一种指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒及检测方法

技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
：：每年全球有大量的手术和操作检查需要麻醉，麻醉药物被广泛的应用于临床。其中，七氟烷是临床麻醉首选的一种新型吸入麻醉药，具有代谢快的优点，同时兼具镇静、镇痛、肌松作用，因此被广泛应用于临床麻醉诱导和维持。在临床麻醉实践中，对七氟烷的递送浓度有着极高的要求。七氟烷输注过多，会增加心血管系统、神经系统意外，如低血压、心动过缓，术后注意力、记忆力、认知功能下降等，甚至可能导致严重心血管不良事件危机生命；七氟烷输注浓度过低，麻醉水平维持不够，则可能会出现术中高血压和术中知晓等严重医疗事故，使患者在手术过程中异常痛苦，对患者造成重大心理创伤。此外，吸入麻醉药可能会诱导恶性高热、苏醒期躁动等不良反应，增加围术期风险。临床观察发现，即使是同一族群不同个体对七氟烷的所诱导的镇静、制动都存在着明显的个体差异。因此，在患者进行手术麻醉前，提前了解其对七氟烷的敏感性和不良事件发生风险，从而提供恰当的麻醉方案和精准的七氟烷递送浓度显得尤为重要。七氟烷的临床使用过程中每个个体之间的用量差异很大，而造成个体之间差异的最重要的遗传物质基础之一就是单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)，snp主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，snps在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。作为第三代遗传标志，snp与人体许多表型差异、药物易感性与疾病易感性密切相关。snp在基因组中的大量存在，使其成为一个强有力的工具，在疾病定位与克隆、药物的设计和测试以及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。个体化诊疗和精准医学是未来医学发展的大方向。将个体化的靶点定位于某个基因，甚至是单个核苷酸，发现疾病的遗传标志物，将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展疾病预防、诊断和治疗。基因的snp是形成个体间差异的重要遗传学基础，通过snp与疾病和药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可以通过所检测出的snp预测、确定与疾病有关的基因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据这一特点选择治疗效果最好，不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。本项目团队通过临床队列研究发现：基因多态性在七氟烷的敏感性和不良反应发生风险中有着重要作用，七氟烷的敏感性与kcnk2rs6686529、mtrrrs3733784、mtrrrs2307116、mtrrrs1801394基因snp存在密切关系；七氟烷的不良反应发生风险与cyp2e1rs3813867、cyp2e1rs2031920、gabrg1rs279858、mtrrrs2307116、mtrrrs1801394、kcnk3rs1275988、grin2brs1806201基因snp存在密切关系。因此，通过检测患者与七氟烷敏感性和不良反应发生风险相关的基因来指导临床患者麻醉用药，对临床患者的七氟烷使用量进行精准调控，能使患者在整个用药期间更加安全，具有重要的意义。在个体化诊断与治疗快速发展的背景下，kcnk2rs6686529、mtrrrs3733784、mtrrrs2307116、mtrrrs1801394、cyp2e1rs3813867、cyp2e1rs2031920、gabrg1rs279858、mtrrrs2307116、mtrrrs1801394、kcnk3rs1275988、grin2brs1806201与七氟烷敏感性和不良反应发生风险的紧密联系使其成为极具医学潜力的snp位点，因此急需找到一种简便易行的基因分型方法来满足精准医学的发展。目前市面上针对基因多态检测的主流为高通量测序(ngs)，但其测序费用较高，耗时较长，因此临床应用上有一定的局限性；也可采用实时荧光定量pcr进行多孔反应检测，虽然满足时效问题，但其通量较低，当需检测超过10个以上的位点时，其实际应用性不强。常见的检测技术，如测序、荧光定量pcr等，均需对位点逐一进行检测，当位点较多时操作复杂，费用较高；而现有的基于多重pcr的核酸质谱检测同类产品单一，基因位点的选择和组合方式，与传统的测序、实时荧光定量pcr等方法的检测产品相比偏少，缺乏能一次性同时、全面检测多个指导七氟烷用药的基因多态性的方法和产品。技术实现要素：：(一)解决的技术问题本发明旨在提供一种指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒及检测方法，能准确、快速、简便地检测与七氟烷的敏感性相关的基因位点，根据snp位点碱基结果，确定患者对七氟烷的敏感性，解决现有技术无法一次性同时、全面检测多个指导七氟烷用药的基因多态性，无法快速确定患者对七氟烷敏感性的问题。(二)技术方案为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒，包括用于检测9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点的扩增引物和延伸引物，所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点为：kcnk2rs6686529、kcnk3rs1275988、mtrrrs3733784、mtrrrs2307116、mtrrrs1801394、cyp2e1rs3813867、cyp2e1rs2031920、gabrg1rs279858、grin2brs1806201，所述扩增引物是指针对所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点，能特异性扩增出包括所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点的脱氧核糖核酸(dna)片段的引物对，所述延伸引物是指对包括所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点的dna片段进行延伸反应的引物。