一种分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法

本申请属于天然药物化学技术领域，具体的说涉及一种分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法。

背景技术：

灵芝自古就有“仙草”、“瑞草”之称，在古代灵芝常被人们认为可以延年益寿，灵芝营养丰富，药用价值很高，在我国已经有了超过4000年的中医药应用历史。灵芝β-葡聚糖作为灵芝中最丰富的成分之一，具有广泛的药理作用，如免疫调节、抗癌及抗炎等。灵芝β-葡寡糖是由灵芝β-葡聚糖降解得到的一系列分子量较低、水溶性较好的片段。β-葡寡糖的生物活性通常与其分子量、连接方式及聚合度等结构特征存在着较大的相关性，因此研究降解后的灵芝β-葡寡糖的活性尤为重要。由于所得灵芝β-葡寡糖的聚合度分布较广，且不同聚合度寡糖结构差异较小，导致其分离纯化较困难。

因此，需要研究开发一种高效的分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法，包括如下步骤：

(1)先向灵芝β-葡寡糖溶液中加入无水乙醇至乙醇终浓度为90％，搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清；减压浓缩除去乙醇得到glpw-a组分

(2)步骤(1)中的沉淀中加入去离子水，搅拌至完全溶解，向溶液中加入无水乙醇至乙醇终浓度为85％，搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清；减压浓缩除去乙醇得到glpw-b组分；

(3)步骤(2)中的沉淀中加入去离子水，搅拌至完全溶解，向溶液中加入无水乙醇至乙醇终浓度为80％，搅拌均匀后放置于4℃下4h，离心分离沉淀和上清，上清部分减压浓缩除去乙醇得到glpw-c组分；

(4)步骤(3)中的沉淀部分以去离子水复溶，除去乙醇冷冻干燥得到glpw-d组分；

其中，所述灵芝β-葡寡糖溶液的浓度为30-50mg/ml。

应用本发明提供的分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法得到的四种灵芝β-葡寡糖组分，可以采用高效凝胶排阻色谱、高效阴离子色谱及质谱法对分离所得片段进行分析，确认得到特定聚合度的寡糖片段。

本发明通过采用逐级醇沉法对灵芝β-葡寡糖分离纯化，利用苯酚硫酸法测定产物纯度，高效凝胶排阻色谱法测定其分子量，高效阴离子色谱和质谱分析分离产物的聚合度分布，并提供了其在体外免疫方面的活性信息，体外药理实验表明，聚合度较高的片段与dectin-1受体相结合激活细胞免疫功能的活性较强，聚合度较低的片段抗炎活性较佳，可以应用于药品或保健品中。

本发明所具有的有益效果如下：

1)通过上述逐级醇沉法分离得到的灵芝β-葡寡糖重现性好，产品质量稳定。

2)本发明得到的寡糖产物的纯度好，得率高。

3)与传统的寡糖分离纯化法相比，本发明中逐级醇沉分离法可以有效提高灵芝β-葡寡糖分离纯化的效果，得到聚合度分布较窄的寡糖片段。

4)本发明为不同聚合度寡糖片段的免疫活性评价奠定了基础。

附图说明

图1、实施例1中逐级醇沉分离灵芝β-葡寡糖产物的高效凝胶排阻色谱图。

图2、实施例2中逐级醇沉分离灵芝β-葡寡糖产物的高效阴离子色谱图。

图3、实施例3中逐级醇沉分离得到glpw-a的质谱图

图4、实施例3中逐级醇沉分离得到glpw-b的质谱图

图5、实施例3中逐级醇沉分离得到glpw-c的质谱图。

图6、实施例5中逐级醇沉分离灵芝β-葡寡糖产物增强免疫活性的测试结果

图7、实施例6中逐级醇沉分离灵芝β-葡寡糖产物的抗炎活性测试结果

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本申请，但不以任何方式限制本申请。除非另有说明，本申请中使用的试剂均为常用的商购试剂。

