用于判断HIV-1感染者抗病毒治疗效果的lncRNA标志物及其应用

本发明属于有关艾滋病抗病毒治疗的生物医学技术领域，本发明涉及一种用于判断hiv-1感染者抗病毒治疗效果的lncrna标志物及其应用。

背景技术：

自1981年美国报道全球首例艾滋病患者后，艾滋病开始在全球迅速蔓延。截止2019年底，全球现存活hiv/aids感染者3800万，其中2540万人接受了抗病毒治疗。而接受抗病毒治疗的病人中出现了抗病毒治疗失败的情况，其首先表现为病毒载量的升高，接着出现cd4⁺t淋巴计数下降，最后出现机会性感染或肿瘤或发生耐药或原有感染的复发，导致临床治疗失败。因而，在抗病毒治疗早期定期进行病毒载量检测和cd4⁺t淋巴计数有助于判断疾病进程，指导临床用药，评估治疗效果和预后等。

2008年后多数艾滋病治疗指南抗病毒治疗病毒抑制阈值的标准为持续病毒载量低于50拷贝/ml，指南建议每6个月检测一次。现阶段，我国对接受抗病毒治疗的病人实行每人每年免费检测一次病毒载量的策略，其余情况需病人自费。据了解，不同地区病毒载量检测的费用从几百元至上千元不等，经济问题成为了导致抗病毒治疗失败和耐药问题发生的原因之一。再者，由于hiv病毒载量检测仪的价格较为昂贵，并非每所医院都配备有该仪器设备，这将进一步降低患者检测病毒载量的几率，不利于及时评估抗病毒治疗的疗效及治疗方案的调整。

长链非编码rna(longnoncodingrna,lncrna)是一类转录本长度超过200nt的非编码rna分子，多由rna聚合酶ⅱ转录，它本身不编码或是只编码很短的多肽链。近年来研究发现，lncrnas可以特异性地通过多种途径或机制参与艾滋病的发生和发展。已有报道表明lncrnanrav在甲型流感病毒感染中负向调节多个干扰素刺激基因的转录显著促进流感病毒的复制；lncrnanrav在呼吸合胞病毒感染时也促进了病毒的复制。

鉴于目前尚无可治愈艾滋病的药物，早期诊断及治疗成为艾滋病防控领域的主要手段，伴随抗病毒治疗广泛开展，抗病毒治疗失败甚至耐药问题的日益加剧，定期及时进行病毒载量检测成为临床用药的关键参考依据。为了更简便地评价lncrnanra标志物在hiv-1感染者抗病毒治疗效果，本发明通过检测艾滋病患者中lncrnanrav的异常表达情况，发现其与艾滋病临床指标存在相关性，进一步建立了抗病毒治疗效果评价模型，用于艾滋病治疗的效果评估及预后预测，有助于尽早实现艾滋病的“90-90-90”目标。

技术实现要素：

本发明的目的主要在于提供一种诊断和判别hiv-1感染者抗病毒治疗效果的lncrna标志物。

具体地，本发明提供一种用于判断hiv-1感染者抗病毒治疗效果的lncrna标志物，所述lncrna标志物为lncrnanrav。

一种用于判断hiv-1感染者抗病毒治疗效果的lncrna标志物的特异性引物，所述特异性引物包括序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列。

一种用于判断hiv-1感染者抗病毒治疗效果的lncrna标志物的特异性引物，所述特异性引物包括序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4的碱基序列。

一种用于判断hiv-1感染者抗病毒治疗效果的lncrna标志物的特异性引物，所述特异性引物包括引物对一和引物对二；其中，引物对一和引物对二均由上游特异序列和下游特异序列组成；所述引物对一的上游特异序列和下游特异序列分别具有序列表seq.id.no.1和seq.id.no.2的碱基序列；所述引物对二的上游特异序列和下游序列分别具有序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4的碱基序列。

一种检测hiv-1感染者抗病毒治疗效果的的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求2-4任一项所述的用于判断hiv-1感染者抗病毒治疗效果的lncrna标志物的特异性引物。

