杀昆虫蛋白及其使用方法1.本技术是申请日为2015年10月14日的中国专利申请201580056320.1“杀昆虫蛋白及其使用方法”的分案申请。2.对以电子方式提交的序列表的引用3.通过efs‑web以电子方式将序列列表的正式文本作为ascii格式的序列列表提交，该文件名称为“6584wopct_sequence_listing”，创建日期为2015年9月14日，文件大小为255千字节，并且该文件与本说明书同时提交。该ascii格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术领域：
：4.本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新型基因。这些杀虫蛋白以及编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂并且可用于产生转基因抗虫害植物。
背景技术：
：：5.使用微生物剂如真菌、细菌或者另一种昆虫对具有农业意义的昆虫害虫进行生物防治，可提供具有环境友好性和商业吸引力的合成化学杀虫剂替代方案。一般而言，生物杀虫剂的使用造成的污染和环境危害的风险较低，并且生物杀虫剂能提供比传统广谱化学杀昆虫剂的特征性靶特异性更高的靶特异性。另外，生物杀虫剂的生产成本往往较低，因此能提高众多作物的经济产量。6.已知芽孢杆菌属(bacillus)微生物的某些物种对于一系列昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫害虫包括鳞翅目(lepidoptera)、双翅目(diptera)、鞘翅目(coleoptera)、半翅目(hemiptera)害虫以及其它昆虫害虫。苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)(bt)和日本金龟子芽孢杆菌(bacilluspopilliae)是至今为止发现的最成功的生物防治剂的代表。昆虫致病性也被认为是由幼虫芽孢杆菌(b.larvae)、缓病芽孢杆菌(b.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(b.sphaericus)和蜡样芽孢杆菌(b.cereus)的菌株引起的。微生物杀昆虫剂特别是那些从芽孢杆菌(bacillus)菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。7.最近，已通过对作物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白，开发出了昆虫抗性增强的作物。例如，已对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生从bt的菌株分离的杀虫蛋白。这些经遗传工程改造的作物目前在农业中广泛应用，给农场主提供了传统昆虫防治方法的环境友好的替代方案。虽然这些经遗传工程改造的抗昆虫作物已证明在商业上十分成功，但它们仅对较窄范围的经济上重要的昆虫害虫具有抗性。在一些情况中，昆虫可产生对不同杀昆虫化合物的抗性，使得有必要寻找替代的生物防治剂来进行害虫防治。8.因此，仍然需要针对昆虫害虫具有不同范围杀昆虫活性的新杀虫蛋白，例如对于鳞翅目和鞘翅目的多种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，所述多种昆虫包括但不限于已对现有杀昆虫剂产生抗性的昆虫害虫。技术实现要素：9.提供了将杀虫活性赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。组合物包含编码杀虫和杀昆虫多肽的序列的核酸分子、含有那些核酸分子的载体以及含有所述载体的宿主细胞。组合物还包含杀虫多肽序列以及那些多肽的抗体。核酸序列可用于dna构建体或表达盒中，该dna构建体或表达盒用于在生物体(包括微生物和植物)中转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以为设计用于在生物体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。10.具体地讲，提供了分离的或重组的核酸分子，所述核酸分子编码蕨类植物门(pteridophyta)和石松门(lycopodiophyta)杀昆虫蛋白‑96(ptip‑96)多肽，所述多肽包含氨基酸置换、缺失、插入、其片段。此外，涵盖与ptip‑96多肽对应的氨基酸序列。提供了分离的或重组的核酸分子，所述核酸分子能够编码seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的ptip‑96多肽、以及氨基酸置换、缺失、插入、其片段以及它们的组合。还涵盖了与所述实施方案的核酸序列互补或杂交至所述实施方案的序列的核酸序列。还提供了分离的或重组的seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的ptip‑96多肽以及氨基酸置换、缺失、插入、其片段以及它们的组合。11.提供了用于产生多肽以及使用那些多肽防治或杀灭鳞翅目、鞘翅目、线虫、真菌和/或双翅目害虫的方法。所述实施方案的转基因植物表达本文所公开的杀虫序列中的一者或多者。在各种实施方案中，所述转基因植物还包含具有昆虫抗性的一个或多个另外的基因，例如，用于防治鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫害虫的一个或多个另外的基因。本领域技术人员应当理解，所述转基因植物可包含赋予所关注的农学性状的任何基因。12.还包括用于检测样品中的所述实施方案的核酸和多肽的方法。提供了用于在样品中检测ptip‑96多肽的存在或检测编码ptip‑96多肽的多核苷酸的存在的试剂盒。所述试剂盒可连同执行检测预期因子的方法所需的所有试剂和对照样品以及使用说明一起提供。13.所述实施方案的组合物和方法可用于产生具有增强的害虫抗性或耐受性的生物体。这些生物体和包含所述生物体的组合物是农业用途所需的。实施方案的组合物也可用于产生具有杀虫活性的改变或改善的蛋白质，或可用于检测ptip‑96多肽的存在。附图说明14.图1a‑1k示出利用vector程序组的模块进行的如下ptip‑96多肽的氨基酸序列比对：ptip‑96aa(seqidno：9)；ptip‑96ab(seqidno：12)；ptip‑96ac(seqidno：14)；ptip‑96ad(seqidno：16)；ptip‑96ae(seqidno：18)；ptip‑96af(seqidno：20)；ptip‑96ag(seqidno：22)；ptip‑96ah(seqidno：24)；ptip‑96ca(seqidno：26)；ptip‑96ca(seqidno：28)；ptip‑96cc(seqidno：30)；ptip‑96cd(seqidno：32)；ptip‑96ce(seqidno：34)；ptip‑96cf(seqidno：36)；ptip‑96cg(seqidno：38)；ptip‑96ch(seqidno：40)；ptip‑96da(seqidno：42)；ptip‑96db(seqidno：44)；ptip‑96dc(seqidno：46)；ptip‑96dd(seqidno：52)；ptip‑96de(seqidno：48)；ptip‑96df(seqidno：50)；ptip‑96ea(seqidno：7)；ptip‑96eb(seqidno：8)；ptip‑96ec(seqidno：6)；ptip‑96ed(seqidno：54)；ptip‑96ee(seqidno：56)；ptip‑96ef(seqidno：58)；ptip‑96eg(seqidno：60)；ptip‑96eh(seqidno：62)；ptip‑96ei(seqidno：64)；ptip‑96ej(seqidno：66)；ptip‑96ek(seqidno：68)；ptip‑96el(seqidno：70)；ptip‑96em(seqidno：72)；ptip‑96en(seqidno：74)；ptip‑96eo(seqidno：76)；ptip‑96ep(seqidno：78)；ptip‑96eq(seqidno：80)；ptip‑96er(seqidno：82)；ptip‑96es(seqidno：84)；ptip‑96et(seqidno：86)；ptip‑96eu(seqidno：88)；ptip‑96ev(seqidno：90)；ptip‑96ha(seqidno：10)；ptip‑96hd(seqidno：96)；ptip‑96he(seqidno：98)；ptip‑96hf(seqidno：100)；ptip‑96hg(seqidno：102)；ptip‑96hh(seqidno：104)；ptip‑96hi(seqidno：106)；ptip‑96hj(seqidno：108)。ptip‑96多肽同源物之间的保守氨基酸位置被突出显示ptip‑96多肽同源物之间的非保守氨基酸差异被突出显示15.图2a‑2b示出利用vector程序组的模块进行的如下ptip‑96多肽的氨基酸序列比对：ptip‑96aa(seqidno：9)；ptip‑96ab(seqidno：12)；ptip‑96ac(seqidno：14)；ptip‑96ad(seqidno：16)；ptip‑96ae(seqidno：18)；ptip‑96af(seqidno：20)；ptip‑96ag(seqidno：22)；和ptip‑96ah(seqidno：24)。ptip‑96多肽同源物之间的氨基酸序列多样性被突出显示。16.图3a‑3b示出利用vector程序组的模块进行的如下ptip‑96多肽的氨基酸序列比对：ptip‑96ca(seqidno：26)；ptip‑96ca(seqidno：28)；ptip‑96cc(seqidno：30)；ptip‑96cd(seqidno：32)；ptip‑96ce(seqidno：34)；ptip‑96cf(seqidno：36)；ptip‑96cg(seqidno：38)；和ptip‑96ch(seqidno：40)。ptip‑96多肽同源物之间的氨基酸序列多样性被突出显示。17.图4a‑4d示出利用vector程序组的模块进行的如下ptip‑96多肽的氨基酸序列比对：ptip‑96ea(seqidno：7)；ptip‑96eb(seqidno：8)；ptip‑96ec(seqidno：6)；ptip‑96ed(seqidno：54)；ptip‑96ee(seqidno：56)；ptip‑96ef(seqidno：58)；ptip‑96eg(seqidno：60)；ptip‑96eh(seqidno：62)；ptip‑96ei(seqidno：64)；ptip‑96ej(seqidno：66)；ptip‑96ek(seqidno：68)；ptip‑96el(seqidno：70)；ptip‑96em(seqidno：72)；ptip‑96en(seqidno：74)；ptip‑96er(seqidno：82)；ptip‑96es(seqidno：84)；ptip‑96et(seqidno：86)；ptip‑96eu(seqidno：88)；和ptip‑96ev(seqidno：90)。ptip‑96多肽同源物之间的氨基酸序列多样性被突出显示。18.图5示出利用vector程序组的模块进行的如下ptip‑96多肽的氨基酸序列比对：ptip‑96eo(seqidno：76)；ptip‑96ep(seqidno：78)；和ptip‑96eq(seqidno：80)。ptip‑96多肽同源物之间的氨基酸序列多样性被突出显示。19.图6a‑6b示出利用vector程序组的模块进行的如下ptip‑96多肽的氨基酸序列比对：ptip‑96ha(seqidno：10)；ptip‑96hb(seqidno：92)；ptip‑96hc(seqidno：94)；ptip‑96hd(seqidno：96)；ptip‑96he(seqidno：98)；ptip‑96hf(seqidno：100)；ptip‑96hg(seqidno：102)；ptip‑96hh(seqidno：104)；ptip‑96hi(seqidno：106)；和ptip‑96hj(seqidno：108)。ptip‑96多肽同源物之间的氨基酸序列多样性被突出显示。20.图7a‑7b示出利用vector程序组的模块进行的如下ptip‑96多肽的氨基酸序列比对：ptip‑96da(seqidno：42)；ptip‑96db(seqidno：44)；ptip‑96dc(seqidno：46)；ptip‑96dd(seqidno：52)；ptip‑96de(seqidno：48)；和ptip‑96df(seqidno：50)。ptip‑96多肽同源物之间的氨基酸序列多样性被突出显示。具体实施方式21.应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、属和试剂，因为这些可有所变化。还应当理解，本文所用的术语是仅出于描述特定实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围。22.除非上下文另外明确规定，如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“该蛋白”包括提及一种或多种蛋白以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。除非另外明确指明，本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。23.本发明涉及用于防治害虫的组合物和方法。该方法涉及用编码ptip‑96多肽的核酸序列转化生物体。具体地讲，所述实施方案的核酸序列可用于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因此，本发明提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。所述组合物是细菌物种的杀虫核酸和蛋白。核酸序列可用于构建表达载体以供后续转化进所关注的生物体中，用作分离其它同源(或部分同源)基因的探针，以及用于通过本领域已知的方法诸如定点诱变、结构域交换或dna改组产生改变的ptip‑96多肽。ptlp‑96可用于防治或杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫害虫种群，以及用于产生具有杀虫活性的组合物。所关注的昆虫害虫包括但不限于鳞翅目物种，其包括但不限于：玉米穗虫(cew)(谷实夜蛾(helicoverpazea))、欧洲玉米螟(ecb)(玉米螟(ostrinianubialis))、小菜蛾，例如美洲棉铃虫(helicoverpazeaboddie)；大豆夜蛾，例如大豆尺夜蛾(pseudoplusiaincludenswalker)；以及黎豆毛虫，例如黎豆夜蛾(anticarsiagemmatalishübner)，以及鞘翅目物种，其包括但不限于西方玉米根虫(diabroticavirgifera)‑wcrw、南方玉米根虫(diabroticaundecimpunctatahowardi)‑scrw和北方玉米根虫(diabroticabarberi)‑ꢀncrw。24.本文中所用的所谓“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”指对于一种或多种害虫(包括但不限于鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目或线虫门的成员)具有毒杀活性的毒素，或与此类蛋白同源的蛋白。杀虫蛋白已从生物体分离，所述生物体包括例如芽孢杆菌属物种、假单胞菌属物种、发光杆菌属物种(photorhabdussp.)、致病杆菌属物种(xenorhabdussp.)、双酶梭菌(clostridiumbifermentans)以及日本甲虫类芽孢杆菌(paenibacilluspopilliae)。杀虫蛋白包括但不限于：来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白，例如pseen3174(monalysin；(2011)plospathogens7：1‑13)；来自生防假单胞菌(pseudomonasprotegens)菌株cha0和pf‑5(之前的荧光假单胞菌)的杀昆虫蛋白(pechy‑tarr，(2008)environmentalmicrobiology10：2368‑ꢀ2386(pechy‑tarr，2008年，《环境微生物学》，第10卷，第2368‑2386页)；genbank登录号eu400157)；来自台湾假单胞菌的杀昆虫蛋白(liu等人，(2010)j.agric.foodchem.，58：12343‑12349)以及来自类产碱假单胞菌(pseudomonaspseudoalcligenes)的杀昆虫蛋白(zhang等人，(2009)annalsofmicrobiology59：45‑50和li等人，(2007)plantcelltiss.organcult.89：159‑168)；来自发光杆菌属物种(photorhabdussp.)