一种pFnCpfAb/pCrAb双质粒系统及其应用

一种pfncpfab/pcrab双质粒系统及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种pfncpfab/pcrab双质粒系统及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.鲍曼不动杆菌是一种极具危害的人类机会致病菌，能够引发一系列严重的感染性疾病，对人类健康造成重大威胁。近些年来，随着抗生素的广泛使用，多重耐药(multi
‑
drug resistant,mdr)、泛耐药(extensively
‑
drug resistant,xdr)甚至全耐药(pan
‑
drug resistant,pdr)的鲍曼不动杆菌菌株不断出现，由其造成的病人严重感染及死亡病例与日俱增，强调了耐药型鲍曼不动杆菌引发人类感染的严重性和开发新型治疗手段的重要性。
3.新型治疗手段的开发离不开筛选新的药物靶标，而药物靶标的筛选离不开便捷的基因组编辑操作。目前用于鲍曼不动杆菌基因组编辑的方法主要包括非复制许可质粒法、外源重组酶法、cbe单碱基编辑法和crispr
‑
cas9基因组编辑法。其中非复制许可质粒法和外源重组酶法属于传统遗传操作工具，具有操作较为复杂、实验周期较长、基因敲除效率不高、难以实现精确无痕基因组编辑等缺点；cbe单碱基编辑法可以将靶点编辑窗口中的胞嘧啶碱基(c)转变为胸腺嘧啶碱基(t)，但无法实现基因的删除和插入；crispr
‑
cas9基因组编辑法虽然可以实现鲍曼不动杆菌的精确无痕基因组编辑，但受限于来自酿脓链球菌cas9核酸酶自身的性质，该系统只能识别20bp靶点邻近3’端序列为ngg(n代表a/t/g/c任一碱基)的pam位点，限制了该系统在鲍曼不动杆菌基因组中的靶点选择范围。
4.2015年报道的crispr
‑
cpf1系统是一种比crispr
‑
cas9系统更新的基因组编辑工具，与crispr
‑
cas9系统工作原理类似，但具有一些独有的特点。crispr
‑
cpf1系统由cpf1核酸酶和crrna两部分组成。其中crrna长度仅为42
‑
44个核苷酸，更有利于多基因编辑。cpf1核酸酶识别的pam位点为邻近靶点5’端富含胸腺嘧啶碱基(t)的序列，且可识别的靶点长度可变，这与crispr
‑
cas9系统相比能够极大拓展靶点的选择范围。目前主要使用的crispr
‑
cpf1工具有三种来源，分别来自新凶手弗朗西斯菌(francisella novicida)u112菌株、氨基酸球菌(acidaminococcus sp.)bv3l6菌株和毛螺科菌(lachnospiraceae bacterium)nd2006菌株，其中来自新凶手弗朗西斯菌(francisella novicida)u112菌株的cpf1核酸酶(以下简称fncpf1)具有最广的pam位点识别范围，能够有效提升该系统在目标基因组中的靶点选择范围。
5.crispr
‑
cpf1系统已经在多种真核和原核生物中实现了高效率的基因组编辑，如哺乳动物细胞、玉米、小麦、酵母和谷氨酸棒杆菌等。然而，现有的crispr
‑
cpf1工具具有较大局限性，尚不能直接应用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是：现有的crispr
‑
cpf1工具具有较大局限性，尚不能直接应用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种pfncpfab/pcrab双质粒系统，包含序
列为seq id no：1的pfncpfab
‑
apr质粒和序列为seq id no：2的pcrab
‑
km质粒，所述pfncpfab
‑
apr质粒能够表达fncpf1核酸酶和recab重组酶，所述pcrab
‑
km质粒能够表达crrna。
8.优选地，所述pfncpfab
‑
apr质粒包含fncpf1基因片段、recab重组酶系统、laci半乳糖诱导型启动子阻遏蛋白和革兰氏阴性菌管宿主复制子rsf1010；所述pcrab
‑
km质粒包含基因crrna、具有自切割活性的核酶hdv、用于后续插入靶点序列的位点bsai_spacer、大肠杆菌质粒复制子rep和鲍曼不动杆菌质粒复制子wh1266\origin。
9.优选地，所述pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒均包含蔗糖敏感筛选标记基因sacb。
10.本发明还提供了上述pfncpfab/pcrab双质粒系统在鲍曼不动杆菌中进行基因组编辑的应用。
11.优选地，所述应用包括在制备基因组编辑工具和/或基因组编辑试剂盒中的应用。
12.优选地，所述的基因组编辑包括敲除uspa基因。
13.优选地，所述的基因组编辑的pam位点的序列为ttn序列和/或ctv序列，所述ttn序列中的n为任一碱基，所述ctv序列中的v为除碱基t之外的任一碱基，所述的基因组编辑的靶点序列长度为19
‑
25nt。
14.本发明还提供了一种细胞，包含上述pfncpfab/pcrab双质粒系统中的任一质粒或两种质粒。
15.本发明还提供了一种菌株，包含上述pfncpfab/pcrab双质粒系统中的任一质粒或两种质粒。
16.优选地，所述菌株为大肠杆菌top10菌株，所述的大肠杆菌top10菌株包含pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒，其保藏编号为：cctcc m 2021056。
17.本发明的含有pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒的大肠杆菌top10菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichia coli top10；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2021年1月14日，保藏号为：cctcc m 2021056。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
19.1.本发明通过分子生物学操作，对现有的crispr
‑
cpf1系统进行探索和改造，构建的pfncpfab/pcrab双质粒系统能够适用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑，极大地扩展了鲍曼不动杆菌基因组编辑位点的选择范围，从而能够促进药物靶标的筛选和新药研发的加快。
20.2.本发明的pfncpfab/pcrab双质粒系统在鲍曼不动杆菌中能够高效识别ttn(n代表t/a/g/c任一碱基)和ctv(v代表a/g/c任一碱基)序列作为pam位点，且能高效识别长度在19
‑
25nt的靶点序列，从而在鲍曼不动杆菌中实现高效、无痕的基因组编辑操作。
附图说明
21.图1为pfncpfab/pcrab双质粒系统结构组成图；
22.其中，图1a为pfncpfab
‑
apr质粒图谱，fncpf1：fncpf1核酸酶表达基因，recab：recab重组酶表达基因，sacb：蔗糖敏感筛选标记基因(用于后续质粒消除)，aprr：阿泊拉霉素抗性蛋白表达基因，rsf1010：革兰氏阴性菌广宿主质粒复制子，laci：半乳糖诱导型启动
子阻遏蛋白；
23.图1b为pcrab
‑
km质粒图谱，wh1266\origin：鲍曼不动杆菌质粒复制子，sacb：蔗糖敏感筛选标记基因(用于后续质粒消除)，j23119：组成型启动子，crrna：fncpf1核酸酶识别的引导序列，bsai_spacer：用于后续插入靶点序列的位点，hdv：具有自切割活性的核酶(用于后续crrna的自加工成熟)，metzwv：基因转录终止子，rep(pmb1)：大肠杆菌质粒复制子，kmr：卡那霉素抗性基因；
24.图2为在鲍曼不动杆菌中筛选fncpf1核酸酶可高效识别的pam位点序列，其中，左图为在oxyr基因中的筛选结果，右图为在adeb基因中的筛选结果；
25.图3为在鲍曼不动杆菌中筛选fncpf1核酸酶可高效识别的靶点序列长度，其中左图为在oxyr基因中的筛选结果，右图为在hscb基因中的筛选结果；
26.图4为利用pfncpfab/pcrab双质粒系统在鲍曼不动杆菌中敲除uspa基因；其中，a为uspa基因敲除的菌落pcr验证结果图，敲除成功率为6/7；b为uspa基因敲除菌株的dna测序结果比对。
具体实施方式
27.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
28.以下各实施例中，使用的生物材料来源如下：
29.pcasab质粒购自美国addgene公司，货号：121998；psgab质粒购自美国addgene公司，货号：121999；puc57
‑
fncpf1
‑
amp质粒购自金唯智生物科技有限公司，基因合成；鲍曼不动杆菌atcc17978菌株购自美国atcc公司，货号：atcc17978；大肠杆菌top10菌株感受态细胞购自上海吐露港生物科技有限公司，货号：cc96105
‑
01；含有pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒的大肠杆菌top10菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichia coli top10；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2021年1月14日，保藏号为：cctcc m 2021056。