下列实施例中所用的灵芝β-葡寡糖是通过如下方法制备得到的：

用专利文献(cn105175575b，一种灵芝β-葡聚糖及其制备方法和用途)说明书中实施例1的方法制备得到的灵芝β-葡聚糖，配制成5mg/ml的灵芝β-葡聚糖溶液。将灵芝β-葡聚糖溶液置于微波消解仪中，设置微波功率为1000w，在140℃下降解40min，降解产物用离心机以8000rpm转速离心20分钟，取出上清液，冷冻干燥得到所需的灵芝β-葡寡糖(glpw)。

实施例1：灵芝β-葡寡糖的逐级醇沉分离纯化

称取灵芝β-葡寡糖glpw300mg加入10ml蒸馏水，配成30mg/ml的灵芝β-葡寡糖溶液，充分搅拌至溶解。

灵芝β-葡寡糖glpw的逐级醇沉分离：向溶液中缓慢加入90ml无水乙醇至乙醇终浓度为90％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清，沉淀加50ml90％(v/v)乙醇洗涤，离心取上清，重复3遍之后合并上清，减压浓缩除去乙醇得到glpw-a组分，冷冻干燥。上述沉淀加10ml去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入57ml无水乙醇至乙醇终浓度为85％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，以10000rpm离心20min，收集上清，沉淀以85％(v/v)乙醇洗涤三遍，离心合并上清，减压浓缩除去乙醇，冷冻干燥得到glpw-b组分。上述沉淀中继续加10ml去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入40ml无水乙醇至乙醇终浓度为80％(v/v)，搅拌均匀后放置于4℃下4h，离心分离沉淀和上清，沉淀采用80％(v/v)乙醇继续洗涤3次，合并上清部分，减压浓缩除去乙醇得到glpw-c组分，沉淀部分以去离子水复溶后除去乙醇冷冻干燥得到glpw-d组分。

实施例2：灵芝β-葡寡糖的逐级醇沉分离纯化

称取灵芝β-葡寡糖glpw500mg加入10ml蒸馏水，配成50mg/ml的灵芝β-葡寡糖溶液，充分搅拌至溶解。

灵芝β-葡寡糖glpw的逐级醇沉分离：向溶液中缓慢加入90ml无水乙醇至乙醇终浓度为90％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清，沉淀加50ml90％(v/v)乙醇洗涤，离心取上清重复3遍之后合并上清，减压浓缩除去乙醇得到glpw-a组分，冷冻干燥。上述沉淀加10ml去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入57ml无水乙醇至乙醇终浓度为85％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，此时溶液中已有明显沉淀生成，以10000rpm离心20min，收集上清，沉淀以85％(v/v)乙醇洗涤三遍，离心合并上清，减压浓缩除去乙醇，冷冻干燥得到glpw-b组分。上述沉淀中继续加10ml去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入40ml无水乙醇至乙醇终浓度为80％(v/v)，搅拌均匀后放置于4℃下4h，使沉淀充分析出，离心分离沉淀和上清，沉淀采用80％(v/v)乙醇继续洗涤3次，合并上清部分，减压浓缩除去乙醇得到glpw-c组分，沉淀部分以去离子水复溶后除去乙醇冷冻干燥后得到glpw-d组分。

实施例3：灵芝β-葡寡糖的逐级醇沉分离纯化

称取灵芝β-葡寡糖glpw400mg加入10ml蒸馏水，配成40mg/ml的灵芝β-葡寡糖溶液，充分搅拌至溶解。

灵芝β-葡寡糖glpw的逐级醇沉分离：向β-葡寡糖溶液中缓慢加入90ml无水乙醇至乙醇终浓度为90％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清，沉淀加50ml90％(v/v)乙醇洗涤，离心取上清重复3遍之后合并上清，减压浓缩除去乙醇得到glpw-a组分，冷冻干燥。上述沉淀加10ml去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入57ml无水乙醇至乙醇终浓度为85％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，此时溶液中已有明显沉淀生成，以10000rpm离心20min，收集上清，沉淀以85％(v/v)乙醇洗涤三遍，离心合并上清，减压浓缩除去乙醇，冷冻干燥得到glpw-b组分。上述沉淀中继续加10ml去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入40ml无水乙醇至乙醇终浓度为80％(v/v)，搅拌均匀后放置于4℃下4h，使沉淀充分析出，离心分离沉淀和上清，沉淀采用80％(v/v)乙醇继续洗涤3次，合并上清部分，减压浓缩除去乙醇得到glpw-c组分，沉淀部分以去离子水复溶后除去乙醇冷冻干燥后得到glpw-d组分。