和致病杆菌属物种(xenorhabdussp.)的杀昆虫蛋白(hinchliffe等人，(2010)theopentoxicologyjournal，3：101‑118和morgan等人，(2001)appliedandenvir.micro.67：2062‑2069)；美国专利no.6,048,838和美国专利no.6,379,946；美国专利公布us20140007292的pip‑1多肽；美国专利公布us20140033361的afip‑1a和/或afip‑1b多肽；美国专利序列号13/839702的phi‑4多肽；pct序列号pct/us14/51063的pip‑47多肽、pct序列号pct/us14/55128的pip‑72多肽、以及δ‑内毒素，包括但不限于δ‑内毒素基因中的cry1、cry2，cry3，cry4，cry5，cry6，cry7，cry8，cry9，cry10，cry11，cry12，cry13，cry14，cry15，cry16，cry17，cry18，cry19，cry20，cry21，cry22，cry23，cry24，cry25，cry26，cry27，cry28，cry29，cry30，cry31，cry32，cry33，cry34，cry35，cry36，cry37，cry38，cry39，cry40，cry41，cry42，cry43，cry44，cry45，cry46，cry47，cry49，cry50，cry51，cry52，cry53，cry54，cry55，cry56，cry57，cry58，cry59，cry60，cry61，cry62，cry63，cry64，cry65，cry66，cry67，cry68，cry69，cry70，cry71，和cry72类型以及苏云金芽孢杆菌溶细胞cyt1和cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的这些类型的成员是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/(可使用“www”前缀在万维网上访问)的crickmore等人，“bacillusthuringiensistoxinnomenclature”ꢀ(2011))。25.δ‑内毒素的示例还包括但不限于美国专利no.5,880,275和7,858,849的cryla蛋白；美国专利no.8,304,604、8.304,605和8,476,226的dig‑3或dig‑11毒素(cry蛋白诸如cry1a、cry3a的α‑螺旋1和/或α‑螺旋2变体的n末端缺失)；美国专利申请序列号10/525,318的cry1b；美国专利no.6,033,874的cry1c；美国专利no.5，188,960和6,218,188的cry1f；美国专利no.7,070,982、6,962,705和6,713,063的cry1a/f嵌合体)；cry2蛋白，诸如美国专利no.7,064,249的cry2ab蛋白)；cry3a蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同cry蛋白的可变区和保守区块的独特组合而形成的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(ehip)(美国专利申请公布no.2010/0017914)；cry4蛋白；cry5蛋白；cry6蛋白；美国专利no.7,329,736，7,449,552，7,803,943，7,476,781，7,105,332，7,378,499和7,462,760的cry8蛋白；cry9蛋白，诸如cry9a、cry9b、cry9c、cry9d、cry9e和cry9f家族的成员；naimov等人，(2008)appliedandenvironmentalmicrobiology74：7145‑7151的cry15蛋白；美国专利no.6,127,180，6,624,145和6,340,593的cry22、cry34ab1蛋白；美国专利no.6,248,535，6,326,351，6,399,330，6,949,626，7,385,107和7,504,229的cryet33和cryet34蛋白；美国专利公布no.2006/0191034、2012/0278954和pct公布no.wo2012/139004的cryet33和cryet34同源物；美国专利no.6,083,499，6,548,291和6,340,593的cry35ab1蛋白；cry46蛋白、cry51蛋白、cry二元毒素；tic901或相关毒素；美国专利申请公布no.2008/0295207的tic807；pctus2006/033867的et29、et37、tic809、tic810、tic812、ticl27、tic128；美国专利no.8,236,757的axmi‑ꢀ027、axmi‑036和axmi‑038；美国专利no.7,923,602的axmi‑031、axmi‑039、axmi‑040、axmi‑049；wo2006/083891的axmi‑018、axmi‑020和axmi‑021；wo2005/038032的axmi‑010；wo2005/021585的axmi‑003；美国专利申请公布no.2004/0250311的axmi‑008；美国专利申请公布no.2004/0216186的axmi‑006；美国专利申请公布no.2004/0210965的axmi‑007；美国专利申请no.2004/0210964的axmi‑ꢀ009；美国专利申请公布no.2004/0197917的axmi‑014；美国专利申请公布no.2004/0197916的axmi‑004；wo2006/119457的axmi‑028和axmi‑029；wo2004/074462的axmi‑007、axmi‑008、axmi‑0080rf2、axmi‑009、axmi‑014和axmi‑004；美国专利no.8,084,416的axmi‑ꢀ150；美国专利申请公布no.2011/0023184的axmi‑205；美国专利申请公布no.2011/0263488的axmi‑011、axmi‑012、axmi‑013、axmi‑015、axmi‑019、axmi‑044、axmi‑037、axmi‑043、axmi‑033、axmi‑ꢀ034、axmi‑022、axmi‑023、axmi‑041、axmi‑063和axmi‑064；美国专利申请公布no.2010/0197592的axmi‑r1和相关蛋白；wo2011/103248的axmi221z、axmi222z、axmi223z、axmi224z和axmi225z；wo2011/103247的axmi218、axmi219、axmi220、axmi226、axmi227、axmi228、axmi229、axmi230和axmi231；美国专利no.8,334,431的axmi‑115、axmi‑113、axmi‑005、axmi‑163和axmi‑184；美国专利申请公布no.2010/0298211的axmi‑001、axmi‑002、axmi‑030、axmi‑ꢀ035和axmi‑045；美国专利申请公布no.2009/0144852的axmi‑066和axmi‑076；美国专利no.8,318,900的axmi128，axmi130，axmi131，axmi133，axmi140，axmi141，axmi142，axmi143，axmi144，axmi146，axmi148，axmi149，axmi152，axmi153，axmi154，axmi155，axmi156，axmi157，axmi158，axmi162，axmi165，axmi166，axmi167，axmi168，axmi169，axmi170，axmi171，axmi172，axmi173，axmi174，axmi175，axmi176，axmi177，axmi178，axmi179，axmi180，axmi181，axmi182，axmi185，axmi186，axmi187，axmi188，axmi189；和美国专利公布no.2010/0005543的axmi079，axmi080，axmi081，axmi082，axmi091，axmi092，axmi096，axmi097，axmi098，axmi099，axmi100，axmi101，axmi102，axmi103，axmi104，axmi107，axmi108，axmi109，axmi110，axmi111，axmi112，axmi114，axmi116，axmi117，axmi118，axmi119，axmi120，axmi121，axmi122，axmi123，axmi124，axmi1257，axmi1268，axmi127，axmi129，axmi164，axmi151，axmi161，axmi183，axmi132，axmi138，axmi137，美国专利no.8，319，019的cry蛋白诸如具有经修饰的蛋白水解位点的cry1a和cry3a；美国专利申请公布no.2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株vbts2528的cry1ac、cry2aa和cry1ca毒素蛋白。cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(有关综述，参见vanfrannkenhuyzen，(2009)j.invert.path.101：1‑16)。cry蛋白作为转基因植物性状的用途是本领域技术人员熟知的，并且cry转基因植物(包括但不限于表达cry1ac、cry1ac+cry2ab、cry1ab、cry1a.105、cry1f、cry1fa2、cry1f+cry1ac、cry2ab、cry3a、mcry3a、cry3bb1、cry34ab1、cry35ab1、vip3a、mcry3a、cry9c和cbi‑bt的植物)已取得监管批准(参见，sanahuja，(2011)plantbiotechjournal9：283‑300(sanahuja，2011年，《植物生物技术杂志》，第9卷，第283‑300页)和cera‑gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database(可使用ꢀ“www”前缀在万维网上访问)的cera.(2010)gmcropdatabasecenterforenvironmentalriskassessment(cera)，ilsiresearchfoundation，washingtond.c.(cera.(2010)转基因作物数据库，环境风险评估中心(cera)，国际生命科学学院研究基金，华盛顿))。本领域技术人员熟知的不止一种杀虫蛋白也可在植物中表达，比如vip3ab&cry1fa(us2012/0317682)；cry1be&cry1f(us2012/0311746)；cry1ca&cry1ab(us2012/0311745)；cry1f&cryca(us2012/0317681)；cry1da&cry1be(us2012/0331590)；cry1da&cry1fa(us2012/0331589)；cry1ab&cry1be(us2012/0324606)；cry1fa&cry2aa和cry1i&cry1e(us2012/0324605)；cry34ab/35ab和cry6aa(us20130167269)；cry34ab/vcry35ab&cry3aa(us20130167268)；以及cry3a和cry1ab或vip3aa(us20130116170)。杀虫蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，其包括美国专利no.7,491,869的脂酰基水解酶和比如来自链霉菌属(streptomyces)的胆固醇氧化酶(purcell等人，(1993)biochembiophysrescommun15：1406‑1413)。杀虫蛋白还包括美国专利no5,877,012，6,107,2796,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020的vip(植物性杀昆虫蛋白)毒素等等。其它vip蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/vip.html(可使用“www”前缀在万维网上访问))。杀虫蛋白还包括毒素复合物(tc)蛋白，可得自诸如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属(paenibacillus)的生物体(参见，美国专利no.7,491,698和8,084,418)。一些tc蛋白具有“独立”杀昆虫活性，而其它tc蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。“独立”tc蛋白(来自例如发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性可通过源自不同属的来源生物体的一种或多种tc蛋白“增效剂”来增强。有三种主要类型的tc蛋白。如本文所提及的，a类蛋白(“蛋白a”)是独立毒素。b类蛋白(“蛋白b”)和c类蛋白(“蛋白c”)增强a类蛋白的毒性。a类蛋白的示例是tcba、tcda、xpta1和xpta2。b类蛋白的示例是tcac、tcdb、xptb1xb和xptc1wi。c类蛋白的示例是tccc、xptc1xb和xptb1wi。杀虫蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的示例包括但不限于lycotoxin‑1肽及其突变体(美国专利no.8,334,366)。26.在一些方面，ptip‑96多肽包含从本文所公开的全长核酸序列推断出的氨基酸序列以及因使用替代的下游起始位点或因产生具有杀虫活性的较短蛋白的加工而短于全长序列的氨基酸序列。加工可在蛋白被表达的生物体中进行或在蛋白摄食后在害虫体内进行。27.因此，本文提供了赋予杀虫活性的新型的分离的或重组的核酸序列。还提供了ptip‑96多肽的氨基酸序列。由这些ptip‑96多肽基因翻译所得的蛋白允许细胞防治或杀灭对其摄食的害虫。28.核酸分子及其变体和片段29.一个方面涉及包含编码ptip‑96多肽或其生物活性部分的核酸序列的分离的或重组的核酸分子，以及足以用作鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白的核酸分子的杂交探针的核酸分子。如本文所用，术语“核酸分子”是指dna分子(例如，重组dna、cdna、基因组dna、质体dna、线粒体dna)和rna分子(例如，mrna)以及使用核苷酸类似物产生的dna或rna的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选的是双链dna。[0030]“分离的”核酸分子(或dna)在本文用来指不再处于其天然环境中，例如处于体外的核酸序列(或dna)。“重组的”核酸分子(或dna)在本文用来指处于重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或dna)。在一些实施方案中，“分离的”或“重组的”核酸不含在该核酸的来源生物体的基因组dna中天然位于该核酸旁侧的序列(即位于该核酸的5′和3′端的序列)(优选蛋白质编码序列)。出于本发明的目的，“分离的”或“重组的”在用来指核酸分子时排除分离的染色体。例如，在各种实施方案中，编码ptip‑96多肽的重组核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组dna中天然位于该核酸分子的旁侧的核酸序列。[0031]可以设想编码ptip‑96多肽的分离的核酸分子与天然或基因组核酸序列相比在核酸序列中具有一个或多个改变。天然或基因组核酸序列的改变包括但不限于：因遗传密码的简并性而导致的核酸序列的改变；与天然或基因组序列相比，因氨基酸置换、插入、缺失和/或添加而导致的核酸序列中的改变；一个或多个内含子的移除；一个或多个上游或下游调控区的缺失；以及与基因组核酸序列相关联的5’和/或3’非翻译区的缺失。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子是非基因组序列。[0032]设想了编码ptip‑96多肽或相关蛋白的多种多核苷酸。此类多核苷酸在可操作地连接至合适的启动子、转录终止和/或多聚腺苷酸化序列时可用于在宿主细胞中产生ptip‑96多肽。此类多核苷酸也可用作分离编码ptip‑96多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。