氨酸(gtt/gtc/gta/gtg)、丙氨酸(gct/gcc/gca/gcg)、天冬氨酸(gat/gac)、谷氨酸(gaa/gag)和甘氨酸(ggt/ggc/gga/ggg)。虽然可以通过强行加入上述氨基酸的密码子来实现第4位碱基是g，但是这种策略有增加治疗基因的免疫源性、破坏基因功能的风险。本发明提供的新型截短型atp7b基因，通过去掉一个不必要的氨基酸，从而在不额外引入多余氨基酸的条件下形成了较强的kozak序列，可以提高atp7b基因翻译效率。
13.进一步，所述kozak序列的核苷酸序列包括如seq id no.3所示的全长和/或其中的片段。
14.包含上述新型截短型atp7b基因核苷酸的重组腺相关病毒载体raav。
15.腺病毒载体转基因效率高；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞的限制；容易制得高滴度病毒载体。
16.进一步，构建所述重组腺相关病毒载体的腺相关病毒选自2型、5型、8型和9型aav或其变体中的一种或几种。
17.上述重组腺病毒载体在制备治疗威尔逊病的药物中的应用。
18.本发明的目的还在于提供所述新型截短型atp7b基因的应用及其制备方法。
19.一种治疗威尔逊病的药物，所述药物含有上述的截短型atp7b基因全长和/或其中的片段。
20.进一步，所述药物还含有药学上可接受的任何辅料和/或助剂。
21.一种表达量提高的截短型atp7b基因的制备方法，包括以下步骤：
22.1)利用重叠pcr技术(overlap pcr)去掉atp7b全长基因中金属结合域1-4获得截短突变体基因片段tatp7b；重叠pcr扩增使用2个引物对。其中，第一引物对正向引物f1序列
如seq id no.6所示；反向引物r1序列如seq id no.7所示。第二引物对正向引物f2序列如seq id no.8所示；反向引物r1序列如seq id no.9所示。
23.然后以tatp7b基因为模板，设计引物进行pcr扩增，利用同源重组分子克隆技术，将扩增产物装入pvax1载体，得到tatp7b质粒。tatp7b基因扩增引物为：正向引物f序列如seq id no.10所示；反向引物r序列如seq id no.11所示。
24.2)再设计引物以tatp7b质粒为模板进一步进行pcr扩增，得到tatp7b-deltp片段，扩增引物为：正向引物f序列如seq id no.12所示；反向引物r序列如seq id no.13所示。
25.有益效果
26.本发明提供了一种制备新型截短型atp7b基因的方法。由于全长的atp7b基因较大，因此现有载体在包装时存在包装困难和产量低下的问题。而本发明提供的制备方法在不引入多余氨基酸，且不影响功能的情况下，制备得到一种包含kozak序列的截短型atp7b基因。
27.本发明提供的新型截短型atp7b基因，其蛋白表达量更高，且排铜功能与亚细胞定位功能与常规的atp7b基因相当。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
29.图1为本发明的截短型atp7b基因的蛋白表达图；
30.图2为本发明的截短型atp7b基因的荧光素酶活性对照图；
31.图3为本发明的截短型atp7b基因的亚细胞定位实验图(最左边一列用cy3标记，呈现红色荧光；中间一列用dapi标记，呈现蓝色荧光；最右边一列是红蓝色荧光的融合；)；
32.图4为atp7b的结构示意图(核酸结合结构域(n-domain)、磷酸化结构域(p-domain)、去磷酸化结构域(a-domain)；n-domain和p-domain组合通常称为atp结合结构域；n末端包含六个与铜结合的金属结合域(mbd1-mbd6)，跨膜结构域(tmd)包含8个跨膜螺旋)。
具体实施方式
33.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
35.如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是
所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
36.在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
37.名词解释
38.本发明所述的“截短型”是指相较于atp7b全长基因，去掉了mbd1-4以及一个多余氨基酸制备得到的atp7b基因片段。
39.本发明所述的“表达量提高”是指本发明提供的含有强kozak序列的截短型tatp7b-deltp基因，相对于去掉mbd1-4的截短突变体基因tatp7b和全长atp7b基因，蛋白表达量提高。
40.实施例一
41.截短型atp7b基因的制备方法
