本发明涉及病原微生物检测，更具体地涉及一种结核分枝杆菌复合菌群鉴定及耐药性检测的相关基因、方法、引物组以及试剂盒。
背景技术：
：结核分枝杆菌是引起各种结核病(以肺结核为主)的最重要的因素。虽然流行病学数据显示结核病大面积流行，但结核病的治疗有效率仅为55％，耐药是导致这种情况的重要原因。2017年我国结核患者中有5.6％为耐多药结核病(mdr-tb)患者，而在这些患者中，据估计有8.5％的患者为广泛耐药结核病(xdr-tb)。因此，结核分枝杆菌的鉴定及其药敏检测具有重要的公共卫生意义。由于相互之间基因组差异很小，例如牛分枝杆菌(m.bovis)和结核分枝杆菌(m.tuberculosis)根据ani(平均核苷酸一致性)来区分，差别不到1％，所以m.bovis和m.tuberculosis以及另外6种分枝杆菌(m.africanum、m.bovisbcg、m.canetti、m.caprae、m.microti、m.pinnipedii)一起被称为结核分枝杆菌复合群(mtbc)。其中，m.bovis和m.bovisbcg对吡嗪酰胺天然耐药，对其进行鉴定和区分具有重要的临床意义。结核分枝杆菌耐药性的检测也具有重要的临床意义。目前的检测方法并不能完全满足临床需求，例如涂片法灵敏度低，培养法耗时较长，商业化的产品成本高、操作要求复杂等不利的因素限制了临床实践中病菌的检测效率，延长了确诊时间，不利于患者的有效治疗。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用飞行时间质谱实现结核分枝杆菌复合菌群鉴定及耐药性检测的引物组、试剂盒，从而解决现有技术针对结核分枝杆菌的检测方法灵敏度低、周期长、成本高、检测范围窄的缺点，并且无法同时实现结核分枝杆菌复合菌群鉴定及耐药性检测的问题。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：根据本发明的第一方面，提供一种结核分枝杆菌复合菌群鉴定的相关基因，所述结核分枝杆菌复合菌群鉴定的相关基因包括以下基因位点和特征碱基：基因位点特征碱基tb81tmce3bctb10gtb78gtb61g；根据本发明的第二方面，提供一种结核分枝杆菌耐药性检测的相关基因，所述结核分枝杆菌耐药性检测的相关基因包括以下药物、检测基因以及检测突变：1)利福平2)异烟肼序号检测基因检测位点或突变1katgs315gkatgs315rkatgs315tkatgs315nkatgs315i2katgg316s3inha-15inha-102inha-17inhas94ainha-84mshaa187v3)吡嗪酰胺序号检测基因检测位点或突变1pncah57d4)乙胺丁醇序号检测基因检测位点或突变1embbm306vembbm306lembbm306i2embbg406d5)氟喹诺酮类6)链霉素7)乙硫异烟胺8)丙硫异烟胺9)对氨基水杨酸钠序号检测基因检测位点或突变1folci43t2thyat202a3thyah75n10)阿米卡星序号检测基因检测位点或突变1rrsa1401g2rrsg1484t11)卡那霉素12)卷曲霉素13)环丝氨酸序号检测基因检测位点或突变1alrs261n14)氯法齐明序号检测基因检测位点或突变1rv0678g193del2rv0678c466t15)贝达喹啉序号检测基因检测位点或突变1rv0678g193del2rv0678c466t16)利奈唑胺序号检测基因检测位点或突变1rplct460c根据本发明的第三方面，提供一种结核分枝杆菌复合菌群鉴定的方法，用于非疾病的诊断目的，所述方法包括检测如下所述的结核分枝杆菌复合菌群鉴定相关基因位点是否符合特征碱基，若符合即可确定相应结核分枝杆菌复合菌群的存在：根据本发明的第四方面，提供一种结核分枝杆菌耐药性检测的方法，用于非疾病的诊断目的，所述方法还包括检测如下所述的结核分枝杆菌耐药性相关基因位点是否存在以下敏感、耐药核酸突变：1)利福平2)异烟肼序号检测基因检测位点或突变敏感》耐药核酸突变1katgs315gagc>ggckatgs315ragc>aggkatgs315tagc>acckatgs315nagc>aackatgs315iagc>atc2katgg316sggc>agc3inha-15c>tinha-102g>tinha-17c>tinhas94atcg>gcginha-8t>a4mshaa187vgca>gta3)吡嗪酰胺序号检测基因检测位点或突变敏感》耐药核酸突变1pncah57dcac>gac4)乙胺丁醇5)氟喹诺酮类6)链霉素7)乙硫异烟胺8)丙硫异烟胺9)对氨基水杨酸钠序号检测基因检测位点或突变敏感》耐药核酸突变1folci43tatc>acc2thyat202aacc>gcc3thyah75ncac>aac10)阿米卡星序号检测基因检测位点或突变敏感》耐药核酸突变1rrsa1401ga>g2rrsg1484tg>t11)卡那霉素12)卷曲霉素13)环丝氨酸序号检测基因检测位点或突变敏感》耐药核酸突变1alrs261nagc>aac14)氯法齐明序号检测基因检测位点或突变敏感》耐药核酸突变1rv0678g193delg>-2rv0678c466tc>t15)贝达喹啉16)利奈唑胺序号检测基因检测位点或突变敏感》耐药核酸突变1rplct460ct>c其中，任何一个检测位点出现突变，即可判定针对与该检测基因对应的药物具有耐药性。根据本发明的第五方面，提供一种同时进行结核分枝杆菌复合菌群鉴定及耐药性检测的方法。所述方法可实现对16种药物的耐药性的同时检测，所述药物包括：利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氟喹诺酮类、链霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸钠、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、环丝氨酸、氯法齐明、贝达喹啉、利奈唑胺。根据本发明提供的方法，利用飞行时间质谱同时实现结核分枝杆菌复合菌群鉴定及耐药性检测。根据本发明的第六方面和第七方面，提供一种结核分枝杆菌复合菌群鉴定及耐药性检测的引物组以及由此构成的试剂盒，所述引物组包括耐药性检测引物组和结核分枝杆菌复合菌群鉴定引物组，所述耐药性检测引物组包括以下基因变异位点和引物：1.rpob_s522_2f:扩增引物对：f(seqidno：1)：acgttggatgtcacaccgcctaccatcatr(seqidno：2)：acgttggatgattctcagctgacaggtcg引物浓度范围(指pcr引物在反应体系中浓度，下同)为各0.1～0.3μm延伸引物(seqidno：3)：aatacctcaacaagccgcagt(引物终浓度8.0～10μm)2.rpob_h526-1f：f(seqidno：4)：acgttggatgtcacaccgcctaccatcatr(seqidno：5)：acgttggatgattctcagctgacaggtcg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：6)：aactgtccggcttgagg(7.0～9.0μm)3.rpob_s531_2ff(seqidno：7)：acgttggatgtcacaccgcctaccatcatr(seqidno：8)：acgttggatgattctcagctgacaggtcg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：9)：cagaagcggccactct(4.0～6.0μm)4.rpob511rf(seqidno：10)：acgttggatgtcacaccgcctaccatcatr(seqidno：11)：acgttggatgattctcagctgacaggtcg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：12)：gggtccatgaattgcctg(6.0～8.0μm)5.rpob_f505_1ff(seqidno：13)：acgttggatgtcacaccgcctaccatcatr(seqidno：14)：acgttggatgattctcagctgacaggtcg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：15)：ttattggtcgcggcgatcaagcag(6.5～8.0μm)6.rpob_q513_2ff(seqidno：16)：acgttggatgtcacaccgcctaccatcatr(seqidno：17)：acgttggatgattctcagctgacaggtcg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：18)：tttttacaccagccagcagacgc(5.0～7.0μm)7.rpob_q513_1ff(seqidno：19)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：20)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：21)：accagccagcagtgc(6.0～8.0μm)8.rpob_q513_5rf(seqidno：22)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：23)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：24)：ttgttctggtccgataa(7.0～9.0μm)9.rpob_d516_4rf(seqidno：25)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：26)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：27)：agcgggttgtgtctg(10.0～12.0μm)10.rpob_s522_5r_1126ef(seqidno：28)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：29)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：30)：acttgtgggtcccaac(8.0～10.0μm)11.rpob_d516_1ff(seqidno：31)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：32)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：33)：gctgagccaatattcg(6.0～7.0μm)12.rpob_s531_1f_1126ef(seqidno：34)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：35)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：36)：gttgacccacaagcgctcagcg(4.0～6.0μm)13.rpob_l533_4rf(seqidno：37)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：38)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：39)：cagaccgccgcccggc(6.0～7.0μm)14.rpob_s522_1ff(seqidno：40)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：41)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：42)：accagaacaacctgccg(8.0～9.0μm)15.rpob_h526_4rf(seqidno：43)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：44)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：45)：aactacagtcggcttcgg(6.0～8.0μm)16.rpob_d516_5r_1126ef(seqidno：46)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：47)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：48)：aacagcgggttcgtttg(9.0～11.0μm)17.rpob_s512_2ff(seqidno：49)：acgttggatggatcaaggagttctctgcgar(seqidno：50)：acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg(各0.8～1.2μm)延伸引物(seqidno：51)：tcttcggcaccagccatggca(5.0～7.0μm)18.rpob_d626ef(seqidno：52)：acgttggatgtagcgacgagatcgtcatgcr(seqidno：53)：acgttggatgcatgtagtccacctcagagacg(各0.3～0.5μm)延伸引物(seqidno：54)：aattcgccgatcgcgtagga(7.0～8.0μm)19.rpob_d516_2ff(seqidno：55)：acgttggatggatcaaggagttcttgccgar(seqidno：56)：acgttggatgacgctcacgtgacaccagg(各0.6～1.0μm)延伸引物(seqidno：57)：tgagccaatttgcag(6.0～7.0μm)20.katg316-1f(seqidno：58)：acgttggatgctgttgtcccattctgtcggr(seqidno：59)：acgttggatgtggaagagctcgtgtgacac(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：60)：tccatacgacctagtcgc(7.0～8.0μm)21.katg_s315_5r_1126ef(seqidno：61)：acgttggatgctgttgtcccattctgtcggr(seqidno：62)：acgttggatgtggaagagctcgtgtgacac(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：63)：tgttcgtccatacgaccttaggccc(8.0～10.0μm)22.katg_s315_1ff(seqidno：64)：acgttggatgctgttgtcccattctgtcggr(seqidno：65)：acgttggatgtggaagagctcgtgtgacac(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：66)：aaggacgcgtaaccc(9.0～10.0μm)23.inha_t-8af(seqidno：67)：acgttggatgactgaacgggataagctaggr(seqidno：68)：acgttggatgctcgtggacatactgctgtc(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：69)：ttggcagtcaccacgcca(4.0～6.0μm)24.inhag-102tf(seqidno：70)：acgttggatgcctcgctgcccagagagagar(seqidno：71)：acgttggatggaaatcggtatgtcgaccag(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