[0033]编码ptip‑96多肽的多核苷酸[0034]编码ptip‑96多肽或相关蛋白的一种多核苷酸来源是蕨类或其它原生植物物种，该蕨类或其它原生植物物种包含seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：15、seqidno：11、seqidno：13、seqidno：15、seqidno：17、seqidno：19、seqidno：21、seqidno：23、seqidno：25；seqidno：27；seqidno：29、seqidno：31、seqidno：33、seqidno：35、seqidno：37、seqidno：39、seqidno：41、seqidno：43、seqidno：45、seqidno：47、seqidno：49、seqidno：51、seqidno：53、seqidno：55、seqidno：57、seqidno：59、seqidno：61、seqidno：63、seqidno：65、seqidno：67、seqidno：69、seqidno：71、seqidno：73、seqidno：75、seqidno：77、seqidno：79、seqidno：81、seqidno：83、seqidno：85、seqidno：87、seqidno：89、seqidno：91、seqidno：93、seqidno：95、seqidno：97、seqidno：99、seqidno：101、seqidno：103、seqidno：105、seqidno：107或seqidno：109的ptip‑96多核苷酸，其编码seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的ptip‑96多肽。seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：15、seqidno：11、seqidno：13、seqidno：15、seqidno：17、seqidno：19、seqidno：21、seqidno：23、seqidno：25；seqidno：27；seqidno：29、seqidno：31、seqidno：33、seqidno：35、seqidno：37、seqidno：39、seqidno：41、seqidno：43、seqidno：45、seqidno：47、seqidno：49、seqidno：51、seqidno：53、seqidno：55、seqidno：57、seqidno：59、seqidno：61、seqidno：63、seqidno：65、seqidno：67、seqidno：69、seqidno：71、seqidno：73、seqidno：75、seqidno：77、seqidno：79、seqidno：81、seqidno：83、seqidno：85、seqidno：87、seqidno：89、seqidno：91、seqidno：93、seqidno：95、seqidno：97、seqidno：99、seqidno：101、seqidno：103、seqidno：105、seqidno：107或seqidno：109的多核苷酸可用来在包括但不限于如下的细菌宿主中表达ptip‑96多肽：农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属(escherichia)、沙门氏菌属(salmonella)、假单胞菌属和根瘤菌属细菌宿主细胞。多核苷酸也可用作分离编码ptip‑96多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。此类探针可用来鉴定源于蕨类植物门(pteridophyta)和石松门(lycopodiophyta)物种的同源或基本上同源的多核苷酸。[0035]编码ptip‑96多肽的多核苷酸也可根据ptip‑96多肽序列从头合成。可通过使用遗传密码从ptip‑96多肽序列推断出多核苷酸基因的序列。计算机程序比如“backtranslate”(gcgtm软件包，加利福尼亚州圣地亚哥的阿赛乐德公司(acclerys，inc.sandiego，calif.))可用来将肽序列转换为编码该肽的相应核苷酸序列。可用来获得相应核苷酸编码序列的ptip‑96多肽序列的示例包括但不限于seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的ptip‑96多肽。此外，本公开的合成ptip‑96多核苷酸序列可被设计成使得它们将no：39、seqidno：41、seqidno：43、seqidno：45、seqidno：47、seqidno：49、seqidno：51、seqidno：53、seqidno：55、seqidno：57、seqidno：59、seqidno：61、seqidno：63、seqidno：65、seqidno：67、seqidno：69、seqidno：71、seqidno：73、seqidno：75、seqidno：77、seqidno：79、seqidno：81、seqidno：83、seqidno：85、seqidno：87、seqidno：89、seqidno：91、seqidno：93、seqidno：95、seqidno：97、seqidno：99、seqidno：101、seqidno：103、seqidno：105、seqidno：107或seqidno：109，其中ptip‑96多肽具有杀昆虫活性。[0039]在一些实施方案中，核酸分子编码这样的ptip‑96多肽，该ptip‑96多肽包含seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的氨基酸序列，其与seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的相应位置处的天然氨基酸相比具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，1011、12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70个或更多个氨基酸置换。[0040]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于蕨类植物门(divisionpteridophyta)的蕨类物种或石松植物门(divisionlycopodiophyta)的其它原生植物。如本文所用的蕨类的系统发育基于a.r.smith等人，taxon，55：705‑731(2006)对现存蕨类的分类。基于a.r.smith分类的共有系统发育示于图1。现存蕨类的其它系统发育分类为本领域技术人员所知。关于蕨类的系统发育的额外信息可见于mobot.org/mobot/research/apweb/(其可使用前缀“www”访问)和基于三种质体基因的schuettpelze.和pryerk.m.，taxon56：1037‑1050(2007)。另外的蕨类及其它原生植物物种可见于homepages.caverock.net.nz/～bj/fern/list.htm(其可使用前缀“www”ꢀ访问)。[0041]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于松叶蕨纲(classpsilotopsida)的蕨类物种。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于松叶蕨纲的松叶蕨目(orderpsilotales)的蕨类物种。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于松叶蕨纲的瓶尔小草目(orderophioglossales)的蕨类物种。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于松叶蕨纲的瓶尔小草目的松叶蕨科(familypsilotaceae)的蕨类物种。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于松叶蕨纲的瓶尔小草目的瓶尔小草科(familyophioglossaceae)的蕨类物种。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于瓶尔小草属(ophioglossuml.)、阴地蕨属(botrychium)、蕨萁属(botrypus)、七指蕨属(helminthostachys)、带状瓶尔小草属(ophioderma)、cheiroglossa、阳地蕨属(sceptridium)或仙指蕨属(mankyua)的蕨类物种。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于瓶尔小草属的蕨类物种，选自但不限于：ophioglossumcalifornicum、ophioglossumcoriaceum、ophioglossumcostatum、球茎瓶尔小草(ophioglossumcrotalophoroides)、ophioglossumengelmannii、ophioglossumfalcatum、ophioglossumgomezianum、ophioglossumgramineum、ophioglossumkawamurae、矮瓶尔小草(ophioglossumlusitanicum)、ophioglossumnamegatae、小叶瓶尔小草(ophioglossumnudicaule)、掌叶瓶尔小草(ophioglossumpalmatum)、ophioglossumparvum、尖头瓶尔小草(ophioglossumpedunculosum)、ophioglossumpendulum、钝头瓶尔小草(ophioglossumpetiolatum)、ophioglossumpusillum、心叶瓶尔小草(ophioglossumreticulatum)、ophioglossumrichardsiae、狭叶瓶尔小草(ophioglossumthermale)和一叶草(ophioglossumvulgatum)。[0042]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水龙骨目(orderpolypodiales)的水龙骨科(familypolypodiaceae)的凤梨属(campyloneurum)、槲蕨属(drynaria)、瓦韦属(lepisorus)、microgramma属、星蕨属(microsorum)、neurodium属、niphidium属、peclumam.g.属、水龙骨属(phlebodium)、瘤蕨属(phymatosorus)、鹿角蕨属(platycerium)、pleopeltis属、水龙骨属(polypodiuml)或线蕨属(colysis)的蕨类物种。[0043]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于线蕨属的蕨类物种，选自但不限于：colysisampla、掌叶线蕨(colysisdigitata)、异叶线蕨(colysisdiversifolia)、colysiselegans、椭圆线蕨(colysiselliptica)、曲边线蕨(colysisflexiloba)、断线蕨(colysishemionitidea)、胄叶线蕨(colysishemitoma)、矩圆线蕨(colysishenryi)、colysisinsignis、矛叶线蕨(colysisintermedia)、绿叶线蕨(colysisleveillei)、长柄线蕨(colysislongipes)、长梗线蕨(colysispedunculata)、滇线蕨(colysispentaphylla)、宽羽线蕨(colysispothifolia)、colysispteropus、新店线蕨(colysisshintenensis)、colysissimplicifrons、三裂线蕨(colysistraphylla)、褐叶线蕨(colysiswrightii)和新店线蕨(colysis×shintenensis)。[0044]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水龙骨目的凤尾蕨科(familypteridaceae)的铁线蕨属(genusadiantaceae)的蕨类物种，选自但不限于：adiantumaethiopicum、铁线蕨(adiantumaleuticum)、毛足铁线蕨(adiantumbonatianum)、adiantumcajennense、团羽铁线蕨(adiantumcapillus‑junonis)、无悔铁线蕨(adiantumcapillus‑veneris)、鞭叶铁线蕨(adiantumcaudatum)、北江铁线蕨(adiantumchienii)、adiantumchilense、楔叶铁线蕨(adiantumcuneatum)、adiantumcunninghamii、白背铁线蕨(adiantumdavidii)、长尾铁线蕨(adiantumdiaphanum)、月芽铁线蕨(adiantumedentulum)、普通铁线蕨(adiantumedgeworthii)、adiantumexcisum、冯氏铁线蕨(adiantumfengianum)、长盖铁线蕨(adiantumfimbriatum)、扇叶铁线蕨(adiantumflabellulatum)、深山铁线蕨(adiantumformosanum)、美丽铁线蕨(adiantumformosum)、铜骨铁线蕨(adiantumfulvum)、白垩铁线蕨(adiantumgravesii)、毛叶铁线蕨(adiantumhispidulum)、圆柄铁线蕨(adiantuminduratum)、加州铁线蕨(adiantumjordanii)、仙霞铁线蕨(adiantumjuxtapositum)、adiantumlatifolium、白垩铁线蕨(adiantumleveillei)、粤铁线蕨(adiantumlianxianense)、假鞭叶铁线蕨(adiantummalesianum)、小铁线蕨(adiantummariesii)、单盖铁线蕨(adiantummonochlamys)、灰背铁线蕨(adiantummyriosorum)、adiantumobliquum、adiantumogasawarense、掌叶铁线蕨(adiantumpedatum)、adiantumpentadactylon、银圆铁线蕨(adiantumperuvianum)、半月形铁线蕨(adiantumphilippense)、adiantumprinceps、毛叶铁线蕨(adiantumpubescens)、楔叶铁线蕨(adiantumraddianum)、楔叶铁线蕨(adiantumraddianum)、荷叶铁线蕨(adiantumreniforme)、陇南铁线蕨(adiantumroborowskii)、adiantumserratodentatum、苍山铁线蕨(adiantumsinicum)、翅柄铁线蕨(adiantumsoboliferum)、adiantumsubcordatum、脆铁线蕨(adiantumtenerum)、adiantumterminatum、adiantumtetraphyllum、细叶铁线蕨(adiantumvenustum)、adiantumviridescens和adiantumviridimontanum。