42.1.构建截短突变体基因片段tatp7b
43.atp7b基因位于第13号染色体长臂(13q14.3)，dna全长约80kb，包含21个外显子和20个内含子，其cdna编码的atp7b蛋白大小约为165kda。参见图4，atp7b上有8个跨膜结构域(tmd1-8)，其中tmd4和tmd5之间形成a-domain(去磷酸化结构域)，tmd6和tmd7之间是两个参与atp水解与结合的功能区，分别是p-domain(磷酸化结构域)和n-domain(核酸结合结构域)。
44.atp7b的n端有6个金属结合结构域(mbds)，这6个金属结合结构域都有一段特有的序列：mxcxxc(x代表任意氨基酸)，其中cxxc中的2个半胱氨酸残基是铜离子结合位点。已有研究证明，atp7b中n末端所有mbds的突变不会影响atp7b蛋白的表达，但是会破坏atp7b的功能。mbd1-4为高等生物特有，缺失后对跨膜区与铜离子的亲和力影响较小，相反却会促进atp的水解和结合，说明mbd1-4具有调节酶活动的作用。
45.本发明实验组首先去掉atp7b全长基因中的mbd1-4获得截短突变体基因片段tatp7b。tatp7b的核苷酸序列包括如seq id no.4所示的全长和/或其中的片段；tatp7b的氨基酸列包括如seq id no.5所示的全长和/或其中的片段。
46.2.构建表达量提高的截短型atp7b基因片段
47.通过生物信息学分析，实验组发现在不同哺乳动物中，atp7b蛋白的n端序列不保守，提示这部分序列可以进行改造。tatp7b的核苷酸序列中包含一段弱kozak序列，为gccaccatgcct(以atg起始密码子的a为第1位碱基)。本实验组通过去掉cct，即脯氨酸(p)，使得原来的弱kozak序列变为gccaccatggag，即较强的kozak序列，如seq id no.3所示。得到本发明的表达量提高的截短型atp7b基因tatp7b-deltp，其核苷酸序列包括如seq id no.1所示的全长和/或其中的片段；其氨基酸序列包括如seq id no.2所示的全长和/或其中的片段。具体操作步骤如下：
48.1)利用重叠pcr技术去掉atp7b全长基因中金属结合域1-4获得截短突变体基因片
段tatp7b；重叠pcr扩增引物如下：f1:atgcctgagcaggagagac(seq id no.6)；r1：gccactgctctggtctgagaagaagggcccag(seq id no.7)；f2：gcccttcttctcagaccagagcagtggcaccg(seq id no.8)；r2:ttagatgtactgctcctcatcc(seq id no.9)。以tatp7b基因为模板，设计引物进行pcr扩增，利用同源重组分子克隆技术，将扩增产物装入pvax1载体，得到tatp7b质粒。tatp7b质粒扩增引物如下：f：atagggagacccaagctggctagcgccaccatgcctgagcaggagagac(seq id no.10)；r：gctggatatctgcagaattcttagatgtactgctcctcatcc(seq id no.11)。
49.2)再设计引物以tatp7b质粒为模板做pcr，得到tatp7b-deltp片段，扩增引物如下：f:5
’‑
atagggagacccaagctggctagcgccaccatggagcaggagagacagatcac-3’(seq id no.12)；r:5
’‑
gctggatatctgcagaattcttagatgtactgctcctcatcc-3’(seq id no.13)。
50.实施例二
51.tatp7bdeltp功能验证
52.蛋白表达量实验
53.用质量相同的tatp7b和tatp7bdeltp分别转染hek293t细胞，48h后提取细胞蛋白，以β-actin为内参。
54.western blot步骤：
55.1)样品处理：细胞样品用pbs洗两次后，重旋离心，加入200μl蛋白酶抑制剂(200μl ripa溶液中含有2μl 100
×
cocktail)，于冰上超声提取蛋白；
56.2)超声后4℃离心12000rpm，5min，取上清于新的1.5ml ep管中，上清用nanodrop测蛋白浓度；
57.3)蛋白加入有β-巯基乙醇的5
×
蛋白loading，煮沸5min，使蛋白变性；
58.4)电泳：按照试剂盒说明书配制sds-page蛋白胶；按每孔30μg的蛋白量进行上样，上样完成后在电泳缓冲液的条件下100v恒压进行电泳直至5
×
蛋白loading完全离开蛋白胶；