：72)：tcacaccgacaaacgctacga(4.0～6.0μm)25.inha_c-17tf(seqidno：73)：acgttggatgactgaacgggatactagaggr(seqidno：74)：acgttggatgctcgtggacatactcatgtc(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：75)：ccccgacaacctgtact(4.0～6.0μm)26.pnca-57f(seqidno：76)：acgttggatgacgaggaatagtgtcgcgtgr(seqidno：77)：acgttggatgcaaccaaggactaatccctc(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：78)：aggtgtgccgaaggagt(7.0～8.0μm)27.embb306-3f(seqidno：79)：acgttggatgaccagcggaaataggtgatcr(seqidno：80)：acgttggatgaattcgtcggacgagcgtca(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：81)：ggtgggtcggcgacgtgcgc(8.0～9.0μm)28.embb-497f(seqidno：82)：acgttggatgttctcggtataccatccgcgr(seqidno：83)：acgttggatgtcatcctgaccgtgtgtgtc(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：84)：ccaacaccgttgacgagtgc(8.0～9.0μm)29.embb-406f(seqidno：85)：acgttggatgtcgatcagcacattgaggcr(seqidno：86)：acgttggatgcgtggatgccgtaccataac(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：87)：gctagccgagcgcgtgtaag(8.0～9.0μm)30.embb306-1f(seqidno：88)：acgttggatgtgatattcggcttccgcttcr(seqidno：89)：acgttggatgagcgccagcaggttatatga(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：90)：ggacgaggctacatcgtgcgc(9.0～10.0μm)31.gyra90_ct__1126ef(seqidno：91)：acgttggatgagaccatgggcaaccacatcr(seqidno：92)：acgttggatgtccaccagcgggtcgcgaa(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：93)：taaccacccgcagcgacgcg(6.0～7.0μm)32.gyra94_atf(seqidno：94)：acgttggatgagaccatgggcaactcaaccr(seqidno：95)：acgttggatgtccaccagcgggtgagcca(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：96或229)：atgcgcaccgagtgg或者atgggcaccgagcgg(5.0～7.0μm)33.gyra91f(seqidno：97)：acgttggatggcggcaagatcatctataggr(seqidno：98)：acgttggatgcgtgatgatcgcctagtcat(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：99)：cgcaccagggtgtcgtacgtag(5.0～7.0μm)34.gyra89f(seqidno：100)：acgttggatgagaccatgggcaaccaatccr(seqidno：101)：acgttggatgtccaccagcgggtcgcgaa(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：102)：caggctgtcgtagatcgcacggt(5.0～7.0μm)35.gyra_g88_2ff(seqidno：103)：acgttggatggcggcaagatcatcatatggr(seqidno：104)：acgttggatgcgtgatgatcgcctgtacat(各0.3～0.5μm)延伸引物(seqidno：105)：aagcaactaccaccccacgg(5.0～7.0μm)36.gyra_g88c_1126ef(seqidno：106)：acgttggatggcggcaagatcatcatgtagr(seqidno：107)：acgttggatgcgtgatgatcgcctgtaact(各0.3～0.5μm)延伸引物(seqidno：108)：acaactaccaccaccgc(5.0～7.0μm)37.gyra_d94_3r-1f(seqidno：109)：acgttggatgagaccatgggcaactcaaccr(seqidno：110)：acgttggatgtccaccagcgggtgagcca(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：111)：aaggccatgcgcaccgaaggtt(6.0～8.0μm)38.gyra_d94_3r-2f(seqidno：112)：acgttggatgagaccatgggcaactcaaccr(seqidno：113)：acgttggatgtccaccagcgggtgagcca(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：114)：aagggcatgcgcaccgtcgagt(6.0～8.0μm)39.gyrb-180f(seqidno：115)：acgttggatggcggcaagatcatctataggr(seqidno：116)：acgttggatgcgtgatgatcgcctagtcat(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：117)：gaccgggtgaatacg(5.0～7.0μm)40.gyrb539f(seqidno：118)：acgttggatggcggcaagatcatctataggr(seqidno：119)：acgttggatgcgtgatgatcgcctagtcat(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：120)：tgatcgcctgacatctg(5.0～7.0μm)41.gyrb_n538r_4rf(seqidno：121)：acgttggatgggcaagatcatcagatgtgar(seqidno：122)：acgttggatgatcttgtggtagcgactcgt(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：123)：gtgatgatcgcctgaactctgtgg(5.0～7.0μm)42.gyrb_a543tf(seqidno：124)：acgttggatgggcaagatcatcagatgtgar(seqidno：125)：acgttggatgatcttgtggtagcgactcgt(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：126)：gtgctaaagaacaccgaatgactg(5.0～7.0μm)43.gyrb_a543vf(seqidno：127)：acgttggatgggcaagatcatcagatgtgar(seqidno：128)：acgttggatgatcttgtggtagcgactcgt(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：129)：gcccagcgccgtgagttac(5.0～7.0μm)44.gyrb_g551rf(seqidno：130)：acgttggatgggcaagatcatcagatgtgar(seqidno：131)：acgttggatgatcttgtggtagcgactcgt(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：132)：ctatcgaactcgtcgtgagctc(6.0～8.0μm)45.gyrb498f(seqidno：133)：acgttggatgcgcaagtccgaacttggattr(seqidno：134)：acgttggatgcgctttctccacatgtgata(各0.3～0.5μm)延伸引物(seqidno：135)：caagtccgaactgtatgcttga(5.0～7.0μm)46.gyrb509f(seqidno：136)：acgttggatgcgcaagtccgaacttggattr(seqidno：137)：acgttggatgcgctttctccacatgtgata(各0.3～0.5μm)延伸引物(seqidno：138)：gccatggaacatcgaatccgagc(7.0～9.0μm)47.gyrb500-3f(seqidno：139)：acgttggatgcgcaagtccgaacttggattr(seqidno：140)：acgttggatgcgctttctccacatgtgata(各0.3～0.5μm)延伸引物(seqidno：141)：ttagaaccgccggcgcgat(6.0～8.0μm)48.rpsl-88f(seqidno：142)：acgttggatggatgatcttgtagccagaccr(seqidno：143)：acgttggatgaacctgcaggagcatcacgt(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：144)：atcgcacaccaggcatgcgc(7.0～9.0μm)49.rpsl_t40_2ff(seqidno：145)：acgttggatggatgatcttgtagccagaccr(seqidno：146)：acgttggatgaacctgcaggagcatcacgt(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：147)：gtatgcacccgcgtgtcaccaa(6.0～8.0μm)50.rpsl_k43_4rf(seqidno：148)：acgttggatggatgatcttgtagccagaccr(seqidno：149)：acgttggatgaacctgcaggagcatcacgt(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：150)：tttccgaagcgccgagttcttcggc(5.0～7.0μm)51.folc-43f(seqidno：151)：acgttggatgtgagcatctactccaagaccr(seqidno：152)：acgttggatgtccatcaacgcgatgctcc(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：153)：gggtcaggctcatcggg(6.0～8.0μm)52.thya-202f(seqidno：154)：acgttggatgttgctcacccacaggtagtcr(seqidno：155)：acgttggatgttgtcgtagatgtagtggcc(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：156)：cggtcggcgagttctgcatg(7.0～9.0μm)53.tlya_n236kf(seqidno：157)：acgttggatgagtttgaggtgggggagaatr(seqidno：158)：acgttggatgaatcccttggcaagacct(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：159)：acaggaagtcgaactc(10.0～11.0μm)54.rrs-g1484t_2f(seqidno：160)：acgttggatgccggtacggctacttttgcar(seqidno：161)：acgttggatgaaagtcggtaacacacagcg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：162)：aaggtgggatcggcgatgtgagc(7.0～9.0μm)55.rrs_a514ctf(seqidno：163)：acgttggatgtcgggttgtaaaccttctctar(seqidno：164)：acgttggatgcgagctctttacgagtccca(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：165)：aagcaccggccaactacgcagtgcc(5.0～7.0μm)56.rrs_c517tf(seqidno：166)：acgttggatgtcgggttgtaaaccttctctar(seqidno：167)：acgttggatgcgagctctttacgagtccca(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：168)：ctcgcaccctacgtaccgttac(8.0～10.0μm)57.rrs-a1401gf(seqidno：169)：acgttggatgttcgggtgttaccttcgatcr(seqidno：170)：acgttggatgtaatcgcagatcaacggcac(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：171)：tgttaccgactttcaactgg(7.0～9.0μm)58.rrs_c513t_1126ef(seqidno：172)：acgttggatgtcgggttgtaaactttcctcar(seqidno：173)：acgttggatgcgagctctttacgagtccca(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：174)：aagcaccggccaactacgtcagcg(5.0～7.0μm)59.rrs_c462tf(seqidno：175)：acgttggatgtcgggttgtaaactttcctcar(seqidno：176)：acgttggatgcgagctctttacgagtccca(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：177)：aacgacgaaggtggtccgt(8.0～10.0μm)60.rrl-a2059gf(seqidno：178)：acgttggatgaagctatagtgaacccggtgr(seqidno：179)：acgttggatgactcggcgaaattctagcac(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：180)：tatattgaaggtcccgtcgggt(8.0～10.0μm)61.rrl-a2058gf(seqidno：181)：acgttggatgaagctatagtgaccctggagr(seqidno：182)：acgttggatgactcggcgaaattctagcac(