优选地，所述的检测lncrnanrav表达量的试剂为实时荧光定量pcr检测试剂。

所述的实时荧光定量pcr检测试剂包括根据lncrnanrav的核苷酸序列设计并合成出特异性用于实时荧光定量pcr的检测引物。

所述的lncrnanrav的检测方法包括样本rna的提取、cdna的制备和lncrnanrav的扩增。

上述lncrnanrav在未治疗的hiv-1感染者中表达下调，而在其对照组健康人中表达上调。

上述lncrnanrav在抗病毒治疗失败的病人中下调，而在接受抗病毒治疗有效的病人中上调。

本发明具有以下有益的的技术效果：

(1)相较于健康人群，lncrnanrav在未治疗的艾滋病感染患者中低表达；相较于接受抗病毒治疗有效的病人，在抗病毒治疗失败的病人中低表达。因此通过检测lncrnanrav的表达水平，经对数转换后带入评估抗病毒治疗效果的模型公式，可以评价疗效、指导临床用药。

(2)根据roc曲线结果显示，auc＝0.852，说明lncrnanrav作为判断hiv-1感染者抗病毒治疗效果的准确性达85.2％。本发明只涉及real-timepcr检测这一常用方法，易于掌握，操作快速。

(3)本发明的检测试剂盒可以检测接受抗病毒治疗的艾滋病患者的lncrnanrav表达水平。同时，本发明建立了评估抗病毒治疗效果的logistic回归拟合数据模型和计算公式，模型的评估效能采用roc曲线及曲线下面积auc分析，该模型对抗病毒治疗效果有较高的灵敏度和诊断效能，具有重要的临床意义。

(4)本发明通过检测lncrnanrav的表达水平来实现抗病毒治疗的效果评估，从而指导临床用药，有助于降低患者机会性感染和肿瘤发生的风险，提高患者生存率。该方法性比价高，易于推广应用。

附图说明

图1显示利用qpcr检测lncrnanrav在健康人群与未治疗的艾滋病感染者之间的表达情况；

图2显示利用qpcr检测lncrnanrav在具有不同抗病毒治疗效果的病人中的表达情况；

图3显示接受抗病毒治疗的艾滋病病人中lncrnanrav在评估治疗效果上的roc曲线。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对上述方案做进一步说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用到的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。

试验材料如下：

血细胞：从健康人、未治疗艾滋病患者、接受抗病毒治疗的艾滋病患者的外周血中分离出。

引物合成：生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

逆转录试剂：大连宝生物工程有限公司(primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime))，catno：rr047a

定量pcr试剂：大连宝生物工程有限公司(tbpremixextaq^tmⅱ(tlirnasehplus))，catno：rr820a

荧光定量pcr仪:购自美国应用生物系统公司(appliedbiosystemsinc.,abi)，catno：4376598。

实施例1

引物的设计与合成

(1)引物的设计：通过ncbi的gene库查找目的lncrna，进入rnasequence，通过pickprimers初步设计引物，再经blast和primerdesigningtool及引物设计的原则优选引物。

(2)由生工生物工程(上海)股份有限公司按照设计好的引物序列合成引物。

实施例2

检测lncrnanrav在健康人群和未治疗的艾滋病感染人群及抗病毒治疗成功或失败的艾滋病患者血细胞中的表达情况

1)研究对象

13例健康人，27例未治疗的艾滋病患者；25例抗病毒治疗有效的病人和13例抗病毒治疗失败的病人。接受抗病毒治疗后病毒抑制阈值为50拷贝/ml，即接受抗病毒治疗6个月后，病人的病毒载量低于50拷贝/ml的可判断为抗病毒治疗有效，病毒载量仍不低于50拷贝/ml的可判断为抗病毒治疗失败。

2)人血细胞rna提取

(1)经研究对象同意后，用含edta抗凝剂的真空采血管采集其外周血10ml，2500rpm/min，常温离心10min。离心后样本分两层，上层为血浆，下层为血细胞。