59.5)转膜：电泳结束后将蛋白胶取下，去掉浓缩胶和loading，根据marker的位置将蛋白胶切下；根据蛋白胶大小裁剪pvdf膜，然后将pvdf膜放入甲醇中浸泡10s；然后按顺序放置pvdf膜和蛋白胶(pvdf膜做好标记以便区分上下和不同的样品)，加入转膜缓冲液，在冰浴的环境中转膜，100v恒压90min；
60.6)转膜完成后将pvdf膜取下，放入封闭液中，室温摇床上封闭1h；
61.7)tbs/t洗膜两次，每次10min；
62.8)用一抗稀释液稀释一抗，杂交袋孵育，4℃缓慢摇动孵育过夜；
63.9)取出将其放置到室温；
64.10)回收一抗，tbs/t洗膜3次，每次15min；
65.11)加入对应的稀释的二抗，室温孵育1.5h；
66.12)tbs/t洗膜4次，每次15min；
67.13)显色曝光。
68.实验结果
69.如图1所示，结果显示，在β-actin蛋白表达相当量的情况下，tatp7bdeltp的蛋白表达量高于tatp7b。该结果提示本发明在提高基因atp7b的表达量的基础上，有望提高治疗效果。
70.实施例三
71.tatp7bdeltp功能验证
72.排铜实验
73.将tatp7b-deltp、tatp7b分别插入pvax1质粒构建重组质粒，然后分别与7xmre,tk-rluc质粒共转染293t细胞(control组为pvax-lacz阴性对照组)，24h后，加入含铜或不含铜培养基处理细胞24h后用酶标仪检测荧光强度。
74.荧光素酶活性测定步骤：
75.1)293t细胞接种至48孔板，待细胞长至融合度为80％时转染；
76.2)参照transeasy操作步骤转染质粒，转染24h后将48孔板接种至96孔板，同时培养基中加cuso4溶液，使其终浓度为75um。细胞继续培养，使其恢复排铜功能；
77.3)24h后参照promega的luciferase assay system操作步骤，先于每孔细胞加75ulluciferase assay reagent，20-25℃孵育30min后于多功能酶标仪检测萤火虫荧光素的表达量，并记录数据；
78.4)继续向每孔加stop&reagent，20-25℃孵育30min后于多功能酶标仪检测海肾荧光素表达量，并记录数据；
79.5)两者数据比值可反应出各atp7b亚型的排铜情况。
80.实验结果
81.结果如图2所示，纵坐标为各组含铜与不含铜的(萤火虫荧光素表达量/海肾荧光素表达量)的比值，数值和误差线为三组数据的平均值和标准差。结果显示，与对照(control)组相比tatp7b和tatp7b-deltp的含铜与不含铜的相对荧光表达比值接近1，显示出具有排铜功能。现有技术文献已经证明，tatp7b具有和全长atp7b相似的排铜功能，因此tatp7b-deltp也与全长atp7b具有相当的排铜功能。
82.实施例四
83.tatp7bdeltp功能验证
84.亚细胞定位实验
85.将tatp7b-deltp、tatp7b、atp7b重组质粒转染cho细胞，过夜培养后用含cuso4或不含cuso4的培养基处理细胞4小时，然后固定，荧光显微镜下成像。
86.具体步骤：
87.1)cho细胞铺24孔板爬片，待细胞长至融合度为70％-80％时转染；
88.2)转染24h后，换含75umcuso4溶液的新鲜培养基(不加铜的培养基做为对照)，继续培养4-5h后撤掉培养基；
89.3)用pbs适当润洗细胞；
90.4)吸掉pbs，4％多聚甲醛固定细胞10min；
91.5)吸掉多聚甲醛，pbs润洗三次，每次5min；
92.6)加入正常山羊血清封闭，室温封闭1h；
93.7)封闭结束后，吸去封闭液，用pbs润洗三次，每次5min；
94.8)加入适当稀释的atp7b一抗，4℃过夜孵育；
95.9)取出孔板恢复至室温后，吸去一抗，用pbs清洗爬片三次，每次5min；
96.10)加入cy3标记的荧光二抗工作液，避光室温孵育1h；
97.11)吸去荧光二抗，用pbs清洗爬片三次，每次5min；
98.12)加入dapi工作液，室温避光孵育10min；
99.13)吸去dpai工作液，用pbs清洗爬片三次，每次5min；
100.14)在载玻片上滴加适量抗荧光淬灭剂，盖上载玻片，用适量指甲油封片；
101.15)在荧光显微镜下观察。
102.实验结果
103.如图3所示，各组项下加铜实验组相对于不加铜组均能看到atp7b向四周迁移现象。其原理是，atp7b中的n端存在一个约63个氨基酸的信号肽，可以对铜离子浓度响应，当胞质内铜离子浓度较低时，atp7b主要集中在高尔基体网状结构(tgn)上，当胞质内铜浓度升高时，atp7b逐渐向细胞胆管侧膜移动和聚集，这种铜离子的转位极有可能主导肝细胞向胆小管的排铜作用。本发明制备得到的tatp7bdeltp具有与atp7b相似的亚细胞转位功能。
104.上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。