在上述技术方案中，用于检测所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点的所述扩增引物和所述延伸引物分别为：kcnk2基因rs6686529位点，其扩增引物为cgtaaattgctaccctttccttta(正向)，ttgaggaaatgggtgtagctttc(反向)，延伸引物为tttttttttttttttttttttttttttttactgatttcttttacttttttgtgt；kcnk3基因rs1275988位点，其扩增引物为cattctgctcactcagccca(正向)，ccagagatagcacctgccac(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttttttttttttttcctgtgggatcatctgcta；mtrr基因rs3733784位点，其扩增引物为ctctgctgctaaccccaact(正向)，agggtccaaaactccttccta(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttttttttttgtttaaaacaacaaaactcctta；mtrr基因rs2307116位点，其扩增引物为accacaaccaaacaatggtgag(正向)，accagaggggaaggacagtt(反向)，延伸引物为tttttttttttttttttttttttttgaacccattctgtggtttag；mtrr基因rs1801394位点，其扩增引物为tgagggagaattaatatctttaggttg(正向)，caaccaaaattcttcaaagcaca(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttggccatcgcagaagaaat；cyp2e1基因rs3813867位点，其扩增引物为gccaaaaaccagagggaagc(正向)，aaaagtcatttacaatccagccaaa(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttccttcttggttcaggagag；cyp2e1基因rs2031920位点，其扩增引物为acaagtgatttggctggattgt(正向)，agagctccacattgactagctt(反向)，延伸引物为tttttttataaagattcattgttaatataaaagta；gabrg1基因rs279858位点，其扩增引物为tacagcagagtcccatcatcc(正向)，accgtgtcttgtgtctacaacat(反向)，延伸引物为tttttttttattgtcatattatgagctactgattt；grin2b基因rs1806201位点，其扩增引物为cacaccagacaggttagccat(正向)，acctcagctcaccacatgac(反向)，延伸引物为tttttttttttgtgtgttgttcatggttgc。具体的，用于扩增样本中含有所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点的dna的扩增引物的pcr扩增反应液，用于纯化虾碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase,sap)的纯化反应液，用于得到所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点的碱基检测结果的延伸引物的延伸反应液。本发明还提供了一种指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒的检测方法，使用所述指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒，通过对所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点进行判断，确定患者对七氟烷的敏感性。在上述技术方案中，对所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点进行判断包括以下步骤：步骤1)，提取待检测样本的基因组dna；步骤2)，以步骤1)得到的所述基因组dna为模板，利用所述扩增引物和所述pcr扩增反应液进行pcr扩增反应扩增出含有snp位点的一段dna；步骤3)，使用sap酶去掉步骤2)所得pcr体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物，得到样本dna片段；步骤4)，向步骤3)所得反应液中加入所述延伸引物，并采用单碱基延伸终止反应液对样本dna进行延伸终止反应，将反应产物经树脂纯化后，得到用于snp分析的目的基因；步骤5)，经过基因型频率和等位基因频率计算，并检验哈迪-温伯格平衡定律(hardy-weinbergequilibriumlaw)和最小的等位基因频率(minorallelefrequency，maf)，通过pearson卡方检验，分析步骤4)所得目的基因在位点上基因型和等位基因的差异，确定snp位点的碱基，根据snp位点碱基结果，确定患者对七氟烷敏感性。