30.各实施例中使用的lb液体培养基为预混lb液体培养基(干粉)按使用说明掺入一定比例蒸馏水后配置而成，预混lb液体培养基(干粉)购自北京索莱宝科技有限公司，货号：l1010；各实施例中使用的lb固体培养基为lb液体培养基添加1.5％琼脂粉配置而成，琼脂粉购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a505255
‑
0250；阿泊拉霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a600090
‑
0001；卡那霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a506636
‑
0025。
31.实施例1
32.pfncpfab
‑
apr质粒的构建：
33.(1)通过pcr反应从pcasab质粒中分别扩增得到backbone片段和sacb基因片段，其中，用于扩增backbone片段的pcr引物序列为：
34.pat
‑
bb
‑
f：5
’‑
ggttcatgtgcagctccatca
‑3’
(seq id no：3)
35.pat
‑
bb
‑
r：5
’‑
ggatccagggttattgtctcatg
‑3’
(seq id no：4)
36.使用诺唯赞公司的2
×
phanta max master mix对上述backbone片段进行扩增，反应体系为：25μl 2
×
phanta max master mix，1μl pcasab质粒模板(1ng/μl)，2μl pat
‑
bb
‑
f(10μm)，2μl pat
‑
bb
‑
r(10μm)，20μl ddh2o。反应体系配置完成后在pcr仪中执行扩增反
应，扩增参数为：95℃预变性30s；之后95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸5min，共30个循环；接着72℃完全延伸5min；最后12℃保温。
37.扩增反应完成后，使用宝日医生物技术(北京)有限公司的quickcut
tm dpni限制性内切酶消除pcr反应体系中的pcasab质粒模板，具体操作为：在扩增完成的pcr反应体系中加入1μl quickcut
tm dpni，使用移液器吹吸混匀并短暂离心后置于37℃的恒温培养箱中反应消化0.5
‑
1h。接着，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对上述反应产物进行纯化回收，操作步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。纯化回收的backbone片段置于
‑
20℃冰箱中保存。
38.其中，用于扩增sacb基因片段的pcr引物序列为：
39.sacb
‑
f：5
’‑
gagacaataaccctggatccgcaactttatgcccatgcaac
‑3’
(seq id no：5)
40.sacb
‑
r：5
’‑
gatggagctgcacatgaaccgtatccgtgaattgacgcgtatt
‑3’
(seq id no：6)
41.使用诺唯赞公司的2
×
phanta max master mix对sacb基因片段进行扩增，反应体系为：25μl 2
×
phanta max master mix，1μl pcasab质粒模板(1ng/μl)，2μl sacb
‑
f(10μm)，2μl sacb
‑
r(10μm)，20μl ddh2o。反应体系配置完成后在pcr仪中执行扩增反应，扩增参数为：95℃预变性30s；之后95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；接着72℃完全延伸5min；最后12℃保温。
42.扩增反应完成后，使用宝日医生物技术(北京)有限公司的quickcut
tm dpni限制性内切酶消除pcr反应体系中的pcasab质粒模板，具体操作为：在扩增完成的pcr反应体系中加入1μl quickcut
tm dpni，使用移液器吹吸混匀并短暂离心后置于37℃的恒温培养箱中反应消化0.5
‑
1h。接着，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对上述反应产物进行纯化回收，操作步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。纯化回收的sacb基因片段置于
‑
20℃冰箱中保存。
43.(2)通过gibson无缝克隆方法将步骤(1)获得的backbone片段和sacb基因片段组装成一个环状质粒，命名为pat
‑
sacb质粒。
44.使用翊圣生物科技(上海)有限公司的一步法快速克隆试剂盒进行上述两个片段的组装，反应体系为：10μl 2
×
hieff clone enzyme premix，4μl backbone片段(25ng/μl),2μl sacb基因片段(80ng/μl),4μl ddh2o。反应体系配置完成后在pcr仪中执行gibson无缝克隆反应，反应参数为：50℃温育20min，然后将反应管置于冰上冷却5min。
45.取10μl上述无缝克隆产物加入到100μl大肠杆菌top10感受态细胞(上海吐露港生物科技有限公司)中进行热激转化，转化步骤参照感受态细胞附带的操作说明书进行。转化结束后取100l复苏液在含有浓度为100μg/ml阿泊拉霉素的lb固体培养基平板上涂布，待复苏液被固体培养基吸收后，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜直至单菌落长出。用无菌接种环随机挑取几个单菌落分别接种至5ml含有浓度为100μg/ml阿泊拉霉素的lb液体试管中，将试管斜置于37℃的恒温摇床中振荡培养过夜。使用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒提取质粒，提取步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。提取的质粒送至北京擎科新业生物技术有限公司进行dna测序验证，正确的质粒即为pat
‑
sacb质粒，可用于下一步质粒构建。
46.(3)委托金唯智生物科技有限公司按照鲍曼不动杆菌的密码子偏好性合成fncpf1基因，然后将该基因克隆到公司载体库中的puc57
‑
amp质粒的ecorv酶切位点处，获得
puc57
‑
fncpf1
‑
amp质粒。puc57
‑
amp质粒原始序列参见金唯智生物技术有限公司网站。合成的fncpf1基因序列如下(seq id no：7)：
[0047]5’‑
gggcttatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattcatgtccatctaccaagagtttgtgaataaatactccctgtccaagaccctccgttttgagctgatcccccaaggcaagaccctcgaaaacatcaaggcacgcggcctcatcctggatgacgaaaagcgcgctaaggattacaagaaggcaaagcagatcatcgacaagtaccaccagttcttcatcgaagagatcctgtcctccgtgtgcatctccgaggacctgctccagaactactccgatgtctacttcaagctcaagaagtccgatgacgataacctgcagaaggacttcaagtccgctaaggataccatcaagaagcagatctccgaatacatcaaggattccgagaagttcaagaacctcttcaaccagaacctgatcgacgcaaagaagggccaggaatccgatctcatcctgtggctcaagcagtccaaggataacggcatcgagctcttcaaggccaactccgacatcaccgacatcgatgaagctctggagatcatcaagtccttcaagggctggaccacctacttcaagggcttccacgaaaaccgcaagaacgtgtactcctccaacgatatcccaacctctatcatctaccgcatcgtcgacgataacctgccaaagttcctcgaaaacaaggcaaagtacgagtccctgaaggataaggccccagaagctatcaactacgagcagatcaagaaggacctggccgaagagctcaccttcgacatcgattacaagacctctgaagtgaaccagcgcgtcttctccctcgatgaagtgttcgagatcgccaacttcaacaactacctgaaccagtccggcatcaccaagttcaacaccatcatcggcggcaagttcgtcaacggcgaaaacaccaagcgcaagggcatcaacgagtacatcaacctctactcccagcagatcaacgataagaccctgaagaagtacaagatgtccgtgctcttcaagcagatcctgtccgacaccgaatccaagtccttcgtcatcgacaagctggaggacgattccgatgtggtcaccaccatgcagtccttctacgaacagatcgcagccttcaagaccgtggaagagaagtccatcaaggagaccctctccctgctcttcgacgatctgaaggctcagaagctggatctctccaagatctacttcaagaacgacaagtccctgaccgatctctcccagcaggtcttcgacgattactccgtgatcggcaccgcagtcctggaatacatcacccagcagatcgccccaaagaacctcgataacccatccaagaaggaacaggagctgatcgccaagaagaccgaaaaggctaagtacctgtccctcgagaccatcaagctggctctcgaagagttcaacaagcaccgcgacatcgataagcagtgccgcttcgaagagatcctcgcaaacttcgctgcaatcccaatgatcttcgacgaaatcgcacagaacaaggataacctggcccagatctccatcaagtaccagaaccagggcaagaaggatctgctccaggcctccgctgaggacgatgtgaaggcaatcaaggacctgctcgatcagaccaacaacctgctccacaagctgaagatcttccacatctcccagtccgaagacaaggccaacatcctcgacaaggatgagcacttctacctggtgttcgaagagtgctacttcgaactcgctaacatcgtcccactgtacaacaagatccgcaactacatcacccagaagccatactccgatgaaaagttcaagctcaacttcgagaactccaccctggcaaacggctgggacaagaacaaggaaccagataacaccgccatcctcttcatcaaggacgataagtactacctgggcgtgatgaacaagaagaacaacaagatcttcgacgataaggccatcaaggaaaacaagggcgagggctacaagaagatcgtgtacaagctgctcccaggcgctaacaagatgctcccaaaggtcttcttctccgcaaagtccatcaagttctacaacccatccgaagatatcctgcgcatccgcaaccactccacccacaccaagaacggctccccacagaagggctacgaaaagttcgagttcaacatcgaagactgccgcaagttcatcgatttctacaagcagtccatctccaagcacccagagtggaaggacttcggcttccgcttctccgatacccagcgctacaactccatcgatgaattctaccgcgaagtggagaaccagggctacaagctgaccttcgaaaacatctccgagtcctacatcgattccgtggtcaaccagggcaagctgtacctcttccagatctacaacaaggacttctccgcttactccaagggccgcccaaacctgcacaccctctactggaaggcactcttcgacgaacgcaacctgcaggatgtggtctacaagctcaacggcgaagcagagctgttctaccgcaagcagtccatcccaaagaagatcacccacccagccaaggaagc
aatcgccaacaagaacaaggataacccaaagaaggaatccgtgttcgagtacgacctgatcaaggataagcgcttcaccgaggacaagttcttcttccactgcccaatcaccatcaacttcaagtcctccggcgccaacaagttcaacgatgaaatcaacctgctcctgaaggagaaggctaacgacgtgcacatcctgtccatcgatcgcggcgaacgccacctcgcctactacaccctggtcgacggcaagggcaacatcatcaagcaggacaccttcaacatcatcggcaacgatcgcatgaagaccaactaccacgacaagctggccgctatcgagaaggaccgcgattccgctcgcaaggattggaagaagatcaacaacatcaaggaaatgaaggaaggctacctctcccaggtggtccacgaaatcgctaagctggtgatcgagtacaacgcaatcgtggtcttcgaagacctgaacttcggcttcaagcgcggccgcttcaaggtggagaagcaggtctaccagaagctggaaaagatgctcatcgagaagctgaactacctcgtgttcaaggacaacgaattcgataagaccggcggcgtcctccgtgcataccagctgaccgccccattcgagaccttcaagaagatgggcaagcagaccggcatcatctactacgtgccagctggcttcacctctaagatctgcccagtgaccggcttcgtcaaccagctctacccaaagtacgaatccgtctccaagtcccaggagttcttctccaagttcgacaagatctgctacaacctggataagggctacttcgaattctccttcgactacaagaacttcggcgataaggcagccaagggcaagtggaccatcgcatccttcggctcccgcctcatcaacttccgcaactccgacaagaaccacaactgggatacccgcgaagtgtacccaaccaaggaactggagaagctcctgaaggattactccatcgaatacggccacggcgagtgcatcaaggctgcaatctgcggcgaatccgacaagaagttcttcgcaaagctgacctctgtgctcaacaccatcctgcagatgcgcaactccaagaccggcaccgagctggattacctcatctccccagtggccgacgtcaacggcaacttcttcgattcccgccaggctccaaagaacatgccacaggacgctgatgcaaacggcgcctaccacatcggtctgaagggtctcatgctcctgggtcgcatcaagaacaaccaggaaggcaagaagctgaatctcgtcattaagaacgaagaatactttgaatttgtccagaaccgcaataactaagtcgacctgcaggcatgc
‑3’
[0048]
(4)通过pcr反应从puc57
‑
fncpf1
‑
amp质粒中扩增得到fncpf1基因片段，用于扩增fncpf1基因片段的pcr引物序列为：
[0049]
fncpf1
‑
f：5
’‑
gagacaataaccctggatccgggcttatcgactgcacg
‑3’
(seq id no：8)
[0050]
fncpf1
‑
r：5
’‑
tgggcataaagttgcgcatgcctgcaggtcga
‑3’
(seq id no：9)
[0051]
使用诺唯赞公司的2
×
phanta max master mix对上述fncpf1基因片段进行扩增，反应体系为：25μl 2
×
phanta max master mix，1μl puc57
‑
fncpf1
‑
amp质粒模板(1ng/μl)，2μl fncpf1
‑
f(10μm)，2μl fncpf1
‑
r(10μm)，20μl ddh2o。反应体系配置完成后在pcr仪中执行扩增反应，扩增参数为：95℃预变性30s；之后95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸2min30s，共30个循环；接着72℃完全延伸5min；最后12℃保温。
[0052]
扩增反应完成后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对上述pcr反应产物进行纯化回收，操作步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。纯化回收的fncpf1基因片段置于
‑
20℃冰箱中保存。
[0053]
(5)对pat
‑
sacb质粒进行单酶切，使其由环状质粒dna转变为线性dna片段。
[0054]
使用宝日医生物技术(北京)有限公司的quickcut
tm bamhi限制性内切酶切割pat
‑
sacb质粒，反应体系为：10μl pat
‑
sacb质粒(100ng/μl)，1μl quickcut
tm bamhi，5μl 10
×
quickcut buffer，34μl ddh2o。反应体系配置完成后置于37℃的恒温培养箱中反应1h。接着，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对上述酶切反应产物进行纯化回收，操作步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。纯化回收的线性化pat
‑
sacb质粒dna片段置于
‑
20℃冰箱中保存。
[0055]
(6)通过gibson无缝克隆方法将步骤(4)获得的fncpf1基因片段和步骤(5)获得的
线性化pat
‑
sacb质粒dna片段组装成一个环状质粒，命名为pfncpfab
‑
apr质粒。
[0056]
使用翊圣生物科技(上海)有限公司的一步法快速克隆试剂盒进行上述两个片段的组装，反应体系为：10μl 2
×
hieff clone enzyme premix，6μl线性化pat
‑
sacb质粒dna片段(20ng/μl),1μl fncpf1基因片段(100ng/μl),3μlddh2o。反应体系配置完成后在pcr仪中执行gibson无缝克隆反应，反应参数为：50℃温育20min，然后将反应管置于冰上冷却5min。
[0057]
