本发明属于生物医用材料领域,具体涉及一种仿生糖聚肽水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术:
全球每年有超过580万人因严重的创伤而死亡,其中大约40%的死亡是由于大量失血及其并发症引起的。高分子水凝胶具有和生物组织类似的微结构和良好的生物相容性,具有止血、防止组织发炎、促进组织重构而加速伤口愈合的生物功能。目前已开发出天然多糖、天然蛋白、聚乙二醇类水凝胶等重要品种,但它们仍存在组织粘附性和生物相容性差、止血时间长、止血率偏低、以及伤口愈合时间长等问题。中国专利cn110448721b公布一种抗菌粘附导电止血抗氧化的可注射复合水凝胶及其制备方法和应用,通过多巴胺接枝明胶、聚多巴胺包覆碳纳米管和壳聚糖三种组分混合制备而成,其具有组织粘附、止血和促愈合的效果,但是该水凝胶的制备方法复杂,而且其中含有不可降解的碳纳米管,在体内存在长期的生物毒性,难于在临床转化应用。
技术实现要素:
针对现有技术存在的不足,本发明的主要目的提供了一种仿生糖聚肽水凝胶,可以实现快速止血和促进愈合的双重生物功效,解决现有水凝胶体系中组织粘附性和生物相容性差、止血时间长、止血率偏低以及伤口愈合时间长等问题。
本发明的另一目的在于提供上述仿生糖聚肽水凝胶的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述仿生糖聚肽水凝胶在伤口止血和组织愈合方面的应用。
本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明提供一种仿生糖聚肽,选自如下结构式(1)或(2):
r1独立地选自
r2独立地选自
n、m、o均为正整数,n、m、o相同或不相同。
本发明中,所述仿生糖聚肽以聚赖氨酸为骨架高分子,邻苯二酚基团和寡糖修饰在聚赖氨酸的高分子链中得到;其中,所述聚赖氨酸选自α–聚赖氨酸(apl)和/或ε–聚赖氨酸(epl),重均分子量为3500–70000da。
优选地,所述聚赖氨酸选自α–聚赖氨酸,重均分子量为10000–70000da。
本发明还提供一种仿生糖聚肽水凝胶,孔径为8–20μm,溶胀率为100–600%,粘结强度为10–90kpa,通过所述仿生糖聚肽在配位键动态交联或共价键交联得到,包括配位键仿生糖聚肽水凝胶或共价键仿生糖聚肽水凝胶。
本发明还提供上述仿生糖聚肽水凝胶的制备方法,包括如下步骤:
(1)聚赖氨酸溶于二甲基亚砜(dmso)中,加入糖酸内脂和催化剂三乙胺,25–70℃反应1–3天,反应液透析、冻干后得到糖聚肽;
(2)含邻苯二酚基团的化合物(da)、1–(3–二甲氨基丙基)–3–乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n–羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶于dmso中,搅拌2–12h后加入聚赖氨酸或者步骤(1)得到的糖聚肽,20–50℃反应1–3天,反应液经透析、冻干后获得产物仿生聚肽或仿生糖聚肽;
(3)步骤(2)所得产物溶于pbs中得到浓度为4–25%(w/v)的聚合物溶液,与fe3+溶液充分混合,在10–40s内得到配位键仿生糖聚肽水凝胶;其中da:fe3+的摩尔比为1–4:1;或者
(4)步骤(2)所得产物溶于pbs中得到浓度为3–15%(w/v)的聚合物溶液,分别与浓度为1–100units/ml的辣根过氧化酶(hrp)和10–300mm的h2o2溶液混合,将两种混合溶液快速混合,在7–30s内得到共价键仿生糖聚肽水凝胶;或者
步骤(2)所得产物溶于pbs中得到浓度为3–15%(w/v)的聚合物溶液,依次与浓度为1–100units/ml的hrp和10–300mm的h2o2溶液混合,在7–30s内得到共价键仿生糖聚肽水凝胶;或者
步骤(2)所得产物溶于pbs中得到浓度为3–15%(w/v)的聚合物溶液,与0.1–100mm的naio4溶液混合,在7–30s内得到共价键仿生糖聚肽水凝胶。