实验例4：灵芝β-葡寡糖的逐级醇沉分离纯化产物的分析

取实施例1中制备得到的glpw-a、glpw-b、glpw-c、glpw-d四种组分进行如下试验。

1.测定方法

1.1组分得率测定

各组分得率基于以下进行计算：y＝a1/a2×100％，式中：a1为组分干燥后质量；a2为投入醇沉分离样品的总质量；y为得率(％)

1.2苯酚硫酸法测定糖含量

标准曲线的测定：称取10mg葡萄糖加至100ml容量瓶中定容至刻度，配制成0.1mg/ml葡萄糖标准液，准确吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml，加水补足至1ml，分别加0.5ml5％的苯酚、2.5ml浓硫酸，混合均匀后，100℃水浴加热15min，490nm处检测紫外-可见吸光度。以紫外吸光度对葡萄糖标准溶液浓度作图，得葡萄糖浓度标准曲线及回归方程。

样品糖含量测定：分别称取1.0mg样品加入10ml超纯水配制成0.1mg/ml样品溶液，准确吸取1ml加入5％苯酚0.5ml，浓硫酸2.5ml，混合均匀后，100℃水浴加热15min，冷却至室温，490nm处检测紫外-可见吸光度。根据葡萄糖标准曲线回归方程计算样品糖含量。

1.3高效凝胶排阻色谱法测定产物分子量

分别称取5mg获得的寡糖片段glpw-a、glpw-b、glpw-c、glpw-d，加入1ml超纯水，采用高效凝胶排阻色谱对分子量进行测定。

具体条件为：示差检测器，色谱柱：tsk-gel系列g3000pwxl和g2500pwxl(7.8mm×300mm，日本tosoh公司)串联，流动相：0.15mol/l硝酸钠，0.05mol/l磷酸二氢钠，0.02％叠氮钠；柱温：30℃；流速：0.5ml/min；上样量：100μl

1.4高效阴离子色谱法分析降解产物组成

取上述5mg/ml寡糖溶液分别用超纯水稀释10倍，取1ml以高效阴离子色谱分析产物组成。

具体条件为：色谱柱：carbopac^tmpa-100柱(4mm×250mm，美国dionex公司)，洗脱液：流动相a：150mmol/l氢氧化钠；流动相b：150mmol/lnaoh和500mmol/l醋酸钠；柱温和脉冲安培检测器的温度维持在30℃；进样量：25μl。梯度洗脱程序如下：0-5min，a/b，90/10(v/v)；5-30min，a/b，80/20(v/v)；30-30.1min，a/b，30/70(v/v)；30.1-40min，a/b，0/100(v/v)；40-45min，a/b，90/10(v/v)。

1.5质谱法分析产物的聚合度分布

取1μl待测样品与1μl基质混合均匀，吸取1μl混合液置于干净的maldi点样板上，室温条件下等待溶剂挥发后置于质谱系统中。

具体条件为：正离子模式；基质为：dhb基质(10mg/ml的2,5-二羟基苯甲酸溶于0.1％的tfa中)；扫描分子量范围：200-4000g/mol。

2.分离后寡糖片段的测定结果

根据上述测定结果，对实施例1制备的各分子量段的灵芝β-葡寡糖分别进行测定，分离产物的得率及含量结果如表1所示，各组分的糖含量及得率均较高，其中glpw-b、glpw-c、glpw-d组分的糖含量均高于90％以上，表明分离过程中无明显杂质引入，且过程中寡糖损失较少。

