一种牛樟芝菌高密度发酵方法与流程

本发明涉及一种牛樟芝菌高密度发酵方法及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

牛樟芝(antrodiacamphorata)，又名樟芝或牛樟菇，属于担子菌纲、非褶菌目、多孔科、薄孔菌属真菌，是一种原产于我国台湾省的珍稀药用菌，樟芝子实体寄生于牛樟树树干腐朽的内壁或倒伏在地上靠近土表的无树皮表面，具有强烈的牛樟树香气，含有高含量精油。樟芝子实体开始时呈鲜红色、桔褐色，质地柔软；成熟后颜色转为淡红褐色或是淡黄色，质地因木质化而变得坚硬。

牛樟芝具有多种生物学活性，例如保护肝脏、保护神经系统、抗乙肝病毒、抗肿瘤、抗氧化、消炎、增强免疫力等。近年来，牛樟芝得到了越来越多的关注和研究。尤其是其培养方法、生理活性、药理作用等成为热点。

目前，对于牛樟芝的人工培养集中于固体培养，但固体培养易染菌，耗时长。也可以进行深层发酵培养，即将牛樟芝菌种接种于发酵罐内的液体培养基中，通入无菌空气，辅以搅拌，最终获得牛樟芝菌丝体及其代谢产物。但目前为止，液体发酵获得的牛樟芝菌体产量不高。

技术实现要素：

本发明为解决上述问题的不足，提供一种牛樟芝菌高密度发酵方法，该方法发酵周期短，菌体产量高，生产稳定的巨大优势。

本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明通过液体种子培养基培养活化菌株，转入一级发酵罐培养获得一级种液，再转入发酵罐通过参数调控和流加补料培养获得高密度发酵液。

本发明采用的技术方案为：

一种牛樟芝菌高密度发酵方法，包括以下步骤：

a.将保藏号为cicc23812的牛樟芝菌生产种子以1-10％接种量接种到含有碳源和氮源的无菌液体种子培养基中，在温度25-33℃，湿度40-80％的恒温摇床上以转速80-150rpm培养5-10天，得到活化种液；

b.将步骤a的牛樟芝菌活化种子液接种到含有碳源和氮源的无菌液体种子培养基的一级发酵罐内，在温度25-33℃，搅拌转速50-200rpm，通气量1:0.1-1:1条件下培养5-10天，得到一级种液；

c.将步骤b的牛樟芝菌活化一级种液以5-20％接种量接种到含有碳源和氮源的无菌液体发酵培养基的发酵罐内，在温度25-33℃，搅拌转速50-200rpm，通气量1:0.1-1:1条件下培养10-20天，发酵过程中采用流加含有碳源和氮源的补料培养基的方式来提高菌丝密度，即可获得菌密度不低于400g/l的牛樟芝菌发酵液。

优选的，所述步骤a和步骤b中的无菌液体种子培养基为：包括碳源10-50g/l，氮源5-30g/l，磷酸氢二钾0.5-2.0g/l，七水合硫酸镁0.1-1.0g/l，并调整ph5.0-8.0，在121℃灭菌30分钟。

优选的，所述步骤c中的无菌液体发酵培养基为：包括碳源10-50g/l，氮源5-30g/l，磷酸氢二钾0.5-2.0g/l，七水合硫酸镁0.1-1.0g/l，七水合硫酸亚铁0.1-0.4g/l，并调整ph5.0-8.0，在121℃灭菌30分钟。

优选的，所述步骤c中的补料发酵培养基为：包括碳源100-500g/l，可氮源50-300g/l，并调整ph5.0-8.0，在121℃灭菌30分钟。

优选的，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、淀粉、大豆油中的一种或几种的复配；所述氮源为酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、尿素中的一种或几种的复配；

优选的，所述液体种子培养基或液体发酵培养基的最佳ph为6.5。

优选的，所述牛樟芝菌的最佳培养温度为28℃

优选的，所述牛樟芝菌在培养过程中的最佳通气量为1:0.6。

优选的，所述的牛樟芝菌高密度发酵方法，包括以下具体步骤：

a.制备活化种液。按照前述液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.1g/l，并调整ph5.5，在121℃灭菌30分钟。将保藏号为cicc23812的牛樟芝菌生产种子以1％接种量接种到上述体种子培养基中，在温度26℃，湿度40％的恒温摇床上以转速80rpm培养10天，得到活化种液；