优选地,步骤(1)中,所述糖酸内脂的接枝率为10%–60%,选自葡萄糖酸内脂和/或乳糖酸内脂。
优选地,步骤(2)中,所述含邻苯二酚基团的化合物选自3,4–二羟基苯基丙酸、3,4–二羟基苯乙酸、3,4–二羟基苯甲酸、没食子酸中的一种或多种,其中邻苯二酚基团接枝率为10%–40%。
更优选地,步骤(2)中,所述含邻苯二酚基团的化合物中邻苯二酚基团接枝率为20%。
优选地,步骤(3)中,所述聚合物溶液的浓度为4%(w/v),da:fe3+的摩尔比为3:1;和/或fe3+来自于三氯化铁、六水合三氯化铁、硝酸铁、硫酸铁中的一种或多种。
更优选地,步骤(3)中,所述糖酸内脂的接枝率为40%,和/或fe3+来自于六水合三氯化铁。
优选地,步骤(4)中,所述聚合物溶液、hrp和h2o2的浓度分别为3%(w/v)、8units/ml和70mm。
本发明还提供所述仿生糖聚肽水凝胶在伤口止血和组织愈合方面的应用。
优选地,所述仿生糖聚肽水凝胶的7天伤口愈合率为88%,14天伤口愈合率为100%。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)受细胞外基质糖蛋白或蛋白聚糖和贻贝粘附蛋白的结构与功能的双重启发,本发明通过简单的化学修饰高效地制备出一类新型结构的仿生糖聚肽,以聚赖氨酸为骨架高分子,将邻苯二酚基团和寡糖修饰在聚合物分子链中得到仿生糖聚肽,在配位键动态交联或共价键交联作用下制备出配位键仿生糖聚肽水凝胶或共价键仿生糖聚肽水凝胶,解决现有水凝胶体系中组织粘附性和生物相容性差、止血时间长、止血率偏低以及伤口愈合时间长等问题。
(2)本发明中仿生糖聚肽的分子结构有效降低了聚合物的正电荷密度,极大地提高了仿生糖聚肽水凝胶的生物相容性,溶血率降至1%以下,而且通过动态配位键或酶触发的共价键实现了低聚合物浓度的仿生糖聚肽水凝胶的快速制备。
(3)本发明的仿生糖聚肽水凝胶具有可调节的生物粘附强度和微孔结构,从而实现了快速止血和促进愈合的双重效果,且制备方法简单,价格便宜,操作方便,具有临床应用潜能。
参考以下详细说明更易于理解本申请的上述以及其他特征、方面和优点。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著:
图1为实施例3中仿生糖聚肽水凝胶的溶血率;
图2为实施例4中仿生糖聚肽水凝胶对红细胞的吸附;
图3为实施例5中仿生糖聚肽水凝胶对血小板的吸附;
图4为实施例6中仿生糖聚肽水凝胶的肝脏止血时间;
图5为实施例6中仿生糖聚肽水凝胶的肝脏相对失血量;
图6为实施例7中不同时间点的伤口愈合率;
图7为实施例7中皮肤组织的h&e染色照片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例的附图,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1仿生糖聚肽水凝胶的制备
(1)1.28gaplys溶于20mldmso中,然后加入葡萄糖酸内酯(306mg或712mg)和1.4ml三乙胺,50℃反应48h。反应液移入透析袋(截留分子量3500)中,在去离子水中透析48h,经冷冻干燥得糖聚肽p80g20或p60g40,收率为82%。
(2)183mg3,4–二羟基苯基丙酸(da)溶于5mldmso/n,n–二甲基甲酰胺(v:v=3:1)中,然后加入232mgedc和139mgnhs,冰水浴中搅拌6h,然后逐渐升至室温。将10mlapl(0.64g)或p80g20(0.82g)或p60g40(1g)的dmso溶液和284μl三乙胺加入到da溶液中,室温下反应48h。反应液倒入透析袋(截留分子量为3500)中,在去离子水中透析24h,冷冻干燥获得仿生聚肽p80d20或仿生糖聚肽p60g20d20或p40g40d20,收率为85%。
(3)24mgp80d20溶于176μlpbs(ph=7.4)中,强烈搅拌下快速加入24μlfecl3(da:fe3+的摩尔比为3:1)溶液,获得配位键仿生糖聚肽水凝胶gel–1,聚合物浓度为12%。