[0045]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水龙骨目的鳞毛蕨科(familydryopteridaceae)的耳蕨属(genuspolystichum)的蕨类物种，选自但不限于：刺耳叶蕨(polystichumacanthophyllum)、圣诞耳蕨(polystichumacrostichoides)、欧洲耳蕨(polystichumaculeatum)、尖齿耳蕨(polystichumacutidens)、尖头耳蕨(polystichumacutipinnulum)、角状耳蕨(polystichumalcicorne)、polystichumaleuticum、polystichumandersonii、小芽孢耳蕨(polystichumatkinsonii)、polystichumaustraliense、薄叶耳蕨(polystichumbakerianum)、二尖耳蕨(polystichumbiaristatum)、波密耳蕨(polystichumbomiense)、polystichumbonseyi、喜马拉雅耳蕨(polystichumbrachypterum)、布朗耳蕨(polystichumbraunii)、喜马拉雅耳蕨(polystichumbrachypterum)、polystichumcalderonense、polystichumcalifornicum、基芽耳蕨(polystichumcapillipes)、栗鳞耳蕨(polystichumcastaneum)、polystichumchilense、拟角状耳蕨(polystichumchristii)、陈氏耳蕨(polystichumchunii)、鞭叶耳蕨(polystichumcraspedosorum)、圆片耳蕨(polystichumcyclolobum)、polystichumcystostegia、对生耳蕨(polystichumdeltodon)、圆顶耳蕨(polystichumdielsii)、分离耳蕨(polystichumdiscretum)、polystichumdrepanum、polystichumdudleyi、杜氏耳蕨(polystichumduthiei)、polystichumechinatum、蚀盖耳蕨(polystichumerosum)、尖顶耳蕨(polystichumexcellens)、灰绿耳蕨(polystichumeximium)、镰叶耳蕨(polystichumfalcatipinnum)、polystichumfalcinellum、polystichumfallax、台湾耳蕨(polystichumformosanum)、polystichumglandulosum、工布耳蕨(polystichum2ongboense)、大叶耳蕨(polystichumgrandifrons)、无盖耳蕨(polystichumgymnocarpium)、polystichumhaleakalense、小戟叶耳蕨(polystichumhancockii)、多翼耳蕨(polystichumhecatopteron)、草叶耳蕨(polystichumherbaceum)、polystichumimbricans、polystichumincongruum、polystichumkruckebergii/、polystichumkwakiutlii、拉钦耳蕨(polystichumlachenense)、亮叶耳蕨(polystichumlanceolatum)、雷蒙耳蕨(polystichumlemmonii)、柔软耳蕨(polystichumlentum)、矛状耳蕨(polystichumlonchitis)、长齿耳蕨(polystichumlongidens)、长鳞耳蕨(polystichumlongipaleatum)、长柄耳蕨(polystichumlongipes)、polystichumluctuosum、polystichummacleae、大盖耳蕨(polystichummacrochlaenum)、黑鳞耳蕨(polystichummakinoi)、马氏耳蕨(polystichummartini)、前原耳蕨(polystichummayebarae)、狭鳞耳蕨(polystichummediocre)、polystichummedogense、polystichummicrochlamys、polystichummohrioides、毛叶耳蕨(polystichummollissimum)、polystichummonticola、polystichummoorei、玉山耳蕨(polystichummorii)、宝兴耳蕨(potystichummoupinense)、黔中耳蕨(polystichummunitum)、polystichummuricatum、polystichumnakenense、革叶耳蕨(polystichumneolobatum)、尼泊尔耳蕨(polystichumnepalense)、宁陕耳蕨(polystichumningshenense)、知本耳蕨(polystichumobliquum)、峨眉耳蕨(polystichumomeiense)、polystichumordinatum、藏东耳蕨(polystichumorientalitibeticum)、短柄耳蕨(polystichumparamoupinense)、尖葉耳蕨(polystichumparvipinnulum)、乌鳞耳蕨(polystichumpiceopaleaceum)、棕鳞耳蕨(polystichumpolyblepharum)、芒刺耳蕨(polystichumprescottianum)、锯叶耳蕨(polystichumprionolepis)、polystichumproliferum、拟栗鳞耳蕨(polystichumpseudocastaneum)、假黑鳞耳蕨(polystichumpseudomakinoi)、中缅耳蕨(polystichumpunctiferum)、polystichumpungens、昌都耳蕨(polystichumqamdoense)、倒鳞耳蕨(polystichumretrosopaleaceum)、斜方耳蕨(polystichumrhombiforme)、polystichumrhomboidea、polystichumrichardii、阔鳞耳蕨(polystichumrigens)、圆片耳蕨(polystichumrotundilobum)、帚状耳蕨(polystichumscopulinum)、半育耳蕨(polystichumsemifertile)、刺毛耳蕨(polystichumsetiferum)、polystichumsetigerum、陕西耳蕨(polystichumshensiense)、polystichumsilvaticum、单羽耳蕨(polystichumsimplicipinnum)、中华耳蕨(polystichumsinense)、密鳞耳蕨(polystichumsquarrosum)、芽胞耳蕨(polystichumstenophyllum)、猫儿刺耳蕨(polystichumstimulans)、秦岭耳蕨(polystichumsubmite)、南亚耳蕨(polystichumtacticopterum)、尾叶耳蕨(polystichumthomsoni)、polystichumtibeticum、polystichumtransvaalense、三叉耳蕨(polystichumtripteron)、对马耳蕨(polystichumtsus‑simense)、polystichumvestitum、细裂耳蕨(polystichumwattii)、polystichumwhiteleggei、关山耳蕨(polystichumxiphophyllum)、亚东耳蕨(polystichumyadongense)和云南耳蕨(polystichumyunnanense)。[0046]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水龙骨目的鳞毛蕨科的贯众蕨属(genuscyrtomium)的蕨类物种，选自但不限于：等基贯众(cyrtomiumaequibasis)、镰羽贯众(cyrtomiumbalansae)、短楔贯众(cyrtomiumbrevicuneatum)、钙生贯众(cyrtomiumcalcicola)、刺齿贯众(cyrtomiumcaryotideum)、尾头贯众(cyrtomiumcaudatum)、密羽贯众(cyrtomiumconfertifolium)、福建贯众(cyrtomiumconforme)、革叶贯众(cyrtomiumcoriaceum)、等基贯众(cyrtomiumcuneatum)披针贯众、(cyrtomiumdevexiscapulae)、cyrtomiumdubium、全缘贯众(cyrtomiumfalcatum)、巫溪贯众(cyrtomiumfalcipinnum)、国楣贯众(cyrtomiumfengianum)、贯众(cyrtomiumfortunei)、槐叶贯众(cyrtomiumfraxinellum)、学煜贯众(cyrtomiumhoui)、无齿贯众(cyrtomiumintegrum)、cyrtomiumlaetevirens、宽镰贯众(cyrtomiumlatifalcatum)、小羽贯众(cyrtomiumlonchitoides)、长柄贯众(cyrtomiumlongipes)、大叶贯众(cyrtomiummacrophyllum)、大羽贯众(cyrtomiummaximum)、狭顶贯众(cyrtomiummediocre)、硕羽贯众(cyrtomiummegaphyllum)、cyrtomiummicropterum、cyrtomiummoupingense、维西贯众(cyrtomiumneocaryotideum)、低头贯众(cyrtomiumnephrolepioides)、显脉贯众(cyrtomiumnervosum)、斜基贯众(cyrtomiumobliquum)、峨眉贯众(cyrtomiumomeiense)、卵羽贯众(cyrtomiumovale)、假尾头贯众(cyrtomiumpseudocaudipinnum)、反曲贯众(cyrtomiumrecurvum)、鳞毛贯众(cyrtomiumretrosopaleaceum)、柳羽贯众(cyrtomiumsalicipinnum)、尖齿贯众(cyrtomiumserratum)、山东贯众(cyrtomiumshandongense)、同羽贯众(cyrtomiumsimile)、中华贯众(cyrtomiumsinicum)、新宁贯众(cyrtomiumsinningense)、硕美贯众(cyrtomiumspectabile)、台湾贯众(cyrtomiumtaiwanianum)、cyrtomiumtakusicola、世纬贯众(cyrtomiumtengii)斜方贯众(cyrtomiumtrapezoideum)秦岭贯众(cyrtomiumtsinglingense)单行贯众(cyrtomiumuniseriale)线羽贯众(cyrtomiumurophyllum)、cyrtomiumvittatum、黄志贯众(cyrtomiumwangianum)阴山贯众(cyrtomiumyiangshanense)德浚贯众(cyrtomiumyuanum)和云南贯众(cyrtomiumyunnanense)。[0047]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水龙骨目的水龙骨科的鹿角蕨属(genusplatycerium)的蕨类物种，选自但不限于：美洲鹿角蕨(platyceriumandinum)、圆盾鹿角蕨(platyceriumalcicorne)、二叉鹿角蕨(platyceriumbifurcatum)、鹿角蕨(platyceriumcoronarium)、象耳鹿角蕨(platyceriumelephantotis)、肾形鹿角蕨(platyceriumellisii)、壮丽鹿角蕨(platyceriumgrande)、深绿鹿角蕨(platyceriumhillii)、何其美鹿角蕨(platyceriumholttumii)、马达加斯加鹿角蕨(platyceriummadagascariense)、四叉鹿角蕨(platyceriumquadridichotomum)、马来鹿角蕨(platyceriumridleyi)、三角鹿角蕨(platyceriumstemaria)、platyceriumsuperbum、立叶鹿角蕨(platyceriumveitchii)、印度鹿角蕨(platyceriumwallichii)、女王鹿角蕨(platyceriumwandae)、女皇鹿角蕨(platyceriumwilhelminae‑regmae)和长叶鹿角蕨(platyceriumwillinkii)。[0048]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水龙骨目的水龙骨科的连珠蕨属(genusaglaomorpha)的蕨类物种，选自但不限于：aglaomorphaacuminata、aglaomorphabrooksii、aglaomorphacornucopia、崖姜蕨(aglaomorphacoronans)、surinamensis、cyatheatenera、cyatheatortuosa、cyatheatrichiata、cyatheatryonorum、cyatheaursina、cyatheavaldecrenata、cyatheavenezuelensis、cyatheavillosa、cyatheaweatherbyana、cyatheawendlandii、cyatheawerffii、cyatheawilliamsii。[0050]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水龙骨目的骨碎补科(familydavalliaceae)的骨碎补属(genusdavallia)的蕨类物种，选自但不限于：davalliaangustata、davalliaassamica、davalliabrassii、davalliabrevipes、加拿大骨碎补(davalliacanariensis)、davalliacorniculata、假脉骨碎补(davalliadenticulata)、davalliaembolostegia、davalliafalcinella、davalliagraeffei、杯状盖骨碎补(davalliagriffithiana)、davalliaheterophylla、davallialeptocarpa、davalliaparvula、马来阴石蕨(davalliapectinata)、davalliapentaphylla、阴石蕨(avalliarepens)、davalliarouffaeriensis、davalliaseramensis、davalliasessilifolia、davalliasessilifolioides、阔叶骨碎补(davalliasolida)、davalliaspeciosa、davalliatasmanii、海州骨碎补(davalliatrichomanoides)、davalliatriphylla、davalliaundulata、davalliawagneriana和davalliayunnanensis。[0051]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于沙草蕨目(orderschizaeales)的海金沙科(familylygodiaceae)的海金沙属(genuslygodium)的蕨类物种，选自但不限于：lygodiumaltum、lygodiumarticulatum、lygodiumboivinikuhn、lygodiumborneensealderw.、海南海金沙(lygodiumcircinnatum)、lygodiumcolaniae、海南海金沙(lygodiumconforme)、古巴海金沙(lygodiumcubense)、lygodiumdimorphum、曲轴海金沙(lygodiumflexuosum)、lygodiumgiganteum、lygodiumheterodoxum、lygodiumhians、海金沙藤(lygodiumjaponicum)、lygodiumkerstenii、lygodiumlanceolatum、掌叶海金沙(lygodiumlongifolium)、lygodiummerrillii、小叶海金沙(lygodiummicrophyllum)、lygodiumoligostachyum、掌羽海金沙(lygodiumpalmatum)、lygodiumpedicellatum、羽裂海金沙(lygodiumpolystachyum)、lygodiumradiatum、lygodiumreticulatum、柳叶海金沙(lygodiumsalicifolium)、lygodiumsmithianum、网脉海金沙(lygodiumsubareolatum)、lygodiumtrifurcatum、lygodiumvenustum、lygodiumversteegii、lygodiumvolubile、lygodium×fayae、lygodium×ꢀlancetillanum和云南海金沙(lygodiumyunnanense)。[0052]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水韭纲(classisoetopsida)或石松纲(classlycopodiopsida)的物种。[0053]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水韭纲的卷柏目(orderselaginales)的物种。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于水韭纲的卷柏目的卷柏科(familyselaginellaceae)的物种。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于卷柏属(genusselaginella)的石松物种。在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于卷柏属植物物种，选自但不限于：selaginellaacanthonota、细叶卷柏(selaginellaapoda)、selaginellaarbuscula、沙丘卷柏(selaginellaarenicola)、selaginellaarizonica、具刺卷柏(selaginellaarmata)、selaginellaasprella、二形卷柏(selaginellabiformis)、selaginellabigelovii、布rosenstockiana、huperziarufescens、小垂枝石松(huperziasalvinioides)、huperziasarmentosa、小杉兰(huperziaselago)、蛇足石杉(huperziaserrata)、鳞叶石松(huperziasieboldii)、杉叶石松(huperziasquarrosa)、huperziasubulata、huperziatalamancana、huperziatauri、huperziataxifolia、huperziatenuis、huperziatetragona、四角石松(huperziatetrasticha)、huperziatubulosa、huperziaunguiculata、huperziavaria、huperziaverticillata和huperziawilson。