具体的，步骤2)中进行pcr扩增反应的反应条件是：98℃预变性2min；98℃变性10s、60℃退火10s、72℃延伸10s，共进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存；进行延伸的反应条件是：96℃2min，96℃10s，50℃5s，60℃30s，循环25次，4℃保存。具体的，步骤5)中根据snp位点碱基结果，确定患者对七氟烷的敏感性时：当得到所述kcnk2基因rs6686529位点的碱基结果表现为gc和cc基因型时，则提示患者对七氟烷高敏感；当得到所述mtrr基因rs3733784位点的碱基结果表现为ct或cc基因型时，或当得到所述mtrr基因rs2307116位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，或当得到所述mtrr基因rs1801394位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，则提示患者对七氟烷低敏感；确定患者对七氟烷的不良反应发生风险时：当得到所述cyp2e1基因rs3813867位点的碱基结果表现为gc或cc基因型时，或当得到所述cyp2e1基因rs2031920位点的碱基结果表现为ct或tt基因型时，或当得到所述gabrg1基因rs279858位点的碱基结果表现为ct或tt基因型时，或当得到所述mtrr基因rs2307116位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，或当得到所述mtrr基因rs1801394位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，则提示患者对七氟烷存在术中血压降低发生风险；当得到所述kcnk3基因rs1275988位点的碱基结果表现为ct或tt基因型时，或当得到所述grin2b基因rs1806201位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，则提示患者对七氟烷存在术中血压升高发生风险。(三)有益效果相对于现有技术，本发明产生的有益效果是：(1)本发明提供的扩增引物及延伸引物可以准确的扩增和延伸与七氟烷的敏感性相关的基因位点，灵敏度高，特异性好；(2)本发明提供的指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒，能准确、快速、简便地检测与七氟烷的敏感性相关的多个基因位点；(3)本发明提供的指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒的检测方法，应用药物基因组学技术，根据snp位点碱基结果，能够一次性同时、全面检测多个指导七氟烷用药的基因多态性，快速确定患者对七氟烷的敏感性，从而能指导预测手术中七氟烷的用量，提供精准的七氟烷麻醉用药方案。附图说明：为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。图1是本发明实施例中随机提取的48个dna上样的琼脂糖凝胶电泳图；图2是本发明实施例扩增引物和延伸引物单独扩增后分a-e五组进行混样纯化的琼脂糖凝胶电泳图；图3.1-3.9是本发明实施例所述9个指导七氟烷用药的基因多态性snp位点检测峰图，其中：图3.1是kcnk2基因rs6686529位点的检测峰图(图中数字为基因序列号)；图3.2是kcnk3基因rs1275988位点的检测峰图；图3.3是mtrr基因rs3733784位点的检测峰图；图3.4是mtrr基因rs2307116位点的检测峰图；图3.5是mtrr基因rs1801394位点的检测峰图；图3.6是cyp2e1基因rs3813867位点的检测峰图；图3.7是cyp2e1基因rs2031920位点的检测峰图；图3.8是gabrg1基因rs279858位点的检测峰图；图3.9是grin2b基因rs1806201位点的检测峰图；具体实施方式：下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。本发明提出的指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒，包括9对snp位点基因型的扩增引物与9条延伸引物，针对检测的基因为与七氟烷的敏感性相关的基因：kcnk2、kcnk3、mtrr、cyp2e1、gabrg1、grin2b基因。所述扩增引物是指针对kcnk2rs6686529、mtrrrs3733784、mtrrrs2307116、mtrrrs1801394、cyp2e1rs3813867、cyp2e1rs2031920、gabrg1rs279858、kcnk3rs1275988、grin2brs1806201，这9个snp位点，能特异性扩增出包括所述9个snp位点的dna片段的引物对；所述延伸引物是指对包括kcnk2rs6686529、mtrrrs3733784、mtrrrs2307116、mtrrrs1801394、cyp2e1rs3813867、cyp2e1rs2031920、gabrg1rs279858、kcnk3rs1275988、grin2brs1806201，这9个snp位点的dna片段进行延伸反应的引物。聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)用于扩增位于两段已知序列之间的dna区域。每个pcr循环，反应混合体系都在模板变性、引物退火和引物延伸三种不同温度下依序温育。该过程可使用一种可编程序的温度热循环仪而达到自动化。引物是pcr技术中的重要组成部分，它是一小段单链dna，作为dna复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。本发明针对每个与七氟烷敏感性和不良反应发生风险相关的基因位点分别设计了一条正向扩增引物、一条反向扩增引物和一条延伸引物。