(4)按照(3)的方法,分别制备p60g20d20和p40g40d20的配位键仿生糖聚肽水凝胶gel–2和gel–3,聚合物浓度为12%。
(5)p40g40d20(24mg,18mg或12mg)溶于100μlpbs(ph=7.4)中形成均匀的聚合物溶液。取50μl聚合物溶液与50μlhrp(8units/ml)溶液混合,另外50μl聚合物溶液与50μlh2o2(140mm)溶液混合,两种混合液通过双通道注射器注射形成共价键仿生糖聚肽水凝胶gel–4、gel–5和gel–6,聚合物浓度分别为12%、9%和6%。
实施例2仿生糖聚肽水凝胶(gel–7和gel–8)的制备
(1)按照实施例1步骤(1)和(2)的方法合成仿生糖聚肽p420g40d20,收率为87%。
(2)按照实施例1步骤(3)制备p420g40d20的配位键仿生糖聚肽水凝胶gel–7,聚合物浓度为4%。
(3)按照实施例1步骤(5)制备p420g40d20的共价键仿生糖聚肽水凝胶gel–8,聚合物浓度为3%。
实施例2与实施例1中aplys的重均分子量不同,实施例1中aplys的重均分子量为12000da,实施例2中aplys的重均分子量为56000da。
实施例3溶血率
将100μl仿生糖聚肽水凝胶浸没到500μl含有枸橼酸钠抗凝剂的兔子血液中,37℃摇床中振荡3h,pbs和1%tritonx–100分别作为阴性和阳性对照组。将血液离心10min(4000rpm),然后吸取200μl上清液加入到5ml去离子水中,使用uv–vis光谱仪测试540nm处的吸光值。根据公式计算得到溶血率:溶血率(%)=(a样品–a阴性)/(a阳性–a阴性)×100%,a表示540nm处的吸光值。每组实验重复5次,结果如图1所示。
实施例4红细胞吸附
将100μl仿生糖聚肽水凝胶制备于96孔板中,每孔中加入50μl含有枸橼酸钠抗凝剂的全血,37℃摇床中孵化10min,然后pbs清洗未吸附的红细胞。将水凝胶转移到含有3ml去离子水的离心管中,37℃摇床中浸泡30min使红细胞完全溶胀破裂,然后用酶标仪检测540nm的吸光值(od),50μl血液加入到3ml去离子水中作为参照组,红细胞吸附(%)=od样品/od参照×100%。所有实验重复六次,结果如图2所示。
实施例5血小板吸附
血液在4000rpm条件下离心10min得到富血小板血浆(prp)。将100μl凝胶制备于96孔板中,50μlprp加入到仿生糖聚肽水凝胶的表面,37℃摇床中孵化10min,然后用pbs清洗未吸附的血小板。将仿生糖聚肽水凝胶转移到含有1mltritonx–100(1%)的离心管中,37℃摇床中浸泡1h,然后按照ldh试剂盒说明书通过酶标仪检测490nm吸光值(od),50μl未经仿生糖聚肽水凝胶处理的prp作为参照组,血小板吸附(%)=od样品/od参照×100%。所有实验重复六次,结果如图3所示。
实施例6体内肝脏止血实验
sd大鼠用戊巴比妥钠麻醉(1.5%,100mg/ml),然后切开腹部将肝脏暴露出来。在肝叶上创建一个直径为5mm的伤口,然后将仿生糖聚肽水凝胶注射到出血位置,将肝叶放置到已经称重的滤纸上面,记录止血时间(图4)和2min内流失血液的质量(图5)。未经处理的伤口作为阴性对照组。相对失血量(%)=m样品/m对照×100%,m样品和m对照分别表示样品组和阴性对照组的失血质量,每组样品重复四次。
实施例7伤口愈合实验
利用sd大鼠皮肤全层缺损模型评估仿生糖聚肽水凝胶对伤口愈合的影响。首先将sd大鼠进行全身麻醉,在背部切割一个直径1cm的圆形伤口,然后将仿生糖聚肽水凝胶填充到伤口位置。制备仿生糖聚肽水凝胶的溶液均用无菌过滤器(0.22μm)过滤后使用。每隔一定时间对伤口进行观察拍照,通过imagej测量伤口的面积。伤口愈合率(%)=(s0–st)/s0×100%,s0:伤口的初始面积;st:第t天伤口的面积,如图6所示,所有的实验重复5次。术后7天和14天,将皮肤组织取材后用4%的多聚甲醛固定,并用石蜡包埋,然后将组织切片用h&e染色后用光学显微镜观察(图7)。