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：183)：gtgaaggtcccgtctgggt(7.0～9.0μm)62.alr-261_e3f(seqidno：184)：acgttggatgacctgacgttcgaggttccgr(seqidno：185)：acgttggatgagcacatttcacgctactgg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：186)：atcgcggtgtatgtgagcta(5.0～7.0μm)63.gidb_e92df(seqidno：187)：acgttggatgaccggcatctactctggaacr(seqidno：188)：acgttggatgacgcccagatccactgtc(各0.5～0.7μm)延伸引物(seqidno：189)：tgccgaccaggtagttctagtcca(6.0～8.0μm)64.rv0678-c466tf(seqidno：190)：acgttggatgtcagtcgtcctctgttccgcr(seqidno：191)：acgttggatgggatctgttggcaatatgtg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：192)：ccccttcgctggtatctgc(7.0～9.0μm)65.rv0678-g193df(seqidno：193)：acgttggatgccaaattggatcatccgcagr(seqidno：194)：acgttggatgtgctggtgtgtgacgatccg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：195)：tggtgctcccgatcc(5.0～7.0μm)66.erm-c28tf(seqidno：196)：acgttggatggtcatcagtgagctacggacr(seqidno：197)：acgttggatgcgatatctttggatgggcag(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：198)：agctgcggatacccccagc(7.0～9.0μm)67.rplc-t460c_e2f(seqidno：199)：acgttggatgtttcgccggcacgaacatgr(seqidno：200)：acgttggatgatccgggtgcccaacttga(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：201)：ttatttgggctccatgcggcga(7.0～9.0μm)68.eis_g-10a_1126ef(seqidno：202)：acgttggatgcgtgatcctttgcacacagcr(seqidno：203)：acgttggatggaaatcggtgaaagccctgg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：204)：agggtcacagtcacagccgaata(5.0～7.0μm)69.eis-c14t_1126ef(seqidno：205)：acgttggatgcgtgatcctttgccagacacr(seqidno：206)：acgttggatggaaatcggtgaaactggccg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：207)：gattctgtgactgccctgat(5.0～7.0μm)70.eis_c-2af(seqidno：208)：acgttggatgcgtgatcctttgccagacacr(seqidno：209)：acgttggatggaaatcggtgaaactggccg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：210)：tacacagggtcaccacagta(5.0～7.0μm)71.eis_c-12tf(seqidno：211)：acgttggatgcgtgatcctttgccagacacr(seqidno：212)：acgttggatggaaatcggtgaaactggccg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：213)：tggccgcggcagcctata(5.0～7.0μm)72.eis-g37t_1126ef(seqidno：214)：acgttggatgcgtgatcctttgccagacacr(seqidno：215)：acgttggatggaaatcggtgaaactggccg(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：216)：cctgtcgtcgtaatcatatc(5.0～7.0μm)；所述结核分枝杆菌复合菌群鉴定引物组包括以下基因变异位点和引物：73.tb10f(seqidno：217)：acgttggatgaagcagccaataagcagaagcr(seqidno：218)：acgttggatgagcccatttgcgaggaca(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：219)：gacgaatattcgtgcccagg(6.0～8.0μm)74.tb78f(seqidno：220)：acgttggatgcggcaacagatttggcgaar(seqidno：221)：acgttggatgcgctccgaacaacgcggctat(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：222)：ttagtgcagccaacgccgcggc(5.0～7.0μm)75.tb81f(seqidno：223)：acgttggatgcctgctgcactccatctacr(seqidno：224)：acgttggatgcgtcgagtacccgatcatat(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：225)：ccccgacgccgaagtttcag(5.0～7.0μm)76.mce3bf(seqidno：226)：acgttggatgttcctgctgattgtctccgtr(seqidno：227)：acgttggatgtcggggttgatggtccaggt(各0.1～0.3μm)延伸引物(seqidno：228)：cccaacgtgtctctcaag(7.0～9.0μm)77.tb61f(seqidno:230)：acgttggatggcctacctcggggtttgtcr(seqidno:231)：acgttggatgggtccaaggttcgtgctc延伸引物(seqidno：232)：ttgtcaccgacgcctcacggcgca延伸引物(seqidno：233)：gatcgcgtcgaggacgctaagggt。下面以rpob基因(编码rna聚合酶beta亚基)氨基酸第516位情况为例进行说明：首先是位点编号说明：atcga12345应当知晓的是，一个氨基酸是由三个核苷酸(碱基)组成的字母编码的，如果这三个字母，如上面的例子所示，是加粗的tcg的话，那么1号位指编码该氨基酸的第一个碱基(t)前面那个碱基(a)，t本身是2号位，以此类推，5号位则是第三个碱基(g)下游的那个碱基(a)。引物序列rpob_d516_1f：表示以rna聚合酶beta亚基氨基酸第516位(野生情况下该位点编码的氨基酸是d，即天冬氨酸)第一个核苷酸前面一位(即1号位)碱基作为延伸引物的终止位点，设计的正向(5’--->3’)延伸引物。引物命名中像516这些代表位置的数字前后的字母，如果是大写则表示是氨基酸，小写则表示是核苷酸。rpob_d516_3r：表示以rna聚合酶beta亚基氨基酸第516位第二个核苷酸(即3号位)碱基作为延伸引物的终止位点，设计的反向(3’--->5’)延伸引物。