正向引物最后一个核苷酸分别与七氟烷敏感性和不良反应发生风险相关的基因位点所检测的碱基互补配对，在pcr扩增时联合反向引物对待测dna模板进行特异性扩增。延伸引物对包括每个与七氟烷敏感性和不良反应发生风险相关的基因位点的dna片段进行延伸反应。用于检测9个snp位点基因型的所述扩增引物和所述延伸引物分别为：kcnk2基因rs6686529位点，其扩增引物为cgtaaattgctaccctttccttta(正向)，ttgaggaaatgggtgtagctttc(反向)，延伸引物为tttttttttttttttttttttttttttttactgatttcttttacttttttgtgt；kcnk3基因rs1275988位点，其扩增引物为cattctgctcactcagccca(正向)，ccagagatagcacctgccac(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttttttttttttttcctgtgggatcatctgcta；mtrr基因rs3733784位点，其扩增引物为ctctgctgctaaccccaact(正向)，agggtccaaaactccttccta(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttttttttttgtttaaaacaacaaaactcctta；mtrr基因rs2307116位点，其扩增引物为accacaaccaaacaatggtgag(正向)，accagaggggaaggacagtt(反向)，延伸引物为tttttttttttttttttttttttttgaacccattctgtggtttag；mtrr基因rs1801394位点，其扩增引物为tgagggagaattaatatctttaggttg(正向)，caaccaaaattcttcaaagcaca(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttggccatcgcagaagaaat；cyp2e1基因rs3813867位点，其扩增引物为gccaaaaaccagagggaagc(正向)，aaaagtcatttacaatccagccaaa(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttccttcttggttcaggagag；cyp2e1基因rs2031920位点，其扩增引物为acaagtgatttggctggattgt(正向)，agagctccacattgactagctt(反向)，延伸引物为tttttttataaagattcattgttaatataaaagta；gabrg1基因rs279858位点，其扩增引物为tacagcagagtcccatcatcc(正向)，accgtgtcttgtgtctacaacat(反向)，延伸引物为tttttttttattgtcatattatgagctactgattt；grin2b基因rs1806201位点，其扩增引物为cacaccagacaggttagccat(正向)，acctcagctcaccacatgac(反向)，延伸引物为tttttttttttgtgtgttgttcatggttgc。所述指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒还包括：扩增反应液：扩增反应液用于扩增样本中含有kcnk2rs6686529、mtrrrs3733784、mtrrrs2307116、mtrrrs1801394、cyp2e1rs3813867、cyp2e1rs2031920、gabrg1rs279858、kcnk3rs1275988、grin2brs1806201位点的dna，扩增反应液包括：10xpcrbufferwith15mmmgcl20.5ul、25mmmgcl20.4ul、25mmdntp混合液0.1ul、0.5umprimermix1ul、5u/μlhotstartaq酶、10ng/uldna1ul、hplc级超纯水1.8ul。纯化反应液：纯化反应液用于纯化扩增后的dna片段，包括三蒸水1.53ul，sapbuffer0.17ul，1.7u/ulsap酶0.3ul。延伸反应液：延伸反应液用于得到9个snp位点的碱基检测结果，包括：三蒸水0.619ul，iplexbufferplus0.2ul，iplexterminatormix0.2ul，iplexextendprimermix0.94ul，iplexenzyme0.041ul及所述扩增反应液和纯化反应液7ul。一种指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒的检测方法，使用所述指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒，通过对9个snp位点进行判断，确定患者对七氟烷的敏感性，用于指导麻醉给药方案。通过对所述9个snp位点进行判断包括以下步骤：步骤1)，提取待检测样本的基因组dna；步骤2)，以步骤1)得到的所述基因组dna为模板，利用所述扩增引物和所述pcr扩增反应液进行pcr扩增反应扩增出含有snp位点的一段dna；步骤3)，使用sap酶去掉步骤2)所得pcr体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸和引物，得到样本dna片段；步骤4)，向步骤3)所得反应液中加入所述延伸引物，并采用单碱基延伸终止反应液对样本dna进行延伸终止反应，将反应产物经树脂纯化后，得到用于snp分析的目的基因；步骤5)，经过基因型频率和等位基因频率计算，并检验哈迪-温伯格平衡定律(hardy-weinbergequilibriumlaw)和最小的等位基因频率(minorallelefrequency，maf)，通过pearson卡方检验，分析步骤4)所得目的基因在位点上基因型和等位基因的差异，确定snp位点的碱基，根据snp位点碱基结果，确定患者对七氟烷敏感性。