取10μl上述无缝克隆产物加入到100μl大肠杆菌top10感受态细胞(上海吐露港生物科技有限公司)中进行热激转化，转化步骤参照感受态细胞附带的操作说明书进行。转化结束后取100μl复苏液在含有浓度为100μg/ml阿泊拉霉素的lb固体培养基平板上涂布，待复苏液被固体培养基吸收后，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜直至单菌落长出。用无菌接种环随机挑取几个单菌落分别接种至5ml含有浓度为100μg/ml阿泊拉霉素的lb液体试管中，将试管斜置于37℃的恒温摇床中振荡培养过夜。使用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒提取质粒，提取步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。提取的质粒送至北京擎科新业生物技术有限公司进行dna测序验证，正确的质粒即为构建成功的pfncpfab
‑
apr质粒，pfncpfab
‑
apr质粒的组成如图1a所示，包含fncpf1基因片段、阿泊拉霉素抗性蛋白表达基因aprr、recab重组酶系统、laci
‑
tac半乳糖诱导系统和革兰氏阴性菌管宿主复制子rsf1010，pfncpfab
‑
apr质粒的序列如seq id no：1所示，长度为16375bp。
[0058]
该pfncpfab
‑
apr质粒的特征在于是一种革兰氏阴性菌广宿主质粒，能够在包括大肠杆菌和鲍曼不动杆菌在内的多种革兰氏阴性细菌中复制传代；该质粒具有阿泊拉霉素抗性，能够用于宿主菌的筛选；该质粒能够在鲍曼不动杆菌在中经半乳糖或其类似物(如：tptg)的诱导后表达fncpf1核酸酶和recab重组酶，用于基因组dna切割和断裂dna的重组修复；该质粒含有蔗糖敏感筛选标记基因sacb，用于鲍曼不动杆菌基因组编辑完成后pfncpfab
‑
apr质粒的消除。
[0059]
实施例2
[0060]
pcrab
‑
km质粒的构建：
[0061]
(1)委托金唯智生物科技有限公司通过minigene方式合成crrna表达基因，该基因序列如下所示(seq id no：10)：
[0062]5’‑
ttgacagctagctcagtcctaggtataatactagtaatttctactgttgtagatcgagaccattggtctcaggccggcatggtcccagcctcctcgctggcgccggctgggcaacatgcttcggcatggcgaatgggacccaattattgaacaccctaacgggtgtttttttgtttctggtctacc
‑3’
(2)以合成的crrna表达基因为模板，通过pcr反应扩增得到大量含重叠接头的crrna基因片段。用于扩增含重叠接头的crrna基因片段的pcr引物序列为：
[0063]
crrna
‑
f：5
’‑
ataaagttgcaagcttgacagctagctcagtcctagg
‑3’
(seq id no：11)
[0064]
crrna
‑
r：5
’‑
cgggctgcaggaattcggtagaccagaaacaaaaaaacacc
‑3’
(seq id no：12)
[0065]
使用诺唯赞公司的2
×
phanta max master mix对上述crrna基因片段进行扩增，反应体系为：25μl 2
×
phanta max master mix，1μl合成crrna表达基因模板(1ng/μl)，2μl crrna
‑
f(10μm)，2μl crrna
‑
r(10μm)，20μl ddh2o。反应体系配置完成后在pcr仪中执行扩增反应，扩增参数为：95℃预变性30s；之后95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸20s，共30个循环；接着72℃完全延伸5min；最后12℃保温。
[0066]
扩增反应完成后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒对上述反应产物进行纯化回收，操作步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。纯化回收的含重叠接头的crrna基因片段置于
‑
20℃冰箱中保存。
[0067]
(3)对psgab质粒进行双酶切，切除质粒中的sgrna表达基因片段，纯化回收质粒骨架片段。使用宝日医生物技术(北京)有限公司的quickcut
tm hindiii和quickcut
tm ecori两种限制性内切酶同时切割psgab质粒，反应体系为：10μl psgab质粒(100ng/μl)，1μl quickcut
tm hindiii，1μl quickcut
tm ecori，5μl 10
×
quickcut buffer，33μl ddh2o。
[0068]
反应体系配置完成后置于37℃的恒温培养箱中反应1h。接着，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式dna胶回收试剂盒对上述酶切反应产物中的质粒骨架片段进行纯化回收，操作步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。纯化回收的psgab质粒骨架片段置于
‑
20℃冰箱中保存。
[0069]
(4)通过gibson无缝克隆方法将步骤(2)获得的crrna基因片段和步骤(3)获得的psgab质粒骨架片段组装成一个环状质粒，命名为pcrab
‑
km质粒。
[0070]
使用翊圣生物科技(上海)有限公司的一步法快速克隆试剂盒进行上述两个片段的组装，反应体系为：10μl 2
×
hieff clone enzyme premix，2μl psgab质粒骨架片段(40ng/μl),1μl crrna基因片段(60ng/μl),7μl ddh2o。反应体系配置完成后在pcr仪中执行gibson无缝克隆反应，反应参数为：50℃温育20min，然后将反应管置于冰上冷却5min。
[0071]
取10μl上述无缝克隆产物加入到100μl大肠杆菌top10感受态细胞(上海吐露港生物科技有限公司)中进行热激转化，转化步骤参照感受态细胞附带的操作说明书进行。转化结束后取100μl复苏液在含有浓度为50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板上涂布，待复苏液被固体培养基吸收后，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜直至单菌落长出。用无菌接种环随机挑取几个单菌落分别接种至5ml含有浓度为50μg/ml卡那霉素的lb液体试管中，将试管斜置于37℃的恒温摇床中振荡培养过夜。使用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒提取质粒，提取步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。提取的质粒送至北京擎科新业生物技术有限公司进行dna测序验证，正确的质粒即为构建成功的pcrab
‑
km质粒，pcrab
‑
km质粒的组成如图1b所示，包含鲍曼不动杆菌质粒复制子wh1266\origin、蔗糖敏感筛选标记基因sacb(用于后续质粒消除)、组成型启动子j23119、fncpf1核酸酶识别的引导序列crrna基因片段、具有自切割活性的核酶hdv(用于后续crrna的自加工成熟)、基因转录终止子metzwv，大肠杆菌质粒复制子rep(pmb1)和卡那霉素抗性基因kmr；pcrab
‑
km质粒的序列如seq id no：2所示，长度为6110bp。含有正确pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒的大肠杆菌top10菌株已进行微生物保藏，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2021年1月14日，保藏号为：cctcc m 2021056。
[0072]
该pcrab
‑
km质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中复制传代；该质粒具有卡那霉素抗性，能够用于宿主菌的筛选；该质粒能够在鲍曼不动杆菌中表达含人工插入spacer序列的crrna，用于引导fncpf1核酸酶正确定位到鲍曼不动杆菌基因组的正确靶点位置；该质粒含有蔗糖敏感筛选标记基因sacb，用于鲍曼不动杆菌基因组编辑完成后pcrab
‑
km质粒的消除。
[0073]
实施例3
[0074]
将spacer片段插入pcrab
‑
km质粒中：
[0075]
为了使crrna和fncpf1核酸酶复合物能够定位到鲍曼不动杆菌基因组dna的特定靶点位置进行切割，需要将特定靶点的spacer序列插入到crrna表达基因中，其具体插入方法如下：
[0076]
(1)在鲍曼不动杆菌基因组上选取紧邻某pam位点的下游一段碱基序列。对于鲍曼不动杆菌而言，fncpf1核酸酶所能高效率识别的pam位点序列为ttn(n代表t/a/g/c任一碱基)和ctv(v代表a/g/c任一碱基)。所选取的一段碱基序列即为spacer序列，其长度可在19
‑
25nt之间，序列的gc含量控制在20
‑
80％之间，pam位点序列不包含在spacer序列中。为了使spacer片段能够无缝插入pcrab
‑
km质粒的crrna表达基因中，需要在spacer序列正义链5’端加上agat接头，以及在spacer序列反义链5’端加上ggcc接头，其具体的引物设计模板为：
[0077]
正义链引物：5
’‑
agatnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
‑3’
(n代表t/a/g/c任一碱基，个数为19
‑
25之间)
[0078]
反义链引物：3
’‑
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnccgg
‑5’
(n代表t/a/g/c任一碱基，个数为19
‑
25之间)
[0079]