[0055]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸分子来源于石松纲的石松目的石松科(familylycopodiaceae)的石松属植物(genuslycopodium)物种，选自但不限于：高山扁枝石松(lycopodiumalpinuml.)、多穗石松(lycopodiumannotinuml.)、东北石松(lycopodiumclavatuml.)、扁枝石松(lycopodiumcomplanatuml.)、lycopodiumdendroideummichx.、lycopodiumdigitatum、lycopodium×habereri、lycopodiumhickeyi、lycopodium×issleri、lycopodiumlagopus、玉柏石松(lycopodiumobscuruml.)、细穗石松(lycopodiumphlegmarial.)、杜松叶石松(lycopodiumsabinifolium)、lycopodiumsitchense、三穗石松(lycopodiumtristachyum)、lycopodiumvenustulum、lycopodiumvenustulumvar.venustulum、lycopodiumvenustulumvar.verticale、lycopodiumvolubile和lycopodium×ꢀzeilleri。[0056]还提供了编码转录和/或翻译产物的核酸分子，所述转录和/或翻译产物随后被剪接而最终产生功能性ptip‑96多肽。剪接可在体外或体内完成，并且可涉及顺式或反式剪接。供剪接的底物可以是多核苷酸(例如，rna转录物)或多肽。多核苷酸顺式剪接的示例是将插入编码序列中的内含子移除并且将两个旁侧外显子区剪接而产生ptip‑96多肽编码序列的情形。反式剪接的示例将是通过如下方式加密多核苷酸的情形：将编码序列分成两个或更多个片段，所述两个或更多个片段可单独地转录，然后剪接而形成全长杀虫编码序列。可引入构建体中的剪接增强子序列的使用可有利于多肽顺式或反式剪接方式的剪接(美国专利no.6,365,377和6,531,316)。因此，在一些实施方案中，所述多核苷酸不直接编码全长ptip‑96多肽，而是编码ptip‑96多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及剪接的机制来表达功能性ptip‑96多肽，其中剪接可在多核苷酸(例如，内含子/外显子)和/或多肽(例如，内含肽/外显肽)水平发生。这可用于例如控制杀虫活性的表达，因为功能性杀虫多肽将仅在如下情况下表达：所有必需的片段在容许剪接过程的环境中表达从而产生功能性产物。又如，在多核苷酸中引入一个或多个插入序列可有利于与低同源性多核苷酸的重组；插入序列使用内含子或内含肽有利于移除间插序列，从而恢复所编码变体的功能。[0057]作为这些编码ptip‑96多肽的核酸序列的片段的核酸分子也被所述实施方案涵盖。如本文所用，“片段”是指编码ptip‑96多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码ptip‑96多肽的生物活性部分，或其可以是在使用下文所公开的方法时可用作杂交探针或pcr引物的片段。作为编码ptip‑96多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约150、180，210，240，270，300，330或360个连续核苷酸或最多至存在于编码本文所公开的ptip‑ꢀ96多肽的全长核酸序列中的核苷酸的数量，具体取决于预期应用。“连续核苷酸”在本文中用来指彼此紧邻的核苷酸残基。所述实施方案的核酸序列的片段将编码保留ptip‑96aa多肽的生物活性并从而保留杀昆虫活性的蛋白片段。“保留杀昆虫活性”在本文中用来指多肽，所述多肽具有至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的全长ptip‑96aa多肽(seqidno：9)的杀昆虫活性。在一些实施方案中，杀昆虫活性是鳞翅目活性。在一个实施方案中，杀昆虫活性是对于鞘翅目物种而言的。在一些实施方案中，杀昆虫活性是对以下一种或多种昆虫害虫玉米根虫复合体而言的：西部玉米根虫即玉米幼芽根叶甲(diabroticavirgifera)；北方玉米根虫即长角叶甲(d.barberi)；南方玉米根虫或十一星瓜叶甲；黄瓜十一星叶甲(diabroticaundecimpunctatahowardi)和墨西哥玉米根虫即西部玉米根虫(d.virgferazeae)。在一个实施方案中，杀昆虫活性是对于叶甲物种而言的。[0058]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸序列的编码蛋白生物活性部分的片段将编码至少约15，20，30，50，75，100，125个连续氨基酸或最多至存在于所述实施方案的全长ptip‑96多肽中的氨基酸的总数。在一些实施方案中，片段是例如通过蛋白水解、起始密码子的插入、编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随终止密码子的插入或通过编码序列中终止密码子的插入，相对于seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108或其变体从n末端和/或c末端的至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34个或更多个氨基酸的n末端和/或c末端截短。[0059]在一些实施方案中，ptip‑96多肽由与seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：15、seqidno：11、seqidno：13、seqidno：15、seqidno：17、seqidno：19、seqidno：21、seqidno：23、seqidno：25；seqidno：27；seqidno：29、seqidno：31、seqidno：33、seqidno：35、seqidno：37、seqidno：39、seqidno：41、seqidno：43、seqidno：45、seqidno：47、seqidno：49、seqidno：51、seqidno：53、seqidno：55、seqidno：57、seqidno：59、seqidno：61、seqidno：63、seqidno：65、seqidno：67、seqidno：69、seqidno：71、seqidno：73、seqidno：75、seqidno：77、seqidno：79、seqidno：81、seqidno：83、seqidno：85、seqidno：87、seqidno：89、seqidno：91、seqidno：93、seqidno：95、seqidno：97、seqidno：99、seqidno：101、seqidno：103、seqidno：105、seqidno：107或seqidno：109的核酸序列充分同源的核酸序列编码。“充分同源”在本文中用来指使用本文所述的比对程序之一并采用标准参数与参考序列进行比较时氨基酸或核酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两条核酸序列所编码的蛋白质的相应同源性。在一些实施方案中，序列同源性是针对编码ptip‑96多肽的多核苷酸的全长序列或针对ptip‑96多肽的全长序列而言的。[0060]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的核酸选自seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：15、seqidno：11、seqidno：13、seqidno：15、seqidno：17、seqidno：19、seqidno：21、seqidno：23、seqidno：25；seqidno：27；seqidno：29、seqidno：31、seqidno：33、seqidno：35、seqidno：37、seqidno：39、seqidno：41、seqidno：43、seqidno：45、seqidno：47、seqidno：49、seqidno：51、seqidno：53、seqidno：55、seqidno：57、seqidno：59、seqidno：61、seqidno：63、seqidno：65、seqidno：67、seqidno：69、seqidno：71、seqidno：73、seqidno：75、seqidno：77、seqidno：79、seqidno：81、seqidno：83、seqidno：85、seqidno：87、seqidno：89、seqidno：91、seqidno：93、seqidno：95、seqidno：97、seqidno：99、seqidno：101、seqidno：103、seqidno：105、seqidno：107或seqidno：109中的任一项。[0061]在一些实施方案中，核酸编码这样的ptip‑96多肽，其相较于seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seoidno：108具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。[0062]在一些实施方案中，序列同一性是使用采用全部默认参数的vector程序组(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(invitrogencorporation，carlsbad，calif.))的模块中的clustalw算法来计算的。在一些实施方案中，序列同一性是使用采用全部默认参数的vectornti程序组(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(invitrogencorporation，carlsbad，calif.))的alignx模块中的clustalw算法跨越多肽的整个长度计算的。[0063]为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同一性百分比，对序列进行了最佳比较目的的比对。这两条序列之间的同一性百分比是序列所共有的相同位置的数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置的数量/位置(例如，重叠的位置)的总数×100)。在一个实施方案中，这两条序列长度相同。在另一个实施方案中，所述比较跨越参考序列整体(例如，跨越seqidno：1整体)。两条序列之间的同一性百分比可使用类似于下文所述的那些的技术在允许或不允许空位的情况下确定。在计算同一性百分比中，通常对准确的匹配进行计数。[0064]用于序列比较的数学算法的另一个非限制性示例是needleman和wunsch，(1970)j.mol.biol.48(3)：443‑453的算法，其使用gap版本10软件采用以下默认参数来测定序列同一性或相似性：核酸序列的同一性％和相似性％使用gap权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmpii打分矩阵；氨基酸序列的同一性％或相似性％使用gap权重8和长度权重2以及blosum62打分程序。也可使用等同程序。“等同程序”在本文中用来指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于gap版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。[0065]所述实施方案还涵盖编码ptip‑96多肽变体的核酸分子。ptip‑96多肽编码核酸序列的“变体”包括编码本文公开的ptip‑96多肽但由于遗传密码的简并性而保守地差异的那些序列以及与上文所讨论充分相同的那些序列。天然存在的等位基因变体可用熟知的分子生物学技术进行鉴定，比如用下文所述的聚合酶链反应(pcr)和杂交技术来鉴定。变体核酸序列也包括合成而得的核酸序列，其例如通过使用定点诱变而产生，但仍然编码所公开的ptip‑96多肽，如下文所讨论。[0066]本公开提供编码任何本文所公开的ptip‑96多肽的分离的或重组的多核苷酸。本领域普通技术人员将易于理解，由于遗传密码的简并性，存在大量编码本公开ptip‑96多肽的核苷酸序列。[0067]技术人员还将理解，可通过核酸序列的突变引入变化，从而引起所编码的ptip‑96多肽的氨基酸序列的变化，而不改变蛋白的生物活性。因此，可通过将一个或多个核苷酸置换、添加和/或缺失引入本文所公开的相应核酸序列中来形成变体核酸分子，使得一个或多个氨基酸置换、添加或缺失被引入所编码的蛋白中。可通过标准技术，比如定点诱变和pcr介导的诱变来引入突变。此类变体核酸序列也被本发明涵盖。[0068]或者，可通过沿着全部或部分的编码序列随机地引入突变，比如通过饱和诱变来制得变体核酸序列，并且可筛查所得突变体赋予杀虫活性的能力以鉴定保留活性的突变体。诱变后，可以重组方式表达所编码的蛋白，并且可使用标准测定法技术确定该蛋白的活性。[0069]除如ausubel、berger和sambrook所述的标准克隆方法以外，本发明的多核苷酸及其片段任选地用作多种重组和递归重组反应的底物，即，为了产生具有所需特性的额外杀虫多肽同源物及其片段。多种此类反应是已知的，包括发明人及其同事开发的那些。用于产生本文所列任何核酸的变体的方法包括将此类多核苷酸与第二(或更多)多核苷酸递归重组，从而形成变体多核苷酸的文库，所述方法也是本发明的实施方案，所产生的文库、包含所述文库的细胞以及由此类方法产生的任何重组多核苷酸也是如此。另外，此类方法任选地包括当此类递归重组在体外或体内完成时，基于杀虫活性从此类文库选择变体多核苷酸。[0070]多种多样性产生方案(包括核酸递归重组方案)可供使用并且已在本领域中充分描述。这些程序可单独和/或组合使用以产生核酸或核酸组的一个或多个变体，以及所编码的蛋白的变体。这些程序单独地和共同地提供产生多样化的核酸和核酸组(包括例如核酸文库)的稳固、广泛适用的方法，可用于例如核酸、蛋白、通路、细胞和/或生物体的工程改造或快速进化而具有新的和/或改善的特性。[0071]虽然为清楚起见在后续讨论过程中进行了区分和分类，但应当理解，这些技术通常不是互相排斥的。事实上，所述各种方法可单独或组合使用、并行或连续使用，以获得多样的序列变体。[0072]任何本文所述的多样性产生程序的结果可以是产生一条或多条核酸，可对所述一条或多条核酸进行选择或筛选而得到具有或赋予所需特性的核酸或者编码具有或赋予所需特性的蛋白的核酸。在通过本文的一种或多种方法或者可供技术人员使用的其它方法进行多样化后，可针对所需活性或特性例如杀虫活性或在所需ph下的此类活性等等，来选择产生的任何核酸。这可包括鉴定任何活性，所述活性可通过本领域的任何测定法以例如自动化或可自动化的格式进行检测，参见例如下文杀昆虫活性的筛查的讨论。多种相关(或甚至不相关)特性可由操作人员自行决定是连续地还是并行地评价。[0073]用于产生经修饰的核酸序列(例如编码具有杀虫活性的多肽或其片段的核酸序列)的多种多样性产生程序的描述可见于下列出版物及其中引用的参考文献：soong等人，(2000)natgenet25(4)：436‑439；stemmer等人，(1999)tumortargeting4：1‑4；ness等人，(1999)natbiotechnol17：893‑896；chang等人，(1999)natbiotechnol17：793‑797；minshull和stemmer，(1999)curropinchembiol3：284‑290；christians等人，(1999)natbiotechnol17：259‑264；crameri等人，(1998)nature391：288‑291；crameri等人，(1997)natbiotechnol15：436‑438；zhang等人，(1997)pnasusa94：4504‑4509；patten等人，(1997)curropinbiotechnol8：724‑733；crameri等人，(1996)natmed2：100‑103；crameri等人，(1996)natbiotechnol14：315‑319；gates等人，(1996)jmolbiol255：373‑386；stemmer，(1996)“sexualpcrandassemblypcr”in：theencyclopediaofmolecularbiology.vchpublishers，newyork.pp.447‑457(stemmer，1996年，“有性pcr和装配pcr”，载于：《分子生物学百科全书》，纽约vch出版社，第447‑457页)；crameri和stemmer，(1995)biotechniques18：194‑195；stemmer等人，(1995)gene，164：49‑53；stemmer，(1995)science270：1510；stemmer，(1995)bio/technology13：549‑553；stemmer，(1994)nature370：389‑391以及stemmer，(1994)pnasusa91：10747‑10751。