确定患者对七氟烷的敏感性时：当得到kcnk2基因rs6686529位点的碱基结果表现为gc或cc基因型时，则提示患者对七氟烷高敏感；当得到mtrr基因rs3733784位点的碱基结果表现为ct或cc基因型时，或当得到mtrr基因rs2307116位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，或当得到mtrr基因rs1801394位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，则提示患者对七氟烷低敏感；确定患者对七氟烷的不良反应发生风险时：当得到cyp2e1基因rs3813867位点的碱基结果表现为gc或cc基因型时，或当得到cyp2e1基因rs2031920位点的碱基结果表现为ct或tt基因型时，或当得到gabrg1基因rs279858位点的碱基结果表现为ct或tt基因型时，或当得到mtrr基因rs2307116位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，或当得到mtrr基因rs1801394位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，则提示患者对七氟烷存在术中血压降低发生风险；当得到kcnk3基因rs1275988位点的碱基结果表现为ct或tt基因型时，或当得到grin2b基因rs1806201位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，则提示患者对七氟烷存在术中血压升高发生风险。本发明提出的指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒的检测方法，扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s、60℃退火10s、72℃延伸10s，共进行35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。延伸反应液进行单碱基延伸的反应条件是：96℃2min，96℃10s，50℃5s，60℃30s，循环25次；4℃保存。实施例使用一种指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒检测与七氟烷的敏感性相关基因多态性的检测方法，步骤如下：1.基因组dna的提取患者手术或麻醉操作前一天，抽取患者的动脉血，收集于edta抗凝管(紫头)中，使用tsingkedna提取试剂盒(通用型)，具体步骤如下：1.1取96孔板(1.2ml深孔板)编好孔号板号。1.2将血样室温融化，之后轻轻颠倒混合几次，之后取200ul血液至深孔板中。(序列取100-200ul血液)1.3每孔加20ul蛋白酶k，震荡混匀。1.4加入200ulbufferga1，盖硅胶垫密封后，旋涡振荡混匀，之后65℃孵育30min，期间振荡混匀2-3次，确保细胞完成裂解。1.5孵育结束后每孔先加300异丙醇(或者400ul无水乙醇)，加入10微升磁珠(用前混匀，加样比较久是要时不时混匀)，旋涡振荡混匀10秒。(异丙醇是0.6～0.7倍体积，无水乙醇是等体积)1.6水平震荡30min，让磁珠充分结合dna，提高dna的得率。1.7震荡后置磁力架上，充分吸附后(溶液澄清)颠倒一两次，再吸附2-4分钟，溶液澄清后，弃上清。1.8加入500微升bufferpw(用前检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀后静置，磁吸至溶液澄清，再次颠倒后静置，至溶液再次澄清，弃上清；重复一次。1.9加入500微升washbuffer(用前检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀后静置，磁吸(2-4分钟)至溶液澄清，再次颠倒后静置，至溶液再次澄清，弃上清。1.10500转倒置离心或者烘箱干燥3分(不能太干燥，否则难将dna洗脱下来)，加100微升tebuffer。振荡混匀后水平震荡5min，再磁吸至溶液再次澄清(吸附2-4分钟)，确保dna充分洗脱后、吸取上电泳鉴定。2.snp基因分型确定与七氟烷的敏感性和不良反应发生风险相关的snp位点，以snp位点为中心截取100bp以上长度的基因序列，根据snp的序列信息，采用assaydesigner3.1软件进行引物设计后，合成引物。合成后的引物与样品dna进行pcr反应，混合后的反应产物在sequenommassarray系统上进行snp基因分型。具体实验流程如下：2.1引物设计2.1.1引物设计原则。外围引物设计原则：引物长度在15—30bp，其有效长度一般不大于38，否则pcr的最适延伸温度会超过taq酶的最佳作用温度，从而降低产物的特异性。gc含量应在40％-60％之间，最适tm值在58-60℃。引物自身不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。延伸引物设计原则：引物长度在15-30bp，gc含量在40％-60％之间，最适tm值在58—60℃。为了能够分辨不同snp的不同基因型，可在引物的5’末端加上不同长度的polyc或polyt，使各条引物以长度区分。加尾后的引物最短设计为36bp，相邻两个snp位点引物的长度一般相差4-6个核苷酸。2.1.2引物设计合成。在ncbi(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找snp位点目的序列并设计外围扩增引物：针对每个位点各设计一对外围扩增引物，一共9对外围扩增引物，引物名称以rs登录号/基因名称/位点所在位置命名，外围扩增引物合成page引物。primerpremier5软件设计单碱基延伸引物，针对每个位点设计一条延伸引物，一共9条延伸引物，引物名称以rs登录号/基因名称/位点所在位置命名，单碱基延伸引物合成hplc引物。