在鲍曼不动杆菌基因组序列中选定目标靶点后，按上述要求设计好靶点的正义链引物序列和反义链引物序列，然后将序列发送至北京擎科新业生物技术有限公司进行引物合成。
[0080]
(2)将合成的正反义链引物进行磷酸化处理，然后通过碱基互补配对方式退火成双链dna片段。使用宝日医生物技术(北京)有限公司的t4pnk polynucleotide kinase对正反义链引物进行磷酸化反应，反应体系为：5μl正义链引物(10μm)，5μl反义链引物(10μm)，0.5μl t4pnk polynucleotide kinase，2.5μl 10
×
t4 dna ligase buffer，12μl ddh2o。应注意，由于磷酸化反应需要消耗atp，所以此处使用的是含有10mm atp的t4 dna ligase buffer，而不是含atp的t4pnk polynucleotide kinase buffer。反应体系配置完成后置于37℃的恒温培养箱中反应1h。然后取出反应产物，向其中加入0.5μl 2.5m nacl溶液，使用移液器吹吸混匀并短暂离心后置于pcr仪中进行缓慢退火，退火参数为：95℃温育3min；每10s降低1℃，共70个循环；最后12℃保温。此时的正反义链引物已经被磷酸化，并以碱基互补配对方式形成了双链dna片段。
[0081]
(3)将步骤(2)获得的双链dna片段稀释后通过golden gate克隆反应插入到pcrab
‑
km质粒的crrna表达基因中。取1μl步骤(2)获得的退火产物，加入到9μl ddh2o中，移液器吹吸混匀后备用。然后配置golden gate克隆反应体系：1μl pcrab
‑
km质粒(50ng/μl)，1μl十倍稀释退火产物，1μl 10
×
t4 dna ligase buffer，0.5μl t4 dna ligase，0.5μl bsai
‑
hf，6μl ddh2o。该golden gate克隆反应所使用的t4 dna ligase buffer、t4 dna ligase和bsai
‑
hf均购自neb(北京)有限公司。反应体系配置完成后在pcr仪中执行克隆反应，反应参数为：37℃温育3min，16℃温育3min，共25个循环；50℃温育5min；80℃温育15min；最后12℃保温。
[0082]
(4)将步骤(3)获得的10μl反应产物加入到100μl大肠杆菌top10感受态细胞(上海吐露港生物科技有限公司)中进行热激转化，转化步骤参照感受态细胞附带的操作说明书进行。转化结束后取100μl复苏液在含有浓度50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板上涂布，待复苏液被固体培养基吸收后，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜直至单菌
落长出。用无菌接种环随机挑取几个单菌落分别接种至5ml含有浓度为50μg/ml卡那霉素的lb液体试管中，将试管斜置于37℃的恒温摇床中振荡培养过夜。使用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒提取质粒，提取步骤参照试剂盒提供的操作说明书进行。提取的质粒送至北京擎科新业生物技术有限公司进行dna测序，检测到靶点spacer序列已正确插入crrna表达基因中。使用通用引物m13r作为测序引物，m13r序列为5
’‑
caggaaacagctatgacc
‑3’
(seq id no：13)。
[0083]
实施例4
[0084]
以野生型鲍曼不动杆菌atcc17978菌株为例，制备野生型鲍曼不动杆菌感受态细胞：
[0085]
从
‑
80℃冰箱中取出野生型鲍曼不动杆菌atcc17978菌株的冻存管，置于超净工作台内。使用无菌接种环沾取冻存管中的菌液后，将菌液划线接种在不含抗生素的lb固体培养基平板上。划线接种后的平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜直至菌体长出。使用无菌接种环挑取一个单菌落接种至3ml不含抗生素的lb液体试管中，将试管斜置于37℃的恒温摇床中振荡培养6h以上，直至菌液浑浊。从试管中吸取0.5ml菌液接种至50ml不含抗生素的lb液体三角瓶中，将三角瓶置于37℃的恒温摇床中继续振荡培养。当菌液的od600值达到0.6
‑
0.8时，立即取出三角瓶进行冰浴15min。将冰浴后的菌液转移至无菌的50ml离心管中，在预冷至4℃的离心机中以3200g的离心力进行离心5min，弃去培养基上清液，保留下层菌体沉淀。在菌体沉淀中加入25ml预冷至4℃的无菌10％甘油溶液，通过移液器枪头吹吸等方式重悬菌体，然后以相同离心参数再次离心，去除上清液，重新获得菌体沉淀。重复甘油洗涤和离心步骤一次。使用1ml预冷至4℃的无菌10％甘油溶液重悬菌体沉淀，所制得的菌悬液即为野生型鲍曼不动杆菌感受态细胞。制得的感受态细胞以50μl等份分装至无菌ep管中，经液氮速冻后置于
‑
80℃冰箱中保存。
[0086]
也可以制备各种野生型鲍曼不动杆菌菌株的感受态细胞，此处仅以野生型鲍曼不动杆菌atcc17978菌株为例。
[0087]
实施例5
[0088]
将dna电转化进入鲍曼不动杆菌感受态细胞：
[0089]
取一支实施例4中制备的野生型鲍曼不动杆菌atcc17978菌株感受态细胞，置于冰上几分钟待其融化。在刚刚融化的感受态细胞中加入不超过感受态体积1/10的dna溶液，然后用移液器将感受态细胞与dna溶液的混合物转移至冰上预冷的2mm电转杯(美国伯乐公司)中，盖上杯盖继续冰上静置1
‑
5min。取出电转杯，擦净电转杯外侧冷凝水后，使用genepulser xcell电脉冲转化仪(伯乐公司)进行电脉冲转化。每次转化的电脉冲参数为：2.5kv，200ω，25μf，模式为指数衰减波，电脉冲时间为5ms左右。仪器提示电脉冲结束后，立即加入1ml不含抗生素的lb液体至电转杯中，使用移液器吹吸重悬菌体，然后将菌液转移至无菌ep管中。ep管置于37℃的恒温摇床中振荡培养1
‑
2h使细胞复苏，然后取一定体积的复苏菌液涂布在含有相应抗生素的lb固体培养基平板上，待菌液被固体培养基吸收后，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜直至单菌落长出。只有成功转入了相应dna的细胞才能在平板上生长出单菌落。可以电转化任意种类的环状质粒dna、线性dna片段或两者的混合物。
[0090]
实施例6
[0091]
制备含pfncpfab
‑
apr质粒的鲍曼不动杆菌感受态细胞：
[0092]
按照实施例5的方法将pfncpfab
‑
apr质粒电转化进野生型鲍曼不动杆菌atcc17978菌株感受态细胞中，获得含有pfncpfab
‑
apr质粒的鲍曼不动杆菌atcc17978菌株的转化子单菌落。用无菌接种环挑取单菌落接种至3ml含有浓度为50μg/ml阿泊拉霉素的lb液体试管中，将试管斜置于37℃的恒温摇床中振荡培养6h以上，直至菌液浑浊。从试管中吸取0.5ml菌液接种至50ml含有浓度为50μg/ml阿泊拉霉素的lb液体三角瓶中，将三角瓶置于37℃的恒温摇床中继续振荡培养。振荡培养1h后，观察到培养液轻微浑浊，此时加入1ml浓度为100μm的iptg(异丙基硫代半乳糖苷)溶液至培养液中，用于诱导pfncpfab
‑
apr质粒中的recab重组酶系统的表达。继续振荡培养2h后，取出三角瓶冰浴15min。将冰浴后的菌液转移至无菌的50ml离心管中，在预冷至4℃的离心机中以3200g的离心力进行离心5min，弃去培养基上清液，保留下层菌体沉淀。在菌体沉淀中加入25ml预冷至4℃的无菌10％甘油溶液，使用移液器枪头吹吸使菌体沉淀重悬，然后以相同离心参数再次离心，去除上清液，重新获得菌体沉淀。重复甘油洗涤和离心步骤一次。使用1ml预冷至4℃的无菌10％甘油溶液重悬菌体沉淀，所制得的菌悬液即为含有pfncpfab
‑
apr质粒的鲍曼不动杆菌感受态细胞。制得的感受态细胞以50μl等份分装至无菌ep管中备用。
[0093]
实施例7
[0094]
鉴定fncpf1核酸酶在鲍曼不动杆菌中识别的pam位点：
[0095]
fncpf1核酸酶在不同种类细胞中所能识别作为pam位点的序列不完全相同。为鉴定fncpf1核酸酶在鲍曼不动杆菌细胞中能够识别哪些序列作为pam位点，本实施例选取了一系列序列进行测试。
[0096]
(1)在鲍曼不动杆菌atcc17978菌株oxyr基因中分别选取9个候选pam位点序列，其对应序列分别为gttg、ttta、attg、cttg、tttt、gctc、ccta、cctt、agaa。
[0097]
其中，gttg对应的靶点引物序列为：
[0098]
oxyr
‑
cpf
‑
f1：5
’‑
agatcatttacatgaagctcaaagt
‑3’
(seq id no：14)
[0099]
oxyr
‑
cpf
‑
r1：5
’‑
ggccactttgagcttcatgtaaatg
‑3’
(seq id no：15)
[0100]
其中，ttta对应的靶点引物序列为：
[0101]
oxyr
‑
cpf
‑
f2：5
’‑
agatcatgaagctcaaagtgagaag
‑3’
(seq id no：16)
[0102]
oxyr
‑
cpf
‑
r2：5
’‑
ggcccttctcactttgagcttcatg
‑3’
(seq id no：17)
[0103]
其中，attg对应的靶点引物序列为：
[0104]
oxyr
‑
cpf
‑
f3：5
’‑
agattccttgccctaccttttgaca
‑3’
(seq id no：18)
[0105]
oxyr
‑
cpf
‑
r3：5
’‑
ggcctgtcaaaaggtagggcaagga
‑3’
(seq id no：19)
[0106]
其中，cttg对应的靶点引物序列为：
[0107]
oxyr
‑
cpf
‑