同样是这个d516位点，其可能存在的变异形式包括以下7种：d516y(gac-->tac，对应的氨基酸由天冬氨酸变成酪氨酸)d516f(gac-->ttc，对应的氨基酸由天冬氨酸变成苯丙氨酸)d516v(gac-->gtc，对应的氨基酸由天冬氨酸变成缬氨酸)d516g(gac-->ggc，对应的氨基酸由天冬氨酸变成甘氨酸)d516a(gac-->gcc，对应的氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸)d516a(gac-->gcg，对应的氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸)d516e(gac-->gag，对应的氨基酸由天冬氨酸变成谷氨酸)。要区分上述7种情况，可以使用4种不同的延伸引物(rpob_d516_1f，rpob_d516_2f，rpob_d516_3r和rpob_d516_5r)，搭配各自的正向及反向扩增引物(可能相同)。为了避免不同延伸引物之间相互干扰，实际使用时可能有必要将它们放在massarray不同孔里面。比如后面5种变异情况，使用rpob_d516_2f和rpob_d516_5r就可以区分，可以放在同一个孔里(w4)，而前面两种情况需要结合rpob_d516_1f和rpob_d516_3r的结果才能区分，所以这两个引物需要放在相互独立且和w4不同的孔里(例如，w2和w3)。应当理解的是，不是所有的氨基酸位点都是3个核苷酸位点都有较高的变异频率，有些氨基酸突变就相对简单，检测一个核苷酸位点突变即可。应当注意的是，上述序列可能有冗余，例如1-6号基因位点的正向和反向扩增引物对相同，但延伸引物不同，总体原则：不可能有两个位点会拥有完全相同的三对序列。所述耐药性检测引物组可实现对16种药物的耐药性的同时检测，所述16种药物包括：利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氟喹诺酮类、链霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸钠、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、环丝氨酸、氯法齐明、贝达喹啉、利奈唑胺。本发明利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry)，在massarray平台采取与pcr相结合的方法，对临床样本中是否存在结核分枝杆菌复合菌群进行鉴定，并且同时检测其对治疗药物的耐药核酸突变，确定样本中分枝杆菌的耐药情况，辅助临床选择有效的治疗方案。massarray系统是使用质谱分析精确测量pcr扩增产物的非荧光检测平台。质谱分析与终点法pcr相结合，在通用的循环条件下实现了高度多重性的反应，以提供精确、快速且经济高效的分析。massarray是基于maldi-tof(基质辅助激光解吸/电离-飞行时间)质谱的检测方法。此系统使用pcr来扩增含有每个snp的基因片段，其中延伸引物在多态性碱基附近退火，并且最后一个碱基与检测的snps互补，因此当反应扩增至此碱基时，此片段的延伸反应终止。由于最后一个碱基的质量也有所不同，因此通过质谱可检测不同基因片段之间的质量差异，进而计算出此片段中存在的snps。脉冲紫外激光将产物进行电离，高压静电场使离子化的dna分子从真空管底部加速到达顶部。由于更轻的离子在电场中运动得更快，因此较轻的dna分子可以更早地撞击到检测管顶部的检测器。在每次激光脉冲发射之后，检测器会记录每个分析物的相对飞行时间，从而可以计算出dna片段的质量，进而确定检测片段上的多态性位点处存在的snps的具体类型。由于激光发射到信号检测的整个过程只需几毫秒，因此可以在不到50分钟的时间内分析多达384个样品。massarray系统利用有限的加入样本为靶向基因检测提供了独特的解决方案。与全基因组关联分析(gwas)相比，massarray系统的自定义功能更强，可以对有限的具有重要意义的snps进行精准分析，从而提高准确性和时效性。本发明克服了目前常用检测方法灵敏度低、周期长、成本高、检测范围窄的缺点，在这些方面做了针对性的开发和优化。本发明可用于临床治疗参考，也可用作流行病学研究。本发明的重要应用是可以对肺结核或其它种类结核病患者，采用来源于人体的临床样本(痰液、血液、尿液、灌洗液、脑脊液等)或培养物(loewenstein-jensen培养基或mgit液体培养基)，可以有以下应用：a)确定患者肺部或其它组织中结核分枝杆菌复合群的存在；b)同时确定结核分枝杆菌耐药性，包括16种(类)一线及二线药物：利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氟喹诺酮类(氧氟沙星、左氧氟沙星)、链霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸钠、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、环丝氨酸、氯法齐明、贝达喹啉、利奈唑胺。本检测利用maldi-tofms结合pcr的方法，对不同药物对应的结核杆菌基因突变进行检测，进而鉴定特定患者的抗结核药物耐药情况。例如，利福平的耐药与rna聚合酶β亚基基因(rnapolymerasebetasubunit，rpob)的位点突变有关，异烟肼的耐药与过氧化氢酶编码基因(catalaseperoxidase，katg)和烯酰-酰基载体蛋白还原酶基因启动子基因(inha-15)的突变有关。除一线药物(利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺等4种)外，结核杆菌对二线药物的耐药也可进行检测，本检测可以对16种(类)抗结核药物进行耐药性检测，实现快速、同时、准确的耐药性检测。综上所述，根据本发明提供的一种利用飞行时间质谱实现结核分枝杆菌复合菌群鉴定及耐药性检测的引物组、试剂盒，采用来源于人体的临床样本(痰液、血液、尿液、灌洗液、脑脊液等)或培养物(loewenstein-jensen培养基或mgit液体培养基)，即可以在鉴定结核分枝杆菌复合菌群的同时，对结核分枝杆菌复合菌群16种常用抗结核一线、二线用药耐药基因突变进行高分辨率的区分检测，实现快速、同时、准确的耐药性检测，对临床用药决策进一步提供有力的辅助。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。1.1检验原理本发明采用的检测方法为核酸飞行质谱。首先通过pcr扩增目标序列，然后加入snp序列特异延伸引物，在snp位点上，延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出snp位点信息。1.2主要组成成分10×pcrbuffer；mgcl2溶液；dntp溶液；hstaq；3-ptcalibrant；iplexbufferplus-10×；iplexterminationmix；iplexenzyme；sapbuffer；sapenzyme；引物；ddh2o；阳性对照品；干燥树脂；芯片板。1.3配套仪器通用pcr仪；massarraynanodispenser点样仪，型号rs1000(agenabioscience)；质谱仪massarrayanalyserfour，型号massarrayanalyserfoursystem96/24genotyping(agenabioscience)。1.4样本要求本品适用于从痰液、血液、尿液、灌洗液、脑脊液等临床样本或培养物中提取的结核分枝杆菌基因组dna，要求dnaa260/a280比值应介于1.8到2.0之间。冷冻dna样本应保存在-20℃以下，并且避免反复冻融。1.5检验方法1.5.1pcr反应1)在pcrⅰ区，从-20℃冰箱中将各试剂(盒)取出，置于冰上(4℃)融解，再从4℃冰箱取出扩增引物，均涡旋震荡10s后简短离心，备用。