b.制备一级种液。按照权利要求所述的液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.1g/l，并调整ph5.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤a的牛樟芝菌活化种液接种到上述液体种子培养基的一级发酵罐内，在温度26℃，搅拌转速50rpm，通气量1:0.1条件下培养10天，得到一级种液；如图1所示。

c.牛樟芝菌发酵。按照权利要求所述的发酵培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.1g/l，七水合硫酸亚铁0.1g/l，并调整ph5.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤b的牛樟芝菌活化一级种液以5％接种量接种到上述液体发酵培养基的发酵罐内，在温度26℃，搅拌转速50rpm，通气量1:0.1条件下培养20天，发酵过程中采用流加含有葡萄糖500g/l和蛋白胨300g/l的补料培养基的方式来提高菌丝密度，即可获得菌密度不低于400g/l的牛樟芝菌发酵液。

本发明与现有技术相比具有的显著优点为：

(1)该方法可避免杂菌污染，保障生产顺利进行。

(2)该方法可缩短发酵周期，降低设备运行成本。

(3)该方法可获得400g/l以上的菌密度，是目前国内最高水平。

(3)该方法可成本低，投资少，利于大量生产。

附图说明

图1为本发明所提供的牛樟芝菌活化种液图。

图2为本发明所提供的牛樟芝菌一级种液图。

图3为本发明所提供的牛樟芝菌高密度发酵液图。

具体实施方式

下面参照附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。

参见图1至图3。

本发明一种牛樟芝菌高密度发酵方法，包括以下步骤：

a.将保藏号为cicc23812的牛樟芝菌生产种子以1-10％接种量接种到含有碳源和氮源的无菌液体种子培养基中，在温度25-33℃，湿度40-80％的恒温摇床上以转速80-150rpm培养5-10天，得到活化种液；

b.将步骤a的牛樟芝菌活化种子液接种到含有碳源和氮源的无菌液体种子培养基的一级发酵罐内，在温度25-33℃，搅拌转速50-200rpm，通气量(发酵行业通常是指空气)1:0.1-1:1条件下培养5-10天，得到一级种液；

c.将步骤b的牛樟芝菌活化一级种液以5-20％接种量接种到含有碳源和氮源的无菌液体发酵培养基的发酵罐内，在温度25-33℃，搅拌转速50-200rpm，通气量1:0.1-1:1条件下培养10-20天，发酵过程中采用流加含有碳源和氮源的补料培养基的方式来提高菌丝密度，即可获得菌密度不低于400g/l的牛樟芝菌发酵液。

优选的，所述步骤a和步骤b中的无菌液体种子培养基为：包括碳源10-50g/l，氮源5-30g/l，磷酸氢二钾0.5-2.0g/l，七水合硫酸镁0.1-1.0g/l，并调整ph5.0-8.0，在121℃灭菌30分钟。

优选的，所述步骤c中的无菌液体发酵培养基为：包括碳源10-50g/l，氮源5-30g/l，磷酸氢二钾0.5-2.0g/l，七水合硫酸镁0.1-1.0g/l，七水合硫酸亚铁0.1-0.4g/l，并调整ph5.0-8.0，在121℃灭菌30分钟。

优选的，所述步骤c中的补料发酵培养基为：包括碳源100-500g/l，可氮源50-300g/l，并调整ph5.0-8.0，在121℃灭菌30分钟。

优选的，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、淀粉、大豆油中的一种或几种的复配；所述氮源为酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、尿素中的一种或几种的复配；

优选的，所述液体种子培养基或液体发酵培养基的最佳ph为6.5。

优选的，所述牛樟芝菌的最佳培养温度为28℃

优选的，所述牛樟芝菌在培养过程中的最佳通气量为1:0.6。

优选的，所述的牛樟芝菌高密度发酵方法，包括以下具体步骤：

a.制备活化种液。按照前述液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.1g/l，并调整ph5.5，在121℃灭菌30分钟。将保藏号为cicc23812的牛樟芝菌生产种子以1％接种量接种到上述体种子培养基中，在温度26℃，湿度40％的恒温摇床上以转速80rpm培养10天，得到活化种液；

b.制备一级种液。按照权利要求所述的液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.1g/l，并调整ph5.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤a的牛樟芝菌活化种液接种到上述液体种子培养基的一级发酵罐内，在温度26℃，搅拌转速50rpm，通气量1:0.1条件下培养10天，得到一级种液；如图1所示。

c.牛樟芝菌发酵。按照权利要求所述的发酵培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.1g/l，七水合硫酸亚铁0.1g/l，并调整ph5.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤b的牛樟芝菌活化一级种液以5％接种量接种到上述液体发酵培养基的发酵罐内，在温度26℃，搅拌转速50rpm，通气量1:0.1条件下培养20天，发酵过程中采用流加含有葡萄糖500g/l和蛋白胨300g/l的补料培养基的方式来提高菌丝密度，即可获得菌密度不低于400g/l的牛樟芝菌发酵液。