f4：5
’‑
agatccctaccttttgacacaagaa
‑3’
(seq id no：20)
[0108]
oxyr
‑
cpf
‑
r4：5
’‑
ggccttcttgtgtcaaaaggtaggg
‑3’
(seq id no：21)
[0109]
其中，tttt对应的靶点引物序列为：
[0110]
oxyr
‑
cpf
‑
f5：5
’‑
agatgacacaagaagtttaaaagta
‑3’
(seq id no：22)
[0111]
oxyr
‑
cpf
‑
r5：5
’‑
ggcctacttttaaacttcttgtgtc
‑3’
(seq id no：23)
[0112]
其中，gctc对应的靶点引物序列为：
[0113]
oxyr
‑
cpf
‑
f6：5
’‑
agataaagtgagaagattgtagagc
‑3’
(seq id no：24)
[0114]
oxyr
‑
cpf
‑
r6：5
’‑
ggccgctctacaatcttctcacttt
‑3’
(seq id no：25)
[0115]
其中，ccta对应的靶点引物序列为：
[0116]
oxyr
‑
cpf
‑
f7：5
’‑
agatgaacatggtaatttggacatg
‑3’
(seq id no：26)
[0117]
oxyr
‑
cpf
‑
r7：5
’‑
ggcccatgtccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：27)
[0118]
其中，cctt对应的靶点引物序列为：
[0119]
oxyr
‑
cpf
‑
f8：5
’‑
agatgccctaccttttgacacaaga
‑3’
(seq id no：28)
[0120]
oxyr
‑
cpf
‑
r8：5
’‑
ggcctcttgtgtcaaaaggtagggc
‑3’
(seq id no：29)
[0121]
其中，agaa对应的靶点引物序列为：
[0122]
oxyr
‑
cpf
‑
f9：5
’‑
agatcatggtaatttggacatgatt
‑3’
(seq id no：30)
[0123]
oxyr
‑
cpf
‑
r9：5
’‑
ggccaatcatgtccaaattaccatg
‑3’
(seq id no：31)
[0124]
(2)在鲍曼不动杆菌atcc17978菌株adeb基因中分别选取9个候选pam位点序列，其对应序列分别为gttc、tttg、atta、ctta、tttt、gctg、cctt、actt、caaa。
[0125]
其中，gttc对应的靶点引物序列为：
[0126]
adeb
‑
cpf
‑
f1：5
’‑
agatcaatgatggtgatctttttag
‑3’
(seq id no：32)
[0127]
adeb
‑
cpf
‑
r1：5
’‑
ggccctaaaaagatcaccatcattg
‑3’
(seq id no：33)
[0128]
其中，tttg对应的靶点引物序列为：
[0129]
adeb
‑
cpf
‑
f2：5
’‑
agatccggaatgaaatattggccaa
‑3’
(seq id no：34)
[0130]
adeb
‑
cpf
‑
r2：5
’‑
ggccttggccaatatttcattccgg
‑3’
(seq id no：35)
[0131]
其中，atta对应的靶点引物序列为：
[0132]
adeb
‑
cpf
‑
f3：5
’‑
agatccggtattacctttgccggaa
‑3’
(seq id no：36)
[0133]
adeb
‑
cpf
‑
r3：5
’‑
ggccttccggcaaaggtaataccgg
‑3’
(seq id no：37)
[0134]
其中，ctta对应的靶点引物序列为：
[0135]
adeb
‑
cpf
‑
f4：5
’‑
agataaatcatcaaacatacagttc
‑3’
(seq id no：38)
[0136]
adeb
‑
cpf
‑
r4：5
’‑
ggccgaactgtatgtttgatgattt
‑3’
(seq id no：39)
[0137]
其中，tttt对应的靶点引物序列为：
[0138]
adeb
‑
cpf
‑
f5：5
’‑
agatagtaattaccggtattacctt
‑3’
(seq id no：40)
[0139]
adeb
‑
cpf
‑
r5：5
’‑
ggccaaggtaataccggtaattact
‑3’
(seq id no：41)
[0140]
其中，gctg对应的靶点引物序列为：
[0141]
adeb
‑
cpf
‑
f6：5
’‑
agatcttaaaatcatcaaacataca
‑3’
(seq id no：42)
[0142]
adeb
‑
cpf
‑
r6：5
’‑
ggcctgtatgtttgatgattttaag
‑3’
(seq id no：43)
[0143]
其中，cctt对应的靶点引物序列为：
[0144]
adeb
‑
cpf
‑
f7：5
’‑
agattgccggaatgaaatattggcc
‑3’
(seq id no：44)
[0145]
adeb
‑
cpf
‑
r7：5
’‑
ggccggccaatatttcattccggca
‑3’
(seq id no：45)
[0146]
其中，actt对应的靶点引物序列为：
[0147]
adeb
‑
cpf
‑
f8：5
’‑
agatcgttccagctaccttcagatg
‑3’
(seq id no：46)
[0148]
adeb
‑
cpf
‑
r8：5
’‑
ggcccatctgaaggtagctggaacg
‑3’
(seq id no：47)
[0149]
其中，caaa对应的靶点引物序列为：
[0150]
adeb
‑
cpf
‑
f9：5
’‑
agatcatacagttccaatgatggtg
‑3’
(seq id no：48)
[0151]
adeb
‑
cpf
‑
r9：5
’‑
ggcccaccatcattggaactgtatg
‑3’
(seq id no：49)
[0152]
将本实施例中的18对引物序列发送至北京擎科新业生物技术有限公司进行引物合成，收到引物后按照实施例3中的方法将各对引物插入pcrab
‑
km质粒的crrna表达基因中，获得含有各靶点spacer序列的pcrab
‑
km质粒。针对每个靶点，各挑取几个转化子经摇菌培养后提取质粒，送至北京擎科新业生物技术有限公司进行dna测序验证。测序正确的质粒按照实施例5中的方法分别电转化进按实施例6中的方法制备的含pfncpfab
‑
apr质粒的鲍曼不动杆菌感受态细胞中。完成复苏后，每个样品取100μl复苏菌液涂布在含有50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板上，待菌液被固体培养基吸收后，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜，统计各平板上的转化子单菌落数目。本实验重复三遍。各平板上生长的转化子单菌落数目经统计后如图2所示。
[0153]
鲍曼不动杆菌缺乏非同源性末端接合(non
‑
homologous end joining，nhej)修复方式，在不含同源修复模板的情况下，fncpf1核酸酶切割鲍曼不动杆菌基因组dna双链后会造成细菌的死亡。因此，我们可根据转化子单菌落数目判断fncpf1核酸酶是否能识别某序列作为pam位点。若fncpf1核酸酶能高效识别某序列作为pam位点，则会不生长或零星生长转化子单菌落；若fncpf1核酸酶只能低效识别或不能识别某序列作为pam位点，则会生长大量的转化子单菌落。汇总本实施例获得的数据，最终鉴定到fncpf1核酸酶在鲍曼不动杆菌中能够高效识别ttn(n代表t/a/g/c任一碱基)和ctv(v代表a/g/c任一碱基)序列作为pam位点。
[0154]
实施例8
[0155]
鉴定fncpf1核酸酶在鲍曼不动杆菌中可识别的靶点序列长度：
[0156]
fncpf1核酸酶在不同种类细胞中所能识别的靶点序列长度不完全相同。为鉴定fncpf1核酸酶在鲍曼不动杆菌细胞中能够识别的靶点长度范围，本实施例选取了一系列长度的靶点序列进行测试。
[0157]
(1)在鲍曼不动杆菌atcc17978菌株oxyr基因中选取cta序列作为pam位点，分别截取9种长度的序列作为靶点序列。
[0158]
其中，长度为15nt靶点对应的引物序列为：
[0159]
oxyr
‑
cpf
‑
f15nt：5
’‑
agatgaacatggtaatttg
‑3’
(seq id no：50)
[0160]
oxyr
‑
cpf
‑
r15nt：5
’‑
ggcccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：51)
[0161]
其中，长度为17nt靶点对应的引物序列为：
[0162]
oxyr
‑
cpf
‑
f17nt：5
’‑
agatgaacatggtaatttgga
‑3’
(seq id no：52)
[0163]
oxyr
‑
cpf
‑
r17nt：5
’‑
ggcctccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：53)
[0164]
其中，长度为19nt靶点对应的引物序列为：
[0165]
oxyr
‑
cpf
‑
f19nt：5
’‑
agatgaacatggtaatttggaca
‑3’
(seq id no：54)
[0166]
oxyr
‑
cpf
‑
r19nt：5
’‑
ggcctgtccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：55)