2)按表1依次加入相关试剂组分配置pcr反应混合液，并做好标记，分装至96孔板中，3μl/孔；分装完后从pcrⅰ区通过传递窗传至ⅱ区。pcr混合液组成如表1所示。表1：pcr混合液3)在pcrⅱ区，从-20℃冰箱取出dna模板，冰上(4℃)融解，涡旋震荡10s后简短离心，吸出一定量dna稀释至5ng/μl，备用。4)向96孔板中每孔加入2μl5ng/μldna模板，盖上管盖，涡旋震荡10s后简短离心，从pcrⅱ区通过传递窗传至ⅲ区，再从pcrⅲ区通过传递窗传至ⅳ区，每次实验时必须设定空白对照(2μlddh2o)、阴性对照(2μldna提取洗脱液)和阳性对照。5)将96孔板放入扩增仪，运行程序：pcr，具体程序如下：1.5.2sap反应pcr反应结束后，根据表2在1.5mlep管中配制sap混液。表2的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。该配置过程在pcrⅰ区完成。表2：sap反应混合液1)将配制好的sap混液由pcrⅰ区传递至ⅳ区，加2μlsap混液到每一个孔里(加混液后总体积：7μl)。2)把板用膜(用life的或其它公司质量较好的膜)封好，涡旋震荡和离心(4000rpm5秒)。3)将板放上pcr仪进行以下程序：37℃40分钟，85℃5分钟，4℃保温。1.5.3延伸反应1)取出sap反应板2000rpm离心1min。2)根据表3在1.5ml管中配制iplex延伸反应液。表3的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。请根据实际反应的数量调整数字。该配置过程在pcrⅰ区完成。表3：iplex延伸反应液3)将iplex延伸混液由pcrⅰ区传递至ⅳ区，每一个孔加入2μliplex延伸混液并混好(加混液后总体积：9μl)。4)把板用膜封好，涡旋震荡和离心(4000rpm5秒)。5)将96孔板放上pcr仪进行以下热循环：1.5.4调节(样本脱盐)以下程序为一块96孔板而设，请根据实际孔的数量调节程序。戴上手套和护眼镜。1)把洁净树脂(resin)铺平在96/15mgdimpleplate上，风干最少10分钟。注意：先用勺子将树脂铺放在板上，然后用刮板刮从左至右或从右至左刮树脂，使96个孔都被树脂填满，当96个孔都被填满后再用刮板轻轻地刮一遍并将表面残留的树脂刮下去，防止干扰下步贴膜。当树脂由深黄变为淡黄色，即表明树脂已经干的差不多了。2)在样本板的每一个有样本的孔里加入41μl水，封膜(用普通的膜即可)，然后离心。3)加入15mg洁净树脂(resin)：轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的dimpleplate上，一定要孔对孔！然后将dimpleplate连样本板一起反转(过程中两块板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。4)用膜(用普通的膜即可)把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。5)以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5分钟。1.5.5点样按照massarraynanodispenser操作说明将pcr产物转移至芯片板。1.5.6质谱分析1)从点样仪中取出芯片板。2)用镊子将芯片板转移至massarrayanalyserfour芯片槽，芯片印有文字的一面朝外，并用镊子将芯片向左下方方向挤压。3)按照massarrayanalyserfour操作说明，进行飞行质谱检测及结果读出。1.6检验结果的解释1)试剂盒有效性判定：标准品可以检测对应基因型，空白对照品(ddh2o)无信号检出，弱阳性对照可以检出对应阳性信号时，此次检测结果有效，否则此次检测结果无效。1.7检验方法的局限性1)本方法可能受到检测样本dna质量的影响，如果检测样本dna质量较差，可能出现假阴性结果。2)本检测结果仅供临床用药参考，用于指导个体化用药，不能作为临床用药的唯一依据。3)当本品检出对应位点的基因型为敏感型时，不能排除该基因还有其它位点的突变。案例一1.病例特点：1.1沈某某，男，69岁，农民，发现结核感染一周入院，有“ii型糖尿病”病史。1.2入院检查结果：神志清晰，精神稍微疲软，呼吸比较平稳，口唇无紫绀，浅表淋巴结未及肿大，气管居中，心脏听诊正常，胸廓无畸形，肋间隙无增减，两肺呼吸音粗，未听到干湿锣音，腹部柔软，无压痛及反痛。肝脾肋下未及，移浊阴性，双下肢不肿，生理反射存在，病理反射未引出。1.3辅检：耐药及快速耐药试验异烟胼、利福平、链霉素、乙胺丁醇。2.诊断依据：患者，老年男性，因“发现耐多药结核感染”住院，查体：浅表淋巴结未及肿大，两肺呼吸音粗，未闻及锣音。结核分枝杆菌耐药及快速耐药试验异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇。3.鉴别诊断：患者耐多药诊断明确。4.诊断：两肺组发性肺结核涂阳初治耐多药，ii型糖尿病。5.诊疗方案：5.1完善相关必要检查(纤支镜、听力、视野等)明确诊断及病情；5.2排除禁忌后给予耐药方案治疗。6.基因检测结果6.1分枝杆菌检测结果6.2一线药物耐药基因突变检测结果(tb)6.3二线药物耐药基因突变检测结果(tb)案例二1.病例特点：陈某某，男性，67岁，农民。2.入院诊断：两肺继发性结核，初治，涂片检测阳性，心律失常——完全性右束支传导阻滞，原发性甲状腺功能亢进graves病，甲状腺结节，白细胞减少，血小板减少。3.目前诊断：两肺继发性结核，初治，涂片检测阳性，耐异烟肼，糖尿病，心律失常——完全性右束支传导阻滞，左前分支传导阻滞，原发性甲状腺功能亢进graves病，甲状腺结节，白细胞减少，血小板减少。4.目前病情：患者诉咳嗽咳痰不明显，稍有腹部不适，感下肢疼痛，无恶心呕吐，无畏寒发热，无胸闷气促，查体：神清，呼吸平稳，口唇不绀，颈静脉无怒张，心前区无隆起，未及震颤，叩诊心界左大。心律齐，未闻及明显杂音。两肺呼吸音清，未闻及湿锣音。腹平软，无压痛，双下肢无浮肿。可能意外及风险：1.病情加重，出现咯血、气胸、胸腔积液等并发症，甚至出现大咯血，血疑块堵塞呼吸道，窒息死亡。2.病情加重，肺部感染加重，甚至呼吸衰竭，导致多器官功能衰竭，甚至死亡。3.如为结核感染，结核播散，引起其它器官组织结核，如结核性脑膜炎，消化道结核，泌尿系结核等。4.治疗过程中出现药物反应，输液反应，以及抗结核药物所致的肝肾功能损害、发热、皮疹等，甚至过敏性休克而危及生命。5.患者年龄较大，治疗过程中出现不可预料的意外，如肺栓塞、心脑血管意外、脑出血、脑梗塞等危及生命。6.可能存在其它药物的耐药情况，为多耐药结核感染。7.患者基础疾病较多，结核预后不佳。5.防范措施：完善药物明确试验。2、注意休息，加强营养，忌烟酒。3.住院期间配合医务人员检查及治疗。4.住院期间不得擅自离院。5.住院期间可能出现病情进展，病情恶化，患方可考虑转上级医院继续治疗。6.基因检测结果6.1分枝杆菌检测结果6.2一线药物耐药基因突变检测结果(tb)6.3二线药物耐药基因突变检测结果(tb)以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。