用于检测新型冠状病毒的引物组、试剂、试剂盒及检测方法

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及用于检测新型冠状病毒的引物组，新型冠状病毒检测试剂，新型冠状病毒检测试剂盒以及检测方法。

背景技术：

新型冠状病毒(国际命名为sars-cov-2)具有潜伏期长，传染性强等特征，应对新型冠状病毒的治疗药物和疫苗的研发至关重要。目前市场上的sars-cov-2核酸检测技术主要有以下三种：

(1)实时荧光反转录聚合酶链式反应(荧光定量rt-pcr)检测技术是sars-cov-2核酸检测的主流技术。其原理为，首先将提取的病毒基因组rna，通过反转录变成互补dna(cdna)。在pcr反应体系中包含一对特异性引物以及一个taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。如果反应体系存在靶序列，pcr反应时探针与模板结合，dna聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条dna链，就有一个荧光分子产生。荧光定量pcr仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，ct值越小。rt-pcr采用的检测特异性区域主要是3个：开放阅读框1ab(openreadingframe，orf1ab)、核壳蛋白(nucleoprotein，n)、包膜蛋白(envelop，e)基因。美国cdc建议的是orf1ab，为确认靶标，因为其特异性最高；n是附加确认靶标；e是一线筛查靶标。目前该方法的灵敏度多在500拷贝/毫升，有个别是200拷贝/毫升，时间为2-4个小时。然而，荧光定量rt-pcr依赖于昂贵的荧光检测pcr仪和专业人员的操作和结果分析，另外其假阳性率偏高，这大大限制了该检测技术的推广。

(2)基因测序检测技术是发展比较快的新技术。通过对病人样本进行核酸提取，然后用二代高通量测序技术进行测序，将测得结果与sars-cov-2比对，分析其同源性，对病原微生物进行检测。但是二代高通量测序技术使用的仪器设备昂贵，对病毒的全部序列测序需要较长的时间，且需要专业生物信息学人员对其解读，所以二代测序技术还不适用于大规模检测。

(3)恒温扩增芯片技术是新一代核酸检测技术。恒温扩增芯片法的特点是针对靶基因的6个区域设计4对特异性物，利用链置换dna聚合酶(bstdna聚合酶)在恒温条件下(65℃左右)经过非循环起始阶段、环扩增阶段、循环延伸阶段，最终形成一系列有多个靶dna反向重复序列串联的不同大小的产物。该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等步骤，整个过程15-60分钟即可完成。等温扩增技术因不依赖热循环仪，进而在近20多年得到快速发展，尤其是在微生物检测领域中。另外检测时间短也是等温扩增技术的优势。等温技术可在实时现场检测与监测领域推广，如在突发公共卫生事件的现场诊断中。等温技术对传染性疾病的早期发现和控制具有重要的意义。然而，当前等温扩增技术在灵敏度、特异性和抗干扰度方面仍各自有着其内在缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供用于检测新型冠状病毒的引物组，新型冠状病毒检测试剂，新型冠状病毒检测试剂盒以及检测方法，以提高新型冠状病毒检测的灵敏度及特异性，操作简便快捷。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明公开了用于检测新型冠状病毒的引物组，包括包括上游引物、下游引物、cas12a结合引物以及用于荧光检测的探针，上游引物的序列号如seqidno.1所示，下游引物的序列号如seqidno.2所示，cas12a结合引物的序列号如seqidno.3所示

其中，所述的探针的序列号如seqidno.4所示。

本发明还公开了一种新型冠状病毒检测试剂，包括上述引物组，还包括以下组分：含冻干酶粉的再水化缓冲液、反应缓冲液、cas12a酶、rnase抑制剂、逆转录酶、醋酸镁溶液，试剂中各组分的体积份数如下：含冻干酶粉的再水化缓冲液10份，反应缓冲液2.3～2.5份，上游引物0.3～0.5份，下游引物0.3～0.5份，cas12a结合引物1.1～1.3份，探针1.1～1.3份，cas12a酶1.1～1.3份，rnase抑制剂1.1～1.3份，逆转录酶0.1～0.3份，醋酸镁溶液1.5～1.7份。

其中，含冻干酶粉的再水化缓冲液为向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入29μl～30μl再水化缓冲液混匀后得到。