实施例1

a.制备活化种液。按照前述液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.1g/l，并调整ph5.5，在121℃灭菌30分钟。将保藏号为cicc23812的牛樟芝菌生产种子以1％接种量接种到上述体种子培养基中，在温度26℃，湿度40％的恒温摇床上以转速80rpm培养10天，得到活化种液；

b.制备一级种液。按照权利要求所述的液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.1g/l，并调整ph5.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤a的牛樟芝菌活化种液接种到上述液体种子培养基的一级发酵罐内，在温度26℃，搅拌转速50rpm，通气量1:0.1条件下培养10天，得到一级种液；如图1所示。

c.牛樟芝菌发酵。按照权利要求所述的发酵培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水合硫酸镁0.1g/l，七水合硫酸亚铁0.1g/l，并调整ph5.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤b的牛樟芝菌活化一级种液以5％接种量接种到上述液体发酵培养基的发酵罐内，在温度26℃，搅拌转速50rpm，通气量1:0.1条件下培养20天，发酵过程中采用流加含有葡萄糖500g/l和蛋白胨300g/l的补料培养基的方式来提高菌丝密度，即可获得菌密度不低于400g/l的牛樟芝菌发酵液。

实施例2

a.制备活化种液。按照所述的液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，并调整ph6.5，在121℃灭菌30分钟。将保藏号为cicc23812的牛樟芝菌生产种子以5％接种量接种到上述体种子培养基中，在温度28℃，湿度50％的恒温摇床上以转速100rpm培养8天，得到活化种液；

b.制备一级种液。按照权利要求所述的液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，并调整ph6.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤a的牛樟芝菌活化种液接种到上述液体种子培养基的一级发酵罐内，在温度28℃，搅拌转速100rpm，通气量1:0.6条件下培养6天，得到一级种液。

c.牛樟芝菌发酵。按照权利要求所述的发酵培养基中各组分的配比准确称取各组分，蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，七水合硫酸亚铁0.2g/l，并调整ph6.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤b的牛樟芝菌活化一级种液以5％接种量接种到上述液体发酵培养基的发酵罐内，在温度28℃，搅拌转速100rpm，通气量1:0.6条件下培养16天，发酵过程中采用流加含有葡萄糖400g/l和蛋白胨200g/l的补料培养基的方式来提高菌丝密度，即可获得菌密度不低于400g/l的牛樟芝菌发酵液。

实施例3

a.制备活化种液。按照前述液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖20g/l，蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，豆饼粉10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，七水合硫酸镁1.0g/l，并调整ph7.5，在121℃灭菌30分钟。将保藏号为cicc23812的牛樟芝菌生产种子以10％接种量接种到上述体种子培养基中，在温度32℃，湿度60％的恒温摇床上以转速100rpm培养5天，得到活化种液；

b.制备一级种液。按照权利要求所述的液体种子培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖20g/l，蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，豆饼粉10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，七水合硫酸镁1.0g/l，并调整ph7.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤a的牛樟芝菌活化种液接种到上述液体种子培养基的一级发酵罐内，在温度32℃，搅拌转速150rpm，通气量1:1条件下培养5天，得到一级种液。

c.牛樟芝菌发酵。按照权利要求所述的发酵培养基中各组分的配比准确称取各组分，葡萄糖20g/l，蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，豆饼粉10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，七水合硫酸镁1.0g/l，七水合硫酸亚铁0.4g/l,并调整ph7.5，在121℃灭菌30分钟。将步骤b的牛樟芝菌活化一级种液以10％接种量接种到上述液体发酵培养基的发酵罐内，在温度32℃，搅拌转速180rpm，通气量1:1条件下培养12天，发酵过程中采用流加含有葡萄糖200g/l和蛋白胨100g/l的补料培养基的方式来提高菌丝密度，即可获得菌密度不低于400g/l的牛樟芝菌发酵液。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明较优的实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应归属本发明的专利涵盖范围之内。