sequencelisting<110>上海康黎诊断技术有限公司<120>一种结核分枝杆菌复合菌群鉴定及耐药性检测的相关基因、方法、引物组以及试剂盒<160>233<170>patentinversion3.5<210>1<211>29<212>dna<213>人工序列<400>1acgttggatgtcacaccgcctaccatcat29<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<400>2acgttggatgattctcagctgacaggtcg29<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3aatacctcaacaagccgcagt21<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列<400>4acgttggatgtcacaccgcctaccatcat29<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列<400>5acgttggatgattctcagctgacaggtcg29<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列<400>6aactgtccggcttgagg17<210>7<211>29<212>dna<213>人工序列<400>7acgttggatgtcacaccgcctaccatcat29<210>8<211>29<212>dna<213>人工序列<400>8acgttggatgattctcagctgacaggtcg29<210>9<211>16<212>dna<213>人工序列<400>9cagaagcggccactct16<210>10<211>29<212>dna<213>人工序列<400>10acgttggatgtcacaccgcctaccatcat29<210>11<211>29<212>dna<213>人工序列<400>11acgttggatgattctcagctgacaggtcg29<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列<400>12gggtccatgaattgcctg18<210>13<211>29<212>dna<213>人工序列<400>13acgttggatgtcacaccgcctaccatcat29<210>14<211>29<212>dna<213>人工序列<400>14acgttggatgattctcagctgacaggtcg29<210>15<211>24<212>dna<213>人工序列<400>15ttattggtcgcggcgatcaagcag24<210>16<211>29<212>dna<213>人工序列<400>16acgttggatgtcacaccgcctaccatcat29<210>17<211>29<212>dna<213>人工序列<400>17acgttggatgattctcagctgacaggtcg29<210>18<211>23<212>dna<213>人工序列<400>18tttttacaccagccagcagacgc23<210>19<211>30<212>dna<213>人工序列<400>19acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>20<211>29<212>dna<213>人工序列<400>20acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>21<211>15<212>dna<213>人工序列<400>21accagccagcagtgc15<210>22<211>30<212>dna<213>人工序列<400>22acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>23<211>29<212>dna<213>人工序列<400>23acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>24<211>17<212>dna<213>人工序列<400>24ttgttctggtccgataa17<210>25<211>30<212>dna<213>人工序列<400>25acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>26<211>29<212>dna<213>人工序列<400>26acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>27<211>15<212>dna<213>人工序列<400>27agcgggttgtgtctg15<210>28<211>30<212>dna<213>人工序列<400>28acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>29<211>29<212>dna<213>人工序列<400>29acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>30<211>16<212>dna<213>人工序列<400>30acttgtgggtcccaac16<210>31<211>30<212>dna<213>人工序列<400>31acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>32<211>29<212>dna<213>人工序列<400>32acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>33<211>16<212>dna<213>人工序列<400>33gctgagccaatattcg16<210>34<211>30<212>dna<213>人工序列<400>34acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>35<211>29<212>dna<213>人工序列<400>35acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>36<211>22<212>dna<213>人工序列<400>36gttgacccacaagcgctcagcg22<210>37<211>30<212>dna<213>人工序列<400>37acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>38<211>29<212>dna<213>人工序列<400>38acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>39<211>16<212>dna<213>人工序列<400>39cagaccgccgcccggc16<210>40<211>30<212>dna<213>人工序列<400>40acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>41<211>29<212>dna<213>人工序列<400>41acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>42<211>17<212>dna<213>人工序列<400>42accagaacaacctgccg17<210>43<211>30<212>dna<213>人工序列<400>43acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>44<211>29<212>dna<213>人工序列<400>44acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>45<211>18<212>dna<213>人工序列<400>45aactacagtcggcttcgg18<210>46<211>30<212>dna<213>人工序列<400>46acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>47<211>29<212>dna<213>人工序列<400>47acgttggatgacgctcacgtgcaagcacg29<210>48<211>17<212>dna<213>人工序列<400>48aacagcgggttcgtttg17<210>49<211>30<212>dna<213>人工序列<400>49acgttggatggatcaaggagttctctgcga30<210>50<211>29<212>dna<213>人工序列<400>50a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