[0167]
其中，长度为20nt靶点对应的引物序列为：
[0168]
oxyr
‑
cpf
‑
f20nt：5
’‑
agatgaacatggtaatttggacat
‑3’
(seq id no：56)
[0169]
oxyr
‑
cpf
‑
r20nt：5
’‑
ggccatgtccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：57)
[0170]
其中，长度为21nt靶点对应的引物序列为：
[0171]
oxyr
‑
cpf
‑
f21nt：5
’‑
agatgaacatggtaatttggacatg
‑3’
(seq id no：26)
[0172]
oxyr
‑
cpf
‑
r21nt：5
’‑
ggcccatgtccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：27)
[0173]
其中，长度为22nt靶点对应的引物序列为：
[0174]
oxyr
‑
cpf
‑
f22nt：5
’‑
agatgaacatggtaatttggacatga
‑3’
(seq id no：58)
[0175]
oxyr
‑
cpf
‑
r22nt：5
’‑
ggcctcatgtccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：59)
[0176]
其中，长度为23nt靶点对应的引物序列为：
[0177]
oxyr
‑
cpf
‑
f23nt：5
’‑
agatgaacatggtaatttggacatgat
‑3’
(seq id no：60)
[0178]
oxyr
‑
cpf
‑
r23nt：5
’‑
ggccatcatgtccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：61)
[0179]
其中，长度为25nt靶点对应的引物序列为：
[0180]
oxyr
‑
cpf
‑
f25nt：5
’‑
agatgaacatggtaatttggacatgattg
‑3’
(seq id no：62)
[0181]
oxyr
‑
cpf
‑
r25nt：5
’‑
ggcccaatcatgtccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：63)
[0182]
其中，长度30nt靶点对应的引物序列为：
[0183]
oxyr
‑
cpf
‑
f30nt：5
’‑
agatgaacatggtaatttggacatgattgtcctt
‑3’
(seq id no：64)
[0184]
oxyr
‑
cpf
‑
r30nt：5
’‑
ggccaaggacaatcatgtccaaattaccatgttc
‑3’
(seq id no：65)
[0185]
(2)在鲍曼不动杆菌atcc17978菌株hscb基因中选取ttc序列作为pam位点，分别截取9种长度的序列作为靶点序列。
[0186]
其中，长度为15nt靶点对应的引物序列为：
[0187]
hscb
‑
cpf
‑
f15nt：5
’‑
agattacaatccgctttag
‑3’
(seq id no：66)
[0188]
hscb
‑
cpf
‑
r15nt：5
’‑
ggccctaaagcggattgta
‑3’
(seq id no：67)
[0189]
其中，长度为17nt靶点对应的引物序列为：
[0190]
hscb
‑
cpf
‑
f17nt：5
’‑
agattacaatccgctttagaa
‑3’
(seq id no：68)
[0191]
hscb
‑
cpf
‑
r17nt：5
’‑
ggccttctaaagcggattgta
‑3’
(seq id no：69)
[0192]
其中，长度为19nt靶点对应的引物序列为：
[0193]
hscb
‑
cpf
‑
f19nt：5
’‑
agattacaatccgctttagaact
‑3’
(seq id no：70)
[0194]
hscb
‑
cpf
‑
r19nt：5
’‑
ggccagttctaaagcggattgta
‑3’
(seq id no：71)
[0195]
其中，长度为20nt靶点对应的引物序列为：
[0196]
hscb
‑
cpf
‑
f20nt：5
’‑
agattacaatccgctttagaactt
‑3’
(seq id no：72)
[0197]
hscb
‑
cpf
‑
r20nt：5
’‑
ggccaagttctaaagcggattgta
‑3’
(seq id no：73)
[0198]
其中，长度为21nt靶点对应的引物序列为：
[0199]
hscb
‑
cpf
‑
f21nt：5
’‑
agattacaatccgctttagaacttc
‑3’
(seq id no：74)
[0200]
hscb
‑
cpf
‑
r21nt：5
’‑
ggccgaagttctaaagcggattgta
‑3’
(seq id no：75)
[0201]
其中，长度为22nt靶点对应的引物序列为：
[0202]
hscb
‑
cpf
‑
f22nt：5
’‑
agattacaatccgctttagaacttcg
‑3’
(seq id no：76)
[0203]
hscb
‑
cpf
‑
r22nt：5
’‑
ggcccgaagttctaaagcggattgta
‑3’
(seq id no：77)
[0204]
其中，长度为23nt靶点对应的引物序列为：
[0205]
hscb
‑
cpf
‑
f23nt：5
’‑
agattacaatccgctttagaacttcgt
‑3’
(seq id no：78)
[0206]
hscb
‑
cpf
‑
r23nt：5
’‑
ggccacgaagttctaaagcggattgta
‑3’
(seq id no：79)
[0207]
其中，长度为25nt靶点对应的引物序列为：
[0208]
hscb
‑
cpf
‑
f25nt：5
’‑
agattacaatccgctttagaacttcgtga
‑3’
(seq id no：80)
[0209]
hscb
‑
cpf
‑
r25nt：5
’‑
ggcctcacgaagttctaaagcggattgta
‑3’
(seq id no：81)
[0210]
其中，长度为30nt靶点对应的引物序列为：
[0211]
hscb
‑
cpf
‑
f30nt：5
’‑
agattacaatccgctttagaacttcgtgaacaac
‑3’
(seq id no：82)
[0212]
hscb
‑
cpf
‑
r30nt：5
’‑
ggccgttgttcacgaagttctaaagcggattgta
‑3’
(seq id no：83)
[0213]
将本实施例中的17对引物序列(其中oxyr
‑
cpf
‑
f21nt和oxyr
‑
cpf
‑
f21nt引物在实施例7中已合成)发送至北京擎科新业生物技术有限公司进行引物合成，收到引物后按照实施例3中的方法将各对引物插入pcrab
‑
km质粒的crrna表达基因中，获得含不同靶点序列长度的pcrab
‑
km质粒。针对每个靶点，各挑取几个转化子经摇菌培养后提取质粒，送至北京擎科新业生物技术有限公司进行dna测序验证。测序正确的质粒按照实施例5中的方法分别电转化进按实施例6中的方法制备的含pfncpfab
‑
apr质粒的鲍曼不动杆菌感受态细胞中。完成复苏后，每个样品取100μl复苏菌液涂布在含有50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板上，待菌液被固体培养基吸收后，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜，统计各平板上的转化子单菌落数目。本实验重复三遍。各平板上生长的转化子单菌落数目经统计后如图3所示。
[0214]
鲍曼不动杆菌缺乏非同源性末端接合(non
‑
homologous end joining，nhej)修复方式，在不含同源修复模板的情况下，fncpf1核酸酶切割鲍曼不动杆菌基因组dna双链后会造成细菌的死亡。因此，我们可根据转化子单菌落数目判断fncpf1核酸酶是否能识别某种长度的靶点序列。若fncpf1核酸酶能高效识别某种长度的靶点序列，则会对其进行切割，使得平板上不生长或零星生长转化子单菌落；若fncpf1核酸酶不能识别或只能低效识别某种长度的靶点序列，则只会少量切割或不进行切割，使得平板上生长大量的转化子单菌落。汇总本实施例获得的数据，最终鉴定到fncpf1核酸酶在鲍曼不动杆菌中能够高效识别长度范围在19
‑
25nt之间的靶点序列。
[0215]
实施例9
[0216]
pfncpfab/pcrab双质粒系统实现鲍曼不动杆菌高效基因组编辑：
[0217]
本实施例选取鲍曼不动杆菌atcc17978菌株的uspa基因，使用pfncpfab/pcrab双质粒系统对其进行无痕敲除。uspa基因敲除的pcr验证结果如图4a所示，uspa基因敲除菌株的dna测序结果如图4b所示。
[0218]
其中，uspa基因敲除的步骤如下：
[0219]
(1)在uspa基因中选取一个靶点，此处选取靶点的pam位点序列为tta，靶点序列为：5
’‑
agacggggcaaaccaatga
‑3’
(seq id no：84)，其对应的正反义链引物序列为：
[0220]
uspa
‑
cpf
‑
f19nt：5
’‑
agatagacggggcaaaccaatga
‑3’
(seq id no：85)
[0221]
uspa
‑
cpf
‑
r19nt：5
’‑
ggcctcattggtttgccccgtct
‑3’
(seq id no：86)
[0222]