[0074]产生多样性的突变方法包括例如定点诱变(ling等人，(1997)analbiochem254(2)：157‑178；dale等人，(1996)methodsmolbiol57：369‑374；smith，(1985)annrevgenet19：423‑462；botstein和shortle，(1985)science229：1193‑1201；carter，(1986)biochemj237：1‑7和kunkel，(1987)“theefficiencyofoligonucleotidedirectedmutagenesis”，载于nucleicacids&molecularbiology(eckstein和lilley编辑，springerverlag，berlin))；使用含尿嘧啶的模板进行的诱变(kunkel，(1985)pnasusa82：488‑492；kunkel等人，(1987)methodsenzymol154：367‑382和bass等人，(1988)science242：240‑245)；寡核苷酸定点诱变(zoller和smith，(1983)methodsenzymol100：468‑500；zoller和smith，(1987)methodsenzymol154：329‑350(1987)；zoller和smith，(1982)nucleicacidsres10：6487‑6500)；硫代磷酸修饰的dna诱变(taylor等人，(1985)nuclacidsres13：8749‑8764；taylor等人，(1985)nuclacidsres13：8765‑8787(1985)；nakamaye和eckstein，(1986)nuclacidsres14：9679‑9698；sayers等人，(1988)nuclacidsres16：791‑802和sayers等人，(1988)nuclacidsres16：803‑814)；使用带空位的双螺旋dna进行的诱变(kramer等人，(1984)nuclacidsres12：9441‑9456；kramer和fritz，(1987)methodsenzymol154：350‑367；kramer等人，(1988)nuclacidsres16：7207和fritz等人，(1988)nuclacidsres16：6987‑6999)。[0075]另外的合适方法包括点错配修复(kramer等人，(1984)cell38：879‑887)、使用修复缺陷型宿主菌株进行的诱变(carter等人，(1985)nuclacidsres13：4431‑4443和carter，(1987)methodsinenzymol154：382‑403)、缺失诱变(eghtedarzadeh和henikoff，(1986)nuclacidsres14：5115)、限制选择和限制纯化(wells等人，(1986)philtransrsoclonda317：415‑423)、通过全基因合成进行的诱变(nambiar等人，(1984)science223：1299‑1301；sakamar和khorana，(1988)nuclacidsres14：6361‑6372；wells等人，(1985)gene34：315‑323和等人，(1985)nuclacidsres13：3305‑3316)、双链断裂修复(mandecki，(1986)pnasusa，83：7177‑7181和arnold，(1993)curropinbiotech4：450‑455)。关于上述方法中许多方法的另外细节可见于methodsenzymolvolume154(《酶学方法》，第154卷)，该文献也描述了各种诱变方法故障排除问题的有用对照。[0076]有关各种多样性产生方法的另外细节可见于下列美国专利、pct公布和申请以及epo公布：美国专利no.5,723,323、美国专利no.5,763,192、美国专利no.5,814,476、美国专利no.5,817,483、美国专利no.5,824,514、美国专利no.5,976,862、美国专利no.5,605,793、美国专利no.5,811,238、美国专利no.5,830,721、美国专利no.5,834,252、美国专利no.5,837,458、wo1995/22625、wo1996/33207、wo1997/20078、wo1997/35966、wo1999/41402、wo1999/41383、wo1999/41369、wo1999/41368、ep752008、ep0932670、wo1999/23107、wo1999/21979、wo1998/31837、wo1998/27230、wo1998/27230、wo2000/00632、wo2000/09679、wo1998/42832、wo1999/29902、wo1998/41653、wo1998/41622、wo1998/42727、wo2000/18906、wo2000/04190、wo2000/42561、wo2000/42559、wo2000/42560、wo2001/23401和pct/us01/06775。[0077]本发明实施方案的核苷酸序列也可用于从蕨类植物门(divisionpteridophyta)的蕨类物种或卷柏属(genusselaginella)的石松物种分离相应的序列。以此方式，诸如pcr、杂交等之类的方法可以用来基于这类序列与本文所述序列的序列同源性从而鉴定这类序列。本发明实施方案涵盖了基于序列与本文所述的完整序列或其片段的序列同一性而选择的序列。这类序列包括为所公开的序列的直系同源物的序列。术语“直系同源物”指衍生自共同祖先基因并且由于物种形成而存在于不同物种中的基因。当其核苷酸序列和/或其所编码的蛋白质序列如本文其它地方所定义的那样具有实质性的同一性时，存在于不同物种中的基因被认为是直系同源物。直系同源物的功能在各种物种中常常是高度保守的。[0078]在pcr方法中，可设计寡核苷酸引物用于pcr反应，以从提取自任何所关注生物体的cdna或基因组dna扩增相应的dna序列。用于设计pcr引物和pcr克隆的方法是本领域公知的，并且公开于sambrook等人，(1989)molecularclonmg：alaboratorymanual(第2版，coldspringharborlaboratorypress，plainview，newyork)，下文称“sambrook”。另外参见innis等人编辑，(1990)pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications(academicpress，newyork)；innis和gelfand编辑，(1995)pcr码序列在生物体中的存在。杂交技术包括对平板接种的(plated)dna文库(噬菌斑或菌落；参见例如sambrook等人，(1989)molecularcloning：alaboratorymanual(2ded.，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.)(sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)进行杂交筛选。[0083]这类序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”在本文中用来指探针与其靶序列杂交的程度比其与其它序列杂交的程度可检测地更高(例如比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调整严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。[0084]蛋白及其变体和片段[0085]在另一方面，ptip‑96多肽也被本公开涵盖。如本文可互换使用的“蕨类植物杀昆虫蛋白‑96”、“ptip‑96多肽”和“ptip‑96蛋白”是指这样的多肽，其具有杀昆虫活性，包括但不限于对于鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫害虫的杀昆虫活性，并且其与seqidno：10的蛋白充分同源。设想了多种ptip‑96多肽。ptip‑96多肽或相关蛋白的来源是蕨类物种或其它原生植物，选自但不限于蕨类植物门的蕨类物种或卷柏属的石松物种。[0086]“充分同源”在本文中用来指使用本文所述的比对程序之一并采用标准参数与参考序列进行比较时氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同源性。在一些实施方案中，序列同源性是针对ptip‑96多肽的全长序列而言的。在一些实施方案中，ptip‑96多肽相较于以下项具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性：seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑氨基酸相似性等等适当调整这些值以确定蛋白质的相应同源性。在一些实施方案中，序列同一性是使用采用全部默认参数的vector程序组(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(invitrogencorporation，carlsbad，calif.))的模块中的clustalw算法来计算的。在一些实施方案中，序列同一性是使用采用全部默认参数的vector程序组(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(invitrogencorporation，carlsbad，calif.))的模块中的clustalw算法跨越多肽的整个长度计算的。[0087]如本文所用，术语“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括包含五个或更多个氨基酸的任何分子。本领域熟知的是，蛋白、肽或多肽分子可进行修饰，包括翻译后修饰，比如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，如本文所用，术语“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括通过任何生物或非生物过程修饰的任何蛋白。术语“氨基酸”是指所有天然存在的l‑氨基酸。[0088]“重组蛋白”在本文中用来指不再处于其天然环境中，例如处于体外或者处于重组细菌或植物宿主细胞中的蛋白。基本上不含细胞物质的ptip‑ꢀ96多肽包括具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的非杀虫蛋白(本文中也称为“污染性蛋白”)的蛋白制备物。[0089]“片段”或“生物活性部分”包括包含与ptip‑96多肽多肽充分相同的氨基酸序列并且表现出杀昆虫活性的多肽片段。ptip‑96多肽的“片段”或ꢀ“生物活性部分”包括包含与如seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108中所示的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列的片段，其中ptip‑96多肽具有杀昆虫活性。此类生物活性部分可通过重组技术制备并且可评价其杀昆虫活性。在一些实施方案中，ptip‑96多肽片段是例如通过蛋白水解、通过起始密码子的插入、通过编码缺失氨基酸的密码子的缺失同时伴随起始密码子的插入和/或终止密码子的插入，相对于seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108从n末端和/或c末端的至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34个或更多个氨基酸的n末端和/或c末端截短。[0090]如本文所用，“变体”是指具有与亲本氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的蛋白或多肽。[0091]ptip‑96多肽[0092]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含与以下项的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108，其中ptip‑96多肽具有杀昆虫活性。[0093]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含与以下项的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：seqidno：9、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22或seqidno：24，其中ptip‑96多肽具有杀昆虫活性。[0094]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含与以下项的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38或seqidno：40，其中ptip‑ꢀ96多肽具有杀昆虫活性。[0095]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含与以下项的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50或seqidno：52，其中ptip‑96多肽具有杀昆虫活性。[0096]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含与以下项的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：seqidno：7、seqidno：8、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88或seqidno：90，其中ptip‑96多肽具有杀昆虫活性。[0097]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含与以下项的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：seqidno：76、seqidno：78或seqidno：80，其中ptip‑96多肽具有杀昆虫活性。[0098]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含与以下项的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：seqidno：7、seqidno：8、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88或seqidno：90，其中ptip‑ꢀ96多肽具有杀昆虫活性。[0099]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含与以下项的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：seqidno：10、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108，其中ptip‑96多肽具有杀昆虫活性。[0100]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含这样的氨基酸序列，其在以下项的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性：seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108。[0101]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含这样的氨基酸序列，其在以下项的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性：seqidno：9、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22或seqidno：24。