(2)分离出采血管中下层的血细胞，向管内加入5ml1x红细胞裂解液，吹打混匀后平均分配至2支15ml离心管，再向离心管中分别加入10ml红细胞裂解液，放置10min，期间不时颠倒混匀。

(3)2500rpm/min离心5min，弃去上层液体，留下管底细胞。每管加入5ml1x红细胞裂解液，放置10min，期间不时颠倒混匀。

(4)2500rpm/min离心5min，弃去上层液体，留下管底细胞。

(5)每管加入1mltrizol充分裂解细胞，按500μl/管分装至1.5mlep管中，室温放置10min。

(6)向1.5mlep管内加入0.1ml氯仿，涡旋震荡，室温静置10min。4℃，14000g离心15min。

(7)离心后样本分三层：上层水相，为无色；中间层为白色；下层有机相，为粉色。吸取上层水相转移至新的1.5mlep管，避免任何有机层和中间层混入。

(8)向ep管内加入250μl异丙醇，室温孵育10min。4℃，14000g离心10min。

(9)去除上清，留沉淀。向ep管内加入500μl75％乙醇清洗rna。短暂涡旋样本后，4℃，14000g离心5min，去乙醇。

(10)空气中干燥rna5-10min。20μlrnarnase-free水重悬rna，吹打混匀。

(11)55-60℃孵育10-15min。

(12)使用nanodrop2000超微量核酸蛋白分析仪测定总rna的纯度和浓度。a260/280>1.8可用。-80℃保存。

3)逆转录反应得cdna

按照逆转录试剂盒说明书对提取出的rna进行逆转录，合成cdna模板

4)荧光定量pcr检测

(1)按以下比例配制单孔pcr反应液(冰上操作，每样品设立重复孔)。

(2)反应条件

95℃1min酶活化，95℃5sec变性，62℃30sec退火及延伸，重复40个循环。溶解曲线：95℃15sec，然后以0.3℃/sec的速度从60℃1min升到95℃15sec。

(3)引物序列

nrav的引物为：

引物对一：forward5’-ggagttgatgcctccgaaca-3’

reverse5’-atgaccggagctgaaaggtg-3’

引物对二：forward5’-tcactactgccccaggatca-3’

reverse5’-ctgcaaggtcacctcacact-3’

gapdh引物为：

forward5’-ggtggtctcctctgacttcaaca-3’

reverse5’-gttgctgtagccaaattcgttgt-3’

(4)通过溶解曲线和电泳确定目的条带。

(5)最终采用2^-δcт方法，计算并比较分析lncrna在不同人群中的相对表达量。对于正态分布的数据采用t检验，非正态分布的数据用mann-whitney非参数检验比较两组样本间lncrnanrav的浓度差异，p<0.05被认为具有统计学差异。

(6)对数化lncrnanrav表达水平，提取患者的病毒载量数据，经logistic回归分析建立抗病毒效果评估模型和计算公式，模型的评估效能采用roc曲线及曲线下面积auc分析。

5)结果

荧光定量pcr的结果表明，lncrnanrav在未治疗的艾滋病患者中的相对表达量约为健康人群的0.58倍，该lncrna在患者中的表达水平下调(图1)，且差异具有统计学意义(p＝0.0004)。

lncrnanrav在具有不同抗病毒治疗效果的病人中的表达检测结果显示，与抗病毒治疗有效的患者相比，抗病毒治疗失败的艾滋病患者血细胞中lncrnanrav显著下调(p＝0.0002)(图2)。

将上述接受抗病毒治疗患者的lncrnanrav表达结果对数化后带入logistic回归分析，建立抗病毒治疗效果评估模型。计算公式为：logit(p)＝0.039*ln(z)-26.923，所述z为lncrnanrav相对表达量数值。经roc曲线分析，此模型的评估效能auc为0.852，cutoff值为-7.8244，如图3所示。

由此可见，利用此模型可替代病毒载量检测，对接受抗病毒治疗的艾滋病患者评价其治疗效果，对临床用药的调整具有指导意义。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>广西医科大学

<120>用于判断hiv-1感染者抗病毒治疗效果的lncrna标志物及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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