将上述正反义链引物序列发送至北京擎科新业生物技术有限公司进行引物合成，并按照实施例3中的方法将其插入到pcrab
‑
km质粒的crrna表达基因中，经dna测序验证，获得pcrab
‑
km
‑
uspa质粒。
[0223]
(2)在uspa靶点的上下游各选取40nt的dna序列作为同源修复模板的上游同源序列，上下游同源序列之间的dna序列将被删除。
[0224]
此处选取的上游序列为：
[0225]5’‑
attcttgtaccaattgacggttctgaaacttctatggttg
‑3’
(seq id no：87)
[0226]
下游序列为：
[0227]5’‑
ggacttagtgtagaaaccaaattacttgaaggttttgttg
‑3’
(seq id no：88)。
[0228]
将上下游序列拼接为一个完整的80nt序列uspa
‑
ssdna，其序列为5
’‑
attcttgtaccaattgacggttctgaaacttctatggttgggacttagtgtagaaaccaaattacttgaaggttttgttg
‑3’
(seq id no：89)。将该80nt序列发送至北京擎科新业生物技术有限公司进行ssdna合成，合成的uspa
‑
ssdna用作uspa基因敲除的同源修复模板。
[0229]
(3)在uspa基因上游同源序列的上游选取一段正义链序列作为菌落pcr扩增正向引物和dna测序引物，此处选取的序列为uspa
‑
seq
‑
f：5
’‑
attgttggtggcgtacctg
‑3’
(seq id no：90)。在uspa基因下游同源序列的下游选取一段反义链序列作为菌落pcr扩增反向引物，此处选取的序列为uspa
‑
seq
‑
r：5
’‑
taattgcctgccttgctgt
‑3’
(seq id no：91)。将uspa
‑
seq
‑
f序列和uspa
‑
seq
‑
r序列送至发送至北京擎科新业生物技术有限公司进行引物合成，用于后续实验。此步骤中，选取的菌落pcr扩增引物位于同源修复模板的外侧，此时无论靶基因是否敲除成功，都能pcr扩增获得目标条带。当进行基因敲除操作时，若pcr扩增获得的目标条带大小与野生型菌株为模板扩增获得的目标条带大小一致，则表明靶基因未被敲除；若pcr扩增获得的目标条带小于野生型菌株为模板扩增获得的目标条带，则初步认为靶基因敲除成功。
[0230]
(4)吸取2μl步骤(1)构建的pcrab
‑
km
‑
uspa质粒(100
‑
200ng/μl)和3μl步骤(2)合成的uspa
‑
ssdna(100μm)，混匀后按照实施例5中的方法电转化进按实施例6中的方法制备的含pfncpfab
‑
apr质粒的鲍曼不动杆菌感受态细胞中。完成复苏后，吸取100μl复苏菌液涂布在含有50μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板上，待菌液被固体培养基吸收后，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜直至转化子长出。
[0231]
(5)随机挑取几个步骤(4)获得的鲍曼不动杆菌转化子单菌落，使用康为世纪生物科技股份有限公司的2
×
es taq mastermix(dye)进行菌落pcr，以初步鉴定uspa基因是否敲除成功。菌落pcr的反应体系为：10μl 2
×
es taq mastermix(dye)，0.5μl uspa
‑
seq
‑
f(10μm)，0.5μl uspa
‑
seq
‑
r(10μm)，9μlddh2o，然后用无菌移液器吸头分别沾取鲍曼不动杆菌转化子单菌落至各管反应体系中作为扩增模板。此外，还需选取野生型鲍曼不动杆菌atcc17978菌株进行相同的菌落pcr扩增，作为对照组。体系配置完成后进行短暂离心，然后置于pcr仪中执行扩增反应，扩增参数为：95℃预变性10min；之后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；接着72℃完全延伸5min；最后12℃保温。
[0232]
菌落pcr扩增完成后，从每管菌落pcr样品中吸取2μl产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。此处使用的琼脂糖凝胶浓度为0.8％。电泳缓冲液体系为1
×
tae。电泳完成后，取出琼脂糖凝胶在凝胶成像仪中进行紫外光显色拍照，记录pcr扩增产物的条带大小。从图4a可以看出，挑取的7个转化子单菌落中的6个都扩增出了比野生型菌株更小的pcr目标条带，初步认为这6个转化子单菌落中的uspa基因敲除成功。
[0233]
(6)将步骤(5)初步鉴定已成功敲除uspa基因的6个转化子单菌落的pcr扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行dna测序验证，使用uspa
‑
seq
‑
f作为测序引物。dna测序结果证实这6个菌株中的uspa基因确实已被成功敲除，且敲除掉的dna片段与步骤(2)的设计预期一致。
[0234]
因此，pfncpfab/pcrab双质粒系统可以在各种鲍曼不动杆菌菌株中对其基因组进行高效编辑，此处仅以鲍曼不动杆菌atcc17978菌株的uspa基因为例。
[0235]
实施例10
[0236]
鲍曼不动杆菌中pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒的消除：
[0237]
完成所需要的鲍曼不动杆菌基因组编辑后，需要将编辑成功的目的菌株中含有的pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒消除掉，具体操作步骤如下：
[0238]
用无菌接种环挑取目的菌株接种至5ml不含抗生素的lb液体试管中，将试管斜置于37℃的恒温摇床中振荡培养12
‑
18h。用新的无菌接种环沾取试管中的菌液，在不含抗生素但含有5％蔗糖的lb固体培养基平板上进行三区划线，然后将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜直至菌体长出。理论上讲，能够在含有5％蔗糖的lb固体培养基平板上长出的菌体已同时消除了pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒，因为pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒上均含有蔗糖敏感筛选标记基因sacb，该基因的表达产物蔗糖果聚糖酶能够催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖，并将果糖聚合成对细菌具有致死性的高分子果聚糖。
[0239]
为进一步确认菌体细胞中的pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒均已被消除，用无菌接种环在含有5％蔗糖的lb固体培养基平板上挑取一个单菌落，依次在仅含有50μg/ml阿泊拉霉素的lb固体培养基平板、仅含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板和不含抗生素的lb固体培养基平板上划线，然后将这些划线接种过的平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养过夜，观察菌体生长情况。若某个单菌落经划线接种后仅能在不含抗生素的lb固体培养基平板上生长，而在仅含有50μg/ml阿泊拉霉素的lb固体培养基平板和仅含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板均不能生长，则表明该单菌落的菌体细胞中pfncpfab
‑
apr质粒和pcrab
‑
km质粒均已被成功消除。此时，可将质粒消除成功的目的菌株进行保藏或用于其他下游实验。
[0240]
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
[0241]
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248]
[0249]
[0250]
[0251]
[0252]
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[0255]
[0256]
[0257]
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[0259]
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[0266]
[0267]
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[0270]
[0271]
[0272]
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[0274]
[0275]
[0276]
[0277]
[0278]
[0279]
[0280]
[0281]
[0282]
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[0284]
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[0289]
[0290]
[0291]
[0292]
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[0295]
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[0299]
[0300]