其中，所述的上游引物的初始浓度为10μmol/l，下游引物的初始浓度为10μmol/l，cas12a结合引物的初始浓度为10ng/μl，探针的初始浓度为20μmol/l，cas12a酶的初始浓度为1μmol/l，逆转录酶的初始浓度为100,000u/ml，各组分在试剂中的最终浓度为：上游引物0.2μmol/l，下游引物0.2μmol/l，cas12a结合引物0.6ng/μl，探针1.2μmol/l。

本发明还公开了一种新型冠状病毒检测试剂盒，包括上述的新型冠状病毒检测试剂，还包括阳性对照样品或/和空白对照样品，阳性对照样品或者空白对照样品反应时加入的体积份数为0.3～0.5份，所述的阳性对照样品的序列号如seqidno.5所示，所述的空白对照样品为无核酸酶水。

本发明还公开了一种新型冠状病毒的检测方法，包括以下步骤：

s1.提取rna

提取待检测样品的rna，并进行纯化。

s2.恒温扩增和cas12a检测

将步骤s1得到的rna纯化样品在37℃～42℃恒温条件下按体积份数0.3～0.5份加入到新型冠状病毒检测试剂中进行反应，利用上游引物和下游引物进行rpa扩增，同时cas12a对rpa产物进行检测，得到反应产物。

s3.荧光检测

将步骤s2得到的反应产物进行荧光检测，若出现荧光，说明检测到新型冠状病毒，若未出现荧光，则说明没有检测到新型冠状病毒。

进一步地，步骤s2中还设置空白对照组，空白对照组采用无核酸酶水作为空白对照样品。

进一步地，步骤s2中还设置阳性对照组，阳性对照样品的序列号如seqidno.5所示，阳性对照样品加入的浓度≥1×10⁴copies/μl。

优选地，步骤s2中将rna纯化样品在35℃～40℃金属浴或水浴锅上反应50～60min；步骤s3中反应产物放入切胶仪中进行荧光检测。

本发明创新性地将rpa恒温扩增技术与crispr/cas12a切割技术(rpa-crispr/cas12a)结合，最大程度提高病毒检测的灵敏性和特异性。其技术原理如下详述：

重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技术能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。传统的pcr技术必须要经过变性、退火、延伸三个步骤在pcr仪中才能完成，而rpa的反应温度是在37-42℃之间，无需变性和退火就可完成扩增，摆脱了对pcr仪等大型仪器的依赖。

cas12a是crispr-cas系统的一个新成员，属于该系统2类v型。cas12a是rna引导的dna靶向酶，结合并切割dna作为细菌适应性免疫系统的组成部分。cas12a也可以作为一种强大的基因组编辑工具，因为它能够在双链dna(dsdna)切割位点诱导细胞的遗传变化。cas12a的作用基础是ruvc和hnh两个催化结构域在与一个guiderna序列互补的序列上双链dna结合并激发其切割活性。cas12a酶识别富含t的原间隔基邻接基序(pam)，催化其自身的guiderna(crrna)成熟，并产生具有交错5'和3'末端的pam远端dsdna断裂，同时还会激活其切割非特性单链dna(ssdna)切割活性。cas12a-crrna复合物与互补dsdna结合时，需要依赖pam序列来识别目标序列，而与ssdna结合时，则可不依赖pam序列就能激活其切割活性。

本发明的有益效果在于：

1、本发明通过恒温扩增病原微生物核酸，操作简便，不依赖大型仪器，专业性大大降低，最大程度地降低人力物力，能够实现现场(或者居家)1小时内快速检测。

2、本发明能同时保证检测的灵敏度与特异性，缓解检测压力，及时确诊。灵敏度高，最低能检测出仅含一个拷贝的样品；特异性强，可进行多重rpa。

附图说明

图1为各实验引物组合的rpa反应的荧光图一。

图2为各实验引物组合的rpa反应的荧光图二。

图3为病毒rna样品组，空白对照组及阳性对照组的荧光检测结果。

图4为六组实验的反应管(空白对照组及五个梯度浓度的阳性对照样)的荧光检测结果。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例一

本实施例公开了用于检测新型冠状病毒的引物组，包括上游引物、下游引物、cas12a结合引物和探针，探针用于荧光检测，其序列表如表1所示。

表1.引物组序列表

实施例二

本实施例公开了一种新型冠状病毒检测试剂，包括实施例一的上游引物、下游引物、cas12a结合引物和探针，还包括含冻干酶的再水化缓冲液、反应缓冲液、cas12a、rnase抑制剂、逆转录酶、醋酸镁溶液。含冻干酶的再水化缓冲液为向含有冻干酶粉的反应管中加入再水化缓冲液混匀后得到。