[0102]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含这样的氨基酸序列，其在以下项的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性：seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38或seqidno：40。[0103]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含这样的氨基酸序列，其在以下项的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性：seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50或seqidno：52。[0104]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含这样的氨基酸序列，其在以下项的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性：seqidno：7、seqidno：8、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88或seqidno：90。[0105]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含这样的氨基酸序列，其在以下项的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性：seqidno：7、seqidno：8、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88或seqidno：90。[0106]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含这样的氨基酸序列，其在以下项的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性：seqidno：76、seqidno：78或seqidno：80。[0107]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含这样的氨基酸序列，其在以下项的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性：seqidno：10、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108。[0108]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的氨基酸序列，其与seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的多肽的相应位置处的天然氨基酸相比具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，1011、12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70个或更多个氨基酸置换。[0109]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：9、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22或seqidno：24的氨基酸序列，其与9、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22或seqidno：24的多肽的相应位置处的天然氨基酸相比具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，1011、12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70个或更多个氨基酸置换。[0110]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38或seqidno：40的氨基酸序列，其与seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38或seqidno：40的多肽的相应位置处的天然氨基酸相比具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，1011、12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70个或更多个氨基酸置换。[0111]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50或seqidno：52的氨基酸序列，其与seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50或seqidno：52的多肽的相应位置处的天然氨基酸相比具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，1011、12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70个或更多个氨基酸置换。[0112]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：7、seqidno：8、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88或seqidno：90的氨基酸序列，其与seqidno：7、seqidno：8、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88或seqidno：90的多肽的相应位置处的天然氨基酸相比具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，1011、12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70个或更多个氨基酸置换。[0113]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：7、seqidno：8、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88或seqidno：90的氨基酸序列，其与seqidno：7、seqidno：8、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88或seqidno：90的多肽的相应位置处的天然氨基酸相比具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，1011、12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70个或更多个氨基酸置换。[0114]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：76、seqidno：78或seqidno：80的氨基酸序列，其与seqidno：76、seqidno：78或seqidno：80的多肽的相应位置处的天然氨基酸相比具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，1011、12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70个或更多个氨基酸置换。[0115]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：10、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的氨基酸序列，其与seqidno：10、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的多肽的相应位置处的天然氨基酸相比具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，1011、12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70个或更多个氨基酸置换。[0116]在一些实施方案中，序列同一性是使用采用全部默认参数的vector程序组(invitrogencorporation，carlsbad，calif.)的模块中的clustalw算法跨越多肽的整个长度计算的。[0117]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的氨基酸序列。[0118]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：9、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22或seqidno：24的氨基酸序列。[0119]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38或seqidno：40的氨基酸序列。[0120]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50或seqidno：52的氨基酸序列。[0121]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：7、seqidno：8、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88或seqidno：90的氨基酸序列。[0122]在一些实施方案中，ptip‑96多肽包含seqidno：10、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的氨基酸序列。[0123]杀昆虫蛋白家族的系统发育、序列基序以及结构分析[0124]所用序列和结构分析方法由四个组成部分构成：系统发育树构建、蛋白质序列基序发现、二级结构预测、以及蛋白质序列和二级结构的比对。有关各个组成部分的细节如下所示。[0125]1)系统发育树构建[0126]可用软件mega5进行系统发育分析。对蛋白质序列进行clustalw版本2分析(larkinm.a等人(2007)bioinformatics23(21)：2947‑2948)以进行多个序列比对。然后以基于jtt矩阵的模型为基础，通过最大似然法推断进化史。获得具有最高对数似然比的树，按newick格式输出，并进一步处理以按照其在树中出现的相同顺序提取序列id。对于各个杀昆虫蛋白家族，可人工鉴定代表亚家族的几个进化枝。[0127]2)蛋白质序列基序发现[0128]根据先前构建的系统发育树对蛋白质序列进行重新排序，并且馈送到基序分析工具meme(multipleemformotifelicitation)(baileyt.l.和elkanc.，proceedingsofthesecondinternationalconferenceonintelligentsystemsformolecularbiology，第28‑36页，aaaipress，menlopark，california，1994.)来鉴定关键序列基序。如下设置meme：最小位点数目2，最小基序宽度5，和最大基序数目30。通过视觉观察来鉴定对各个亚家族独特的序列基序。基序跨越整个基因家族的分布可显示于html网页中。相对于各个基序的e‑值排序对基序编号。[0129]3)二级结构预测[0130]可将psipred即高排序二级结构预测方法(jonesdt.(1999)j.mol.biol.292：195‑202)安装于本地linux服务器，并且用于蛋白质二级结构预测。工具采用基于psi‑blast输出的两个前馈神经网络来提供准确的结构预测。通过清除uniref100中低复杂度的跨膜和卷曲螺旋区域来创建psi‑ꢀblast数据库。psipred结果包含预测的二级结构(α螺旋：h，β链：e，以及卷曲：c)和给定蛋白质序列中各个氨基酸的对应置信度得分。[0131]4)蛋白质序列和二级结构的比对[0132]开发定制的脚本以根据得自步骤1的所有蛋白质的多重蛋白质序列比对而产生有间隙的二级结构比对。将所有比对的蛋白质序列和结构汇总成单个fasta文件，然后导入到mega中以显示和鉴定保守结构。[0133]在一些实施方案中，ptip‑96多肽具有改变的物理性质。如本文所用，术语“物理性质”是指适用于描述蛋白的物理化学特性的任何参数。如本文所用，“所关注的物理性质”和“所关注的性质”可互换使用，是指正研究和/或修饰的蛋白的物理性质。物理性质的示例包括但不限于蛋白表面上的净表面电荷和电荷分布、蛋白表面上的净疏水性和疏水残基分布、表面电荷密度、表面疏水性密度、表面可电离基团的总数、表面张力、蛋白大小及其在溶液中的分布、熔融温度、热容和第二维里系数。物理性质的示例还包括但不限于溶解度、折叠性、稳定性和消化性。在一些实施方案中，ptip‑96多肽具有增强的蛋白水解片段在昆虫肠道中的消化性。由模拟胃液来消化的模型是本领域技术人员已知的(fuchs，r.l.andj.d.astwood.foodtechnology50：83‑88，1996；astwood，j.d.等人，naturebiotechnology14：1269‑1273，1996；futj等人，j.agricfoodchem.50：7154‑7160，2002)。[0134]在一些实施方案中，变体包括因诱变而导致氨基酸序列有差异的多肽。本发明所涵盖的变体蛋白具有生物活性，即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性(即杀虫活性)。在某个实施方案中，变体将具有天然蛋白的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约80％或更高的杀昆虫活性。在一些实施方案中，变体可具有相比于天然蛋白改善的活性。[0135]细菌基因常常在开放阅读框起点附近具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在一个或多个这些起始密码子处的翻译起始将导致产生功能蛋白。这些起始密码子可包括atg密码子。然而，细菌诸如芽孢杆菌物种也将密码子gtg识别为起始密码子，并且在gtg密码子处起始翻译的蛋白在第一位氨基酸处包含甲硫氨酸。在少数情况下，细菌系统中的翻译可在ttg密码子处起始，但在此情形下ttg编码甲硫氨酸。此外，通常不能先验确定这些密码子中的哪些是细菌中天然使用的。因此，应当理解，使用替代甲硫氨酸密码子之一也可导致产生杀虫蛋白。这些杀虫蛋白涵盖于本发明中并且可在本发明的方法中使用。应当理解，当在植物中表达时，为实现正确翻译，有必要将替代起始密码子更改为atg。[0136]在另一个方面，ptlp‑96多肽可被表达为具有间插序列的前体蛋白，所述间插序列催化多步的翻译后蛋白剪接。蛋白剪接涉及从多肽切除间插序列，同时伴随旁侧序列的连接，从而产生新的多肽(chong等人，(1996)j.biol.chem.，271：22159‑22168)。该间插序列或蛋白剪接元件称为内含肽，其通过如下三个协调一致的反应在n末端和c末端剪接连接点处催化其自身的切除：n末端半胱氨酸或丝氨酸的酰基重排；两个末端之间的酯交换反应以形成支链酯或硫酯中间体，以及肽键断裂同时伴随内含肽c末端天冬酰胺的环化，使内含肽得以释放(evans等人，(2000)j.biol.chem.，275：9091‑9094)。蛋白剪接机制的阐明产生了多种基于内含肽的应用(comb等人，美国专利no.5,496,714；comb等人，美国专利no.5,834,247；camarero和muir，(1999)j.amer.chem.soc.121：5597‑5598；chong等人，(1997)gene192：271‑281；chong等人，(1998)nucleicacidsres.26：5109‑5115；chong等人，(1998)j.biol.chem.273：10567‑10577；cotton等人，(1999)j.am.chem.soc.121：1100‑1101；evans等人，(1999)j.biol.chem.274：18359‑18363；evans等人，(1999)j.biol.chem.274：3923‑ꢀ3926；evans等人，(1998)proteinsci.7：2256‑2264；evans等人，(2000)j.biol.chem.275：9091‑9094；iwai和pluckthun，(1999)febslett.459：166‑ꢀ172；mathys等人，(1999)gene231：1‑13；mills等人，(1998)proc.natl.acad.sci.usa95：3543‑3548；muir等人，(1998)proc.natl.acad.sci.usa95：6705‑6710；otomo等人，(1999)biochemistry38：16040‑16044；otomo等人，(1999)j.biolmol.nmr14：105‑114；scott等人，(1999)proc.natl.acad.sci.usa96：13638‑13643；severinov和muir，(1998)j.biol.chem.273：16205‑ꢀ16209；shingledecker等人，(1998)gene207：187‑195；southworth等人，(1998)emboj.17：918‑926；southworth等人，(1999)biotechniques27：110‑ꢀ120；wood等人，(1999)nat.biotechnol.17：889‑892；wu等人，(1998a)proc.natl.acad.sci.usa95：9226‑9231；wu等人，(1998b)biochimbiophysacta1387：422‑432；xu等人，(1999)proc.natl.acad.sci.usa96：388‑393；yamazaki等人，(1998)j.am.chem.soc.