为多重反应自动设计pcr扩增引物及延伸引物，用于检测9个snp位点基因型的扩增引物和延伸引物分别为：kcnk2基因rs6686529位点，其扩增引物为cgtaaattgctaccctttccttta(正向)，ttgaggaaatgggtgtagctttc(反向)，延伸引物为tttttttttttttttttttttttttttttactgatttcttttacttttttgtgt；kcnk3基因rs1275988位点，其扩增引物为cattctgctcactcagccca(正向)，ccagagatagcacctgccac(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttttttttttttttcctgtgggatcatctgcta；mtrr基因rs3733784位点，其扩增引物为ctctgctgctaaccccaact(正向)，agggtccaaaactccttccta(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttttttttttgtttaaaacaacaaaactcctta；mtrr基因rs2307116位点，其扩增引物为accacaaccaaacaatggtgag(正向)，accagaggggaaggacagtt(反向)，延伸引物为tttttttttttttttttttttttttgaacccattctgtggtttag；mtrr基因rs1801394位点，其扩增引物为tgagggagaattaatatctttaggttg(正向)，caaccaaaattcttcaaagcaca(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttggccatcgcagaagaaat；cyp2e1基因rs3813867位点，其扩增引物为gccaaaaaccagagggaagc(正向)，aaaagtcatttacaatccagccaaa(反向)，延伸引物为ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttccttcttggttcaggagag；cyp2e1基因rs2031920位点，其扩增引物为acaagtgatttggctggattgt(正向)，agagctccacattgactagctt(反向)，延伸引物为tttttttataaagattcattgttaatataaaagta；gabrg1基因rs279858位点，其扩增引物为tacagcagagtcccatcatcc(正向)，accgtgtcttgtgtctacaacat(反向)，延伸引物为tttttttttattgtcatattatgagctactgattt；grin2b基因rs1806201位点，其扩增引物为cacaccagacaggttagccat(正向)，acctcagctcaccacatgac(反向)，延伸引物为tttttttttttgtgtgttgttcatggttgc。2.2引物稀释①稀释单管扩增特异性引物至终浓度100μm，加入去离子水充分振荡混匀使得各引物浓度为0.5μm。②稀释单管单碱基延伸引物至终浓度500μm，加入引物混合后使得各引物浓度为8μm、10μm、15μm。③按照dna合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。2.3pcr扩增反应①按照384板配置相关试剂。②已经标化至10～20ng/μl的样本，1000g离心3分钟备用。③将各pcr组份溶解后置于冰上备用。④扩增pcr反应组份见下表。sequenommassarray系统基因分型扩增pcr反应组分⑤将上述配好的试剂小心混匀后分在12孔的连排管中，每孔加入混匀试剂148ul。⑥12道移液器吸取混合试剂4μl加入到384孔板中，其中h11、h12、p11、p12孔留作对照，其孔中不加入引物，只含其他组份。⑦每板按照标记好的样本板加入相应的模板，加入体积为1μl。⑧移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止pcr程序时出现蒸发等现象。⑨扩增pcr反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s、60℃退火10s、72℃延伸10s，共进行35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。⑩配置1％琼脂糖凝胶，每排留有25个孔，其中一个作为标记孔，其他加入pcr反应后的产物。进行电泳，吸取2μl上样缓冲液，1μlpcr产物，电压110v，电流75ma，40分钟后观察结果，如结果良好可继续sap反应。2.4sap反应①按照384板配置相关试剂，sap反应相关试剂配制组分见下表。sap反应相关试剂配制组分②将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10μl/板。③使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2μl到384板的每个孔中。④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止pcr程序时出现蒸发等现象。⑤sap反应程序：温度(℃)时间周期3740min/855min/4∞/2.5延伸反应①按照384板配置相关试剂，延伸反应相关试剂配制组分见下表。延伸反应相关试剂组分②将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10μl/板。③使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2μl到384孔板的每个孔中。④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止pcr程序时出现蒸发等现象。