本实施例中将含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入再水化缓冲液29.5μl混匀后得到，配制新型冠状病毒检测试剂。各组分具体加入量如表2所示。

表2.新型冠状病毒检测试剂含量表

上游引物的初始浓度为10umol/l，下游引物的初始浓度为10umol/l，cas12a结合引物的初始浓度为10ng/μl，探针的初始浓度为20umol/l，cas12a酶的初始浓度为1μmol/l，逆转录酶的初始浓度为100,000u/ml，各组分在试剂中的最终浓度如下：上游引物0.2μmol/l，下游引物0.2μmol/l，cas12a结合引物0.6ng/μl，探针1.2μmol/l。

本实施例的中上流引物n-rpa-forward、下游引物n-rpa-reverse为经过实验得到的有利于rpa反应检测的最佳引物组，具体实验过程如下：

根据crrna的位置设计两组引物，每组包括4条上游引物和4条下游引物，分别用质粒为模板，用上述引物进行rpa扩增。两组引物如下表3所示：

表3.实验引物序列

将表3的引物进行rpa扩增反应，反应体系的配方如下：向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入再水化缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl和无核酸酶水9.2μl混匀后，取9.67μl到pcr管中，然后向pcr管中加入上、下游引物各0.6μl(引物的终浓度均为0.48μmol/l)，阳性对照样品1μl(0.1ng/μl)，最后再加入醋酸镁溶液0.625μl(280mmol/l)。阳性对照样品为含有阳性对照的dna质粒，其序列号为seqidno.5。

rpa扩增结果如图1和图2。选出最优的引物组合为n-rpa-forward和n-rpa-reverse，即得到本发明的上游引物和下游引物。

实施例三

本实施例公开了一种新型冠状病毒检测试剂盒，包括实施例二的试剂，还包括阳性对照样品或/和空白对照样品，阳性对照样品如表4，其序列号为seqidno.5所示，空白对照样品为无核酸酶水。

表4.阳性对照样品序列表

上游引物、下游引物、cas12a结合引物、探针为实施例一的结构。冻干酶粉管、再水化缓冲液和醋酸镁溶液来源于rpa扩增试剂盒。cas12a酶来源于cas12a试剂盒。逆转录酶来源于逆转录酶试剂盒。本实施例中各试剂的型号，厂家选用如下：

rpa扩增试剂盒：basic(tabas03kit,twistdxlimited)。

逆转录酶试剂盒：iireversetranscriptase(m0368l,newenglandbiolabs)。

cas12a试剂盒：cas12anuclease(m0653t，newenglandbiolabs)。

rnase抑制剂：rnaseinhibitor，murine(m0314l,newenglandbiolabs)。

实施例四

本实施例公开了一种新冠病毒的检测方法，首先通过rna纯化试剂盒对病毒样本进行纯化，接着对纯化得到的rna样品进行逆转录和恒温扩增，将扩增好的核酸样品加入到cas12a的反应体系(即实施例二中的新型冠状病毒检测试剂)中进行鉴定，cas12a酶与cas12a结合引物序列结合后锚定到病毒目的序列，激活其单链dna切割活性，从而可将体系中带有荧光修饰的单链dna探针切断。最后将反应体系放入到切胶仪中检测荧光即可。具体步骤如下详述：

s1.提取样品rna

通过咽拭子，粪便，痰液，肺灌洗液等方法提取可能感染sars-cov-2病毒患者的样品，将样品通过qiaampviralrnaminikit(catno.:52904，qiagen)试剂盒提取rna，并进行纯化，得到rna纯化样品。

s2.恒温扩增和cas12a检测

采用实施例三的新型冠状病毒检测试剂盒配制反应体系，加入待样测的样品(sample)。待检测的样品(sample)为步骤s1得到的提取得到的rna纯化样品，或者阳性对照样品或者空白对照样品，利用上游引物和下游引物进行rpa扩增，同时cas12a酶对rpa产物进行检测，得到反应产物。本发明用于检测样品(sample)的一步法反应体系含量表如下表5所示：