对各片段的分子量特征进行分析，结果如表2所示，分离产物的聚合度特征如图1-5所示，可知所得的灵芝β-葡寡糖片段glpw-a、glpw-b、glpw-c、glpw-d在高效凝胶排阻色谱及阴离子色谱中的出峰时间表现出明显的差异，尽管各组分之间聚合度分布仍有交叉，但总体达到了分离效果，对其聚合度进行分析，其中glpw-a的平均分子量分别为1608.64g/mol，203.98g/mol，主要片段的聚合度为2-14；glpw-b的平均分子量为2726.24g/mol，主要片段的聚合度为6-21；glpw-c的平均分子量分别为1.19×10⁴g/mol，4417.05g/mol，主要片段的聚合度为11-24；glpw-d组分已经超过阴离子色谱柱的分离范围，表明组分的聚合度较高，高效凝胶排阻色谱法测得其平均分子量分别为1.34×10⁴g/mol，6594.47g/mol。质谱结果与液相及阴离子色谱的结果相符，均表明醇沉分离达到了对灵芝β-葡寡糖glpw粗分离为段的效果。

表1逐级醇沉产物的含量测定

表2醇沉分离产物的分子量特征

实验例5：寡糖片段体外激活免疫活性分析

1.样品的配制

精密称取样品约5mg，加入定量的无菌水溶液使其充分溶解后，以0.22μm的无菌水相滤膜除菌，稀释成一系列浓度备用。

2.细胞培养

hek-bluehdectin-1a细胞(购自invivogen公司)在含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/mlnormocin的dmem完全培养基(美国gibco公司)中，37℃、含5％co2条件下培养两代转入选择培养基(50mldmem完全培养基中含200mlhek-blueclrselection(美国invitrogen公司))，培养至对数生长期，计数并用检测培养基(hek-bluedetection溶于50ml无菌水中)稀释成3×10⁵个/ml的细胞液，每孔加入180μl细胞悬液和20μl不同浓度的样品(10μg/ml、50μg/ml、200μg/ml)，以20μl无菌水为阴性对照，以20μl作用浓度为100μg/ml的硬葡聚糖(法国elicityl-oligotech公司)为阳性对照，共同培养24h，在630nm处测定吸光度值。

3.实验结果

特定聚合度寡糖片段的体外刺激细胞增强免疫活性的测试结果如图6所示，较低聚合度的寡糖片段的免疫活性基本消失，而大分子量的寡糖片段表现出明显的活性，这表明样品与dectin-1受体结合增强免疫的活性与其聚合度存在着较大的关系，总体来讲聚合度越大，免疫活性越好。

实验例6：寡糖片段体外抗炎活性分析

1.样品的配制

精密称取样品约5mg，加入定量的无菌水溶液使其充分溶解后，以0.22μm的无菌水相滤膜除菌，稀释成一系列浓度(10μg/ml、50μg/ml、200μg/ml)备用。

2.thp-1细胞培养及巨噬细胞的诱导

细胞株thp-1(购自中国科学院上海细胞库)在含10％胎牛血清，1％青霉素、链霉素和0.5％β-巯基乙醇的rpmi1640完全培养基(美国gibco公司)中，37℃、含5％co2条件下培养到对数期后，计数并用无色1640培养基(美国gibco公司)稀释成5×10⁵个/ml的细胞液。将细胞液按照每孔199μl的体积转入96孔板中，加入1μl6μg/mlpma(美国sigma公司)处理40h诱导细胞成巨噬细胞。

3.thp-1细胞诱导的巨噬细胞上清液中tnf-α含量的测定及比较

将上述诱导成巨噬细胞的培养液上清弃去，每孔加入160μl的rpmi-1640培养基、20μl作用浓度为50ng/ml的lps和20μl不同浓度的样品液，共同培养24h后取上清，利用北京四正柏公司的tnf-α测定用elisa试剂盒测定上清液中tnf-α的含量。

4.实验结果

特定聚合度寡糖片段的体外抗炎活性测试结果如图7所示，较低聚合度的寡糖片段的抗炎能力明显高于较高聚合度的寡糖片段。此外除glpw-b组分，其余片段随着样品作用浓度的增加，抗炎活性不断增强，呈现出剂量依赖。

在对寡糖片段的体外免疫活性研究中发现，分离后的片段中聚合度较高的glpw-d片段刺激dectin-1细胞的免疫活性最好，而较低聚合度的寡糖片段glpw-a表现出较好的体外抗炎活性。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。