⑤延伸反应程序：延伸反应液进行单碱基延伸的反应条件是：96℃2min，96℃10s，50℃5s，60℃30s，循环25次；4℃保存。2.6树脂纯化去盐：完成去盐，导入assay中，样本表格输入，建板，点样，massarray分析，质量控制及输出报告等实验工作。具体流程如下：①在384/6mgdimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。②使用liquidhandler机器臂在384样本板的每个孔中加16μl水。③将384样本板轻轻翻转过来扣在dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。④将384样本板放置离心机中室温旋转混匀60分钟。导入assay：①打开typer4.0。②选择assayeditor。③右键单击添加一个新的项目。④右键新建项目名称或现有项目的名称并选择进口检测组。⑤取消snpgroup选项，将自动取消设计文件和浏览阵列组(.xls文件)。⑥可以键入一个新的阵列组id或默认文件名。⑦单击导入，然后关闭。⑧关闭阵列编辑器。样本表格输入：①根据384加样顺序创建样本清单。②打开typer4.0，选择plateeditor。③单击sampletab，右键新建样本文件夹。④右键新建样本清单。⑤打开并浏览创建的样本清单，输入样本组名称，导入完成。建板：①打开typer4.0。②选择plateeditor。③右键单击添加新用户。④右键单击添加新项目。⑤右键单击添加板。⑥板型id和选择板式。⑦找到assaytab。⑧选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加assay。⑨找到sampletab，选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加sample。⑩保存板文件。点样：①离心：去盐后的产物4000转/分离心4分钟，使树脂沉淀。②核查体积。a)在主菜单中选择transfer。b)加载一个method。c)设定dispensespeed参数。d)选定volumecheck。e)选run并且观察体积。f)依据体积调整dispensespeed参数获得合适的体积。③在芯片上点样，方法同体积核查步骤。④在芯片上点calibrant，注意在method里选中calibrant。massarray分析：①在rt计算机上打开rt程序。②按下compact上的probescoutplateout按钮，然后把芯片放到scout板上并放回compact中，然后按probein按钮。③打开chiplinker并连接chip和plate。a)双击chiplinker。b)找到在plateeditor里建立的板。c)选择iplex模式。d)选择genotype或者genotype+area模式。e)选择dispenser类型。f)输入实验名称。g)输入芯片条形码。h)选择添加、创建。④把条形码名称输入acquire中，点击barcodereport，结果正确后点击autorunsetuptab。⑤chip扫描。质量控制：①打开typer4.0，点击typeanalyzer。②打开扫描结果。③检查质控点。④查看assay的得率和分型图。输出报告：①分型图。②分别导出原始的基因分型数据和结合分型图后的基因分型数据。③检查数据文件的完整性和正确性。④将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。3.结果判定经过基因型频率和等位基因频率计算，并检验哈迪-温伯格平衡定律(hardy-weinbergequilibrium)和最小的等位基因频率(minorallelefrequency,maf)，通过pearson卡方检验，分析步骤4)所得目的基因在位点上基因型和等位基因的差异，确定snp位点的碱基，根据snp位点碱基结果，确定患者对七氟烷的敏感性和不良反应发生风险。确定患者对七氟烷的敏感性时：当得到所述kcnk2基因rs6686529位点的碱基结果表现为gc或cc基因型时，则提示患者对七氟烷高敏感；当得到所述mtrr基因rs3733784位点的碱基结果表现为ct或cc基因型时，或当得到所述mtrr基因rs2307116位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，或当得到所述mtrr基因rs1801394位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，则提示患者对七氟烷低敏感；确定患者对七氟烷的不良反应发生风险时：当得到所述cyp2e1基因rs3813867位点的碱基结果表现为gc或cc基因型时，或当得到所述cyp2e1基因rs2031920位点的碱基结果表现为ct或tt基因型时，或当得到所述gabrg1基因rs279858位点的碱基结果表现为ct或tt基因型时，或当得到所述mtrr基因rs2307116位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，或当得到所述mtrr基因rs1801394位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，则提示患者对七氟烷存在术中血压降低发生风险；当得到所述kcnk3基因rs1275988位点的碱基结果表现为ct或tt基因型时，或当得到所述grin2b基因rs1806201位点的碱基结果表现为ga或aa基因型时，则提示患者对七氟烷存在术中血压升高发生风险。综上所述，本发明提供的指导吸入麻醉药七氟烷用药的基因多态性检测试剂盒及检测方法，能准确、快速、简便地检测与七氟烷的敏感性相关的基因位点，根据snp位点碱基结果，确定患者对七氟烷的敏感性，解决现有技术无法一次性同时、全面检测多个指导七氟烷用药的基因多态性，无法快速确定患者对七氟烷敏感性的问题。最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。当前第1页12