表5.一步法反应体系含量表

检测样品组的反应体系按照各个组分的含量进行配制，具体配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入再水化缓冲液29.5μl混匀后，取10ul到pcr管中，然后向pcr管中加入上、下游引物各0.4μl(引物的终浓度均为0.2μmol/l)，cas12a结合引物1.2μl(cas12a结合引物的终浓度为0.6ng/μl)，探针1.2μl(探针的终浓度均为1.2μmol/l)，rnase抑制剂1.2μl，逆转录酶0.2μl，反应缓冲液2.4μl，步骤s1得到的待检测的rna纯化样品0.4μl，最后再加入醋酸镁溶液1.6μl(280mmol/l)。将上述试剂反应体系充分混匀，置于37℃的金属浴或水浴锅上反应50～60min，得到检测样品组的反应产物(rpa-cas12a产物)。

s3.荧光检测

将得到的反应产物放入切胶仪中进行荧光检测，观察检测样品组的反应管，若出现荧光，说明检测到新型冠状病毒，若未出现荧光，则说明没有检测到新型冠状病毒。

为了检测本发明检测的有效性和灵敏度，进下以下的实验验证。

1、试剂盒的有效性验证

(1)提取新型冠状病毒的rna

通过试剂盒rneasyminikit，货号为74104，qiagen提取新型冠状病毒的rna。获得的rna为模板保存于-80℃备用。

(2)恒温扩增和cas12a检测

以上述获得的rna为模板，设置病毒rna样品组，同时设置阳性对照组和空白对照组。采用上游引物和下游引物进行rpa扩增，同时进行cas12a检测得到rpa扩增产物。

病毒rna样品反应体系的配制方法如下：

向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入再水化缓冲液29.5μl混匀后，取10ul到pcr管中，然后向pcr管中加入上、下游引物各0.4μl，cas12a结合引物1.2μl，探针1.2μl，rnase抑制剂1.2μl，逆转录酶0.2μl，反应缓冲液2.4μl，步骤s1得到的新型冠状病毒的rna模板0.4μl，最后再加入醋酸镁溶液1.6μl(280mmol/l)。将上述试剂反应体系充分混匀，置于37℃的金属浴或水浴锅上反应50～60min，得到病毒rna样品组的反应产物。

空白对照组的反应体系具体配制方法与病毒rna样品反应体系类似，将新型冠状病毒的rna模板0.4μl替换为加入无核酸酶水0.4μl。将上述试剂反应体系充分混匀，置于37℃的金属浴或水浴锅上反应50～60min，得到空白对照组的反应产物。

阳性对照组的反应体系具体配制方法与检测样品组类似，将新型冠状病毒的rna模板0.4μl替换为加入阳性对照样品0.4μl(阳性对照样品的浓度为1×10⁶copies/μl)。将上述试剂反应体系充分混匀，置于37℃的金属浴或水浴锅上反应50～60min，得到阳性对照组的反应产物。

三个组别的反应体系组分和含量如表6所示。

表6.病毒rna样品组，空白对照组及阳性对照组的含量表

(3)将得到的三组反应产物的反应管放入切胶仪中进行荧光检测，结果如图3所示，空白对照组(图中a反应管)中无荧光，病毒rna样品组(图中b反应管)和阳性对照组(图中c反应管)中有荧光，从而说明了本发明提供的用于检测和/或辅助检测新型冠状病毒的引物探针组、试剂及试剂盒可以有效检测新型冠状病毒。

2、试剂盒的灵敏性验证

将新型冠状病毒的阳性对照质粒进行梯度稀释，分别稀释到10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶copies/μl的浓度。

将上述10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶copies/μl的浓度的新型冠状病毒阳性质粒为模板，分别进行检测：采用上游引物和下游引物按照本实施例中的方法进行rpa扩增，同时进行cas12a检测得到rpa扩增产物，同时设置空白对照组。并将六组实验的反应管进行编号：空白对照组为编号ntc，10²copies/μl的浓度的阳性对照组为编号r2，10³copies/μl的浓度的阳性对照组为编号r3，10⁴copies/μl的浓度的阳性对照组为编号r4，10⁵copies/μl的浓度的阳性对照组为编号r5，10⁶copies/μl的浓度的阳性对照组为编号r6。

rpa-cas12a反应结束后，将反应管取出，放入割胶仪中，打开开关，观察是否有荧光，得到结果图4。从图4可以看出，空白对照组无荧光，编号2、编号3的反应管荧光不明显，编号4-6的反应管荧光明显。本发明的检测方法灵敏度可达到200copies/μl拷贝数，与荧光量pcr灵敏度相当。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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<110>厦门大学，爱默生物科技（厦门）有限公司

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