，120：5591‑5592)。有关内含肽在植物转基因中的应用，参见yang等人(transgeneres15：583‑593(2006))和evans等人(annu.rev.plantbiol.56：375‑392(2005))。[0137]在另一个方面，ptip‑96多肽可由两个单独的基因编码，其中前体蛋白的内含肽来自这两个基因，称为断裂型内含肽，并且前体的这两个部分通过肽键形成而连接在一起。该肽键形成通过内含肽介导的反式剪接而实现。为此，包含这两个单独基因的第一和第二表达盒还编码能够介导蛋白反式剪接的内含肽。通过反式剪接，由第一和第二片段编码的蛋白和多肽可通过肽键形成而连接在一起。反式剪接内含肽可选自包括真核生物、古细菌和真细菌的不同生物体的核仁和细胞器基因组。可使用的内含肽在neb.com/neb/inteins.html(可使用“www”前缀在万维网上访问)处列出。编码内含肽的核苷酸序列可断裂成分别编码内含肽5′和3′部分的5′和3′部分。内含肽剪接不需要的序列部分(例如，归巢内切核酸酶结构域)可以缺失。内含肽编码序列断裂成使得5′和3′部分能够反式剪接。为了选择内含肽编码序列的合适断裂位点，可遵循southworth等人，(1998)emboj.17：918‑926公布的考虑因素。在构建第一和第二表达盒中，将5′内含肽编码序列连接至编码ptip‑96多肽的n末端部分的第一片段的3′端，并且将3′内含肽编码序列连接至编码ptip‑96多肽的c末端部分的第二片段的5′端。[0138]一般来讲，可使用任何断裂型内含肽(包括任何天然存在的或人工断裂的断裂型内含肽)来设计反式剪接伴侣。已知几种天然存在的断裂型内含肽，例如集胞蓝细菌属种(synechocystissp.)pcc6803的dnae基因的断裂型内含肽(参见wu等人，(1998)procnatlacadsciusa.95(16)：9226‑31和evans等人，(2000)jbiolchem.275(13)：9091‑4)和点形念珠藻(nostocpunctiforme)的dnae基因的断裂型内含肽(参见iwai等人，(2006)febslett.580(7)：1853‑8)。已在实验室人工断裂非断裂型内含肽以形成新断裂型内含肽，例如人工断裂sspdnab内含肽(参见wu等人，(1998)biochimbiophysacta.1387：422‑32)和断裂scevma内含肽(参见brenzel等人，(2006)biochemistry.45(6)：1571‑8)和人工断裂真菌微型内含肽(参见elleuche等人，(2007)biochembiophysrescommun.355(3)：830‑4)。还存在编目已知内含肽的可用内含肽数据库(参见例如，在线获得的数据库：bioinformatics.weizmann.ac.il/～pietro/inteins/inteinstable.html，其可使用ꢀ“www”前缀在万维网上访问)。[0139]天然存在的非断裂型内含肽可具有内切核酸酶或其它酶活性，这些酶活性通常可在设计人工断裂的断裂型内含肽时被移除。此类微型内含肽或最小化的断裂型内含肽是本领域熟知的，并且长度通常少于200个氨基酸残基(参见wu等人，(1998)biochimbiophysacta.1387：422‑32)。合适的断裂型内含肽可具有添加至其结构的其它实现纯化的多肽元件，前提条件是此类元件不会抑制断裂型内含肽的剪接或者以允许其在剪接之前被移除的方式添加。已经报道了蛋白质剪接，其使用的蛋白质包含细菌内含肽样(bil)结构域(参见amitai等人，(2003)molmicrobiol.47：61‑73)和hedgehog(h0g)自动处理结构域(当称为hog/内含肽亚家族或hint家族时，后者与内含肽结合(参见dassa等人，(2004)jbiolchem.279：32001‑ꢀ7))和一些结构域例如这些也可用于制备人工断裂内含肽。具体地讲，可通过分子生物学方法修饰此类家族的非剪接成员以在此类相关物质中引入或恢复剪接活性。最近的研究证实，当使n末端断裂型内含肽组分与自然界中并非作为其“伴侣”存在的c末端断裂型内含肽组分反应时，可观察到剪接。例如，采用与“天然”剪接伴侣具有少至30％至50％同源性的伴侣时，观察到了剪接(参见dassa等人，(2007)biochemistrv.46(1)：322‑ꢀ30)。已表明，相异的断裂型内含肽伴侣的其它此类混合物彼此无反应(参见brenzel等人，(2006)biochemistry.45(6)：1571‑8)。然而，在相关领域技术人员能力范围内的是，使用常规方法且不必运用独创性技术就可确定具体的一对多肽是否能够彼此相连而提供功能性内含肽。[0140]在另一个方面，ptip‑96多肽是环状排列的变体。在某些实施方案中，ptip‑96多肽是seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的多肽的环状排列的变体。[0141]重组dna方法的开发使得可以研究序列转座对蛋白折叠、结构和功能的影响。用于形成新序列的方法类似于天然存在的蛋白对的与其氨基酸序列的线性重构相关的方法(cunningham等人，(1979)proc.natl.acad.sci.u.s.a.76：3218‑3222；teather和erfle，(1990)j.bacteriol.172：3837‑3841；schimming等人，(1992)eur.j.biochem.204：13‑19；yamiuchi和minamikawa，(1991)febslett.260：127‑130；macgregor等人，(1996)febslett.378：263‑266)。goldenberg和creighton(j.mol.biol.165：407‑413，1983)描述了该类型重排首次体外应用于蛋白。在形成环状排列的变体中，在初始序列的内部位点(断点)处选择新的n末端，从该断点开始，该新序列具有与初始序列相同顺序的氨基酸，直到其到达处于或接近初始c末端的氨基酸。此时，该新序列直接地或通过序列的另外部分(接头)连接至处于或接近初始n末端的氨基酸，并且该新序列继续采用与初始序列相同的序列，直到其到达处于或接近初始序列断点位点n末端的氨基酸的点，该残基形成该链的新c末端。接头的氨基酸序列长度可根据经验选择或在结构信息指导下选择或通过使用这两种方法的组合选择。当没有可供使用的结构信息时，可使用如下设计来制备小系列的接头以用于测试，该设计的长度是变化的以跨越0至50的范围并且该设计的序列被选择为符合表面暴露(亲水性，hopp和woods，(1983)mol.immunol.20：483‑489；kyte和doolittle，(1982)j.mol.biol.157：105‑132；溶剂暴露的表面积，lee和richards，(1971)j.mol.biol.55：379‑400)和采取所需构象而不扰乱杀虫多肽的构型的能力(构象柔性；karplus和schulz，(1985)naturwissenschaften72：212‑213)。假定每个残基平均平移2.0至3.8，这意味着要测试的长度将在0至30个残基之间，其中0至15个残基是优选的范围。此类经验系列的示例将是使用盒序列诸如重复n次(其中n为1、2、3或4)的gly‑gly‑gly‑ser来构建接头。本领域技术人员将认识到，存在长度或组成有所差别且可用作接头的许多此类序列，首要考虑因素是它们既不能过长也不能太短(参阅sandhu，(1992)criticalrev.biotech.12：437‑ꢀ462)；如果它们太长，熵效应可能会破坏三维折叠的稳定性，并且也可能使折叠在动力学上不切实际，并且如果它们太短，它们可能会因为扭转或空间应变而破坏分子的稳定性。蛋白结构信息分析方面的技术人员将认识到，使用链末端之间的距离(限定为c‑α碳之间的距离)可用来限定要使用的序列的长度，或至少用来限制必须在接头经验选择中测试的可能性数量。他们还将认识到，有时情况是这样的：多肽链的末端的位置在源自x射线衍射或核磁共振波谱数据的结构模型中不明确，并且当事实如此时，该情况将因此需要加以考虑以便正确估计所需接头的长度。从位置明确的那些残基中选择序列中邻近链末端的两个残基，并且使用其c‑α碳之间的距离计算它们之间的接头的近似长度。然后使用计算的长度作为指导，选择具有一定范围残基数量(使用每个残基2至3.8来计算)的接头。这些接头可由初始序列构成，可视需要缩短或延长，并且当延长时，可如上所述将另外的残基选择为柔性和亲水的；或任选地可使用一系列接头替代初始序列，一个示例是上述的gly‑gly‑gly‑ser盒方法；或任选地可使用初始序列和具有适当总长度的新序列的组合。能够折叠成生物活性状态的杀虫多肽的序列可通过从初始多肽链内适当选择开始(氨基末端)和结束(羧基末端)位置同时使用如上所述的接头序列来制备。使用下述指南从序列的共同链段(称为断点区)内选择氨基末端和羧基末端。因此，通过从相同断点区内选择氨基末端和羧基末端，产生了新型氨基酸序列。在许多情况下，新末端的选择将使得羧基末端的初始位置紧接在氨基末端的初始位置之前。然而，本领域技术人员将认识到，在该区域内任何位置处选择末端都可起作用，并且这些将有效地引起新序列的氨基或羧基部分的缺失或添加。分子生物学的核心原则是，蛋白的一级氨基酸序列决定了折叠成表达其生物功能所需的三维结构。使用单一蛋白晶体的x射线衍射或蛋白溶液的核磁共振波谱获得并解读三维结构信息的方法是本领域技术人员已知的。与断点区鉴定相关的结构信息的示例包括蛋白二级结构的定位和类型(α螺旋和3‑10螺旋、平行和反平行β折叠、链反转和转角以及环；kabsch和sander，(1983)biopolymers22：2577‑2637；氨基酸残基的溶剂暴露程度、残基彼此相互作用的程度和类型(chothia，(1984)ann.rev.biochem.53：537‑572)以及沿着多肽链的构象静态和动态分布(alber和mathews，(1987)methodsenzymol.154：511‑533)。在一些情况下，已知关于残基溶剂暴露的另外信息；一个示例是有必要位于蛋白表面上的糖类的翻译后连接位点。当实验结构信息不可用或不可能获得时，也可利用多种方法分析一级氨基酸序列以预测蛋白三级和二级结构、溶剂可及性以及转角和环的出现。当直接结构方法不可行时，生物化学方法有时也可适用于经验地确定表面暴露。例如，在限制性蛋白水解后利用断链位点的鉴定以推断表面暴露(gentile和salvatore，(1993)eur.j.biochem.218：603‑621)。因此，使用实验得出的结构信息或预测方法(例如，srinivisan和rose，(1995)proteins：struct.，funct.&genetics22：81‑99)检查亲本氨基酸序列以根据它们对于二级和三级结构的维持是否不可或缺而将区域分类。在已知涉及周期性二级结构(α螺旋和3‑10螺旋、平行和反平行β折叠)的区域内出现的序列是应当避开的区域。类似地，观察或预测到具有较低程度溶剂暴露的氨基酸序列的区域更可能是蛋白的所谓疏水核的部分，并且对于氨基末端和羧基末端的选择也应当避开。相比之下，已知或经预测在表面转角或环中的那些区域，特别是已知并非生物活性所需的那些区域，是多肽链末端定位的优选位点。基于上述标准所优选的氨基酸序列的连续链段被称为断点区。可基本上按照如下文献中所述的方法制备编码环状排列的ptip‑96多肽的多核苷酸，所述ptip‑96多肽具有包含将初始c末端和n末端分隔开的接头区的新n末端/c末端：mullins等人，(1994)j.am.chem.soc.116：5529‑ꢀ5533。使用聚合酶链反应(pcr)扩增的多个步骤来重排编码蛋白一级氨基酸序列的dna序列。可基于如下文献中所述的串联重复方法制备编码环状排列的ptip‑96多肽的多核苷酸，所述ptip‑96多肽具有包含将初始c末端和n末端分隔开的接头区的新n末端/c末端：horlick，etal.，(1992)proteineng.5：427‑431(horlick等人，1992年，《蛋白质工程》，第5卷，第427‑431页)。使用串联重复的模板dna进行新n末端/c末端基因的聚合酶链反应(pcr)扩增。[0142]在另一个方面，提供了融合蛋白，所述融合蛋白在其氨基酸序列内包含构成ptip‑96多肽的氨基酸序列，所述ptip‑96多肽包括但不限于seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的多肽及其活性片段。[0143]用于设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的。编码ptip‑96多肽的多核苷酸可融合到信号序列，所述信号序列将引导ptip‑96多肽定位于原核或真核细胞的特定区室和/或引导所述实施方案的ptip‑96多肽从原核或真核细胞分泌。例如，在大肠杆菌中，可能希望引导蛋白表达于周质空间。ptip‑96多肽可融合到其上以引导多肽表达于细菌周质空间的信号序列或蛋白(或其片段)的示例包括但不限于pelb信号序列、麦芽糖结合蛋白(mbp)信号序列mbp、ompa信号序列、周质大肠杆菌不耐热肠毒素b亚基的信号序列以及碱性磷酸酶的信号序列。用于构建将引导蛋白的定位的融合蛋白的若干载体可商购获得，诸如可购自新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs)的pmal系列载体(特别是pmal‑p系列)。在具体的实施方案中，ptip‑96多肽可融合到pelb果胶酸裂解酶信号序列以增加此类多肽在革兰氏阴性细菌中表达和纯化的效率(参见，美国专利no.5,576,195和no.5,846,818)。植物质体转运肽/多肽融合体是本领域熟知的(参见，美国专利no.7,193,133)。质外体转运肽诸如水稻或大麦α‑淀粉酶分泌信号也是本领域熟知的。质体转运肽通常融合到要靶向的多肽(例如，融合伴侣)的n末端。在一个实施方案中，融合蛋白基本上由质体转运肽和要靶向的ptip‑96多肽组成。在另一个实施方案中，融合蛋白包含质体转运肽和要靶向的多肽。在此类实施方案中，质体转运肽优选地位于融合蛋白的n末端。然而，另外的氨基酸残基可处于质体转运肽的n末端，前提条件是融合蛋白至少部分地靶向质体。在具体的实施方案中，质体转运肽处于融合蛋白的n末端一半处、n末端三分之一处或n末端四分之一处。大多数或所有质体转运肽通常在插入质体中后从融合蛋白裂解。由于特定的细胞间状况或所使用的转运肽/融合伴侣的具体组合，裂解的位置在植物物种之间、在不同植物发育期可略有差别。在一个实施方案中，质体转运肽裂解是同源的，使得裂解位点在融合蛋白群中是相同的。在另一个实施方案中，质体转运肽裂解是非同源的，使得裂解位点在融合蛋白群中相差1‑10个氨基酸。质体转运肽可以若干方法之一重组地融合到第二蛋白。例如，可将限制性内切核酸酶识别位点引入转运肽的核苷酸序列中对应于其c末端的位置处，并且可将该位点或相容位点设计在要靶向的蛋白的核苷酸序列中其n末端处。必须小心设计这些位点以确保转运肽和第二蛋白的编码序列保持处于“框内”，从而允许所需融合蛋白的合成。在一些情况下，当引入新限制位点时，可能优选的是将第二蛋白的起始子甲硫氨酸密码子移除。两个亲本分子上限制性内切核酸酶识别位点的引入及其后续通过重组dna技术进行的连接可导致转运肽与第二蛋白之间添加一个或多个额外的氨基酸。只要转运肽裂解位点保持可触及并且第二蛋白的功能不会受到在其n末端处这些额外氨基酸的添加的影响，这通常不会影响靶向活性。或者，本领域技术人员可使用基因合成(stemmer等人，(1995)gene164：49‑53)或类似方法在转运肽与第二蛋白(具有或不具有其起始子甲硫氨酸)之间形成精确裂解位点。此外，转运肽融合体可有意地在裂解位点下游包含氨基酸。成熟蛋白n末端处的氨基酸可影响转运肽将蛋白靶向质体的能力和/或蛋白输入后裂解的效率。这可取决于要靶向的蛋白。参见例如comai等人，(1988)j.biol.chem.263(29)：15104‑9。[0144]在一些实施方案中，提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含通过氨基酸接头连接在一起的ptip‑96多肽和杀昆虫多肽。在一些实施方案中，提供了由选自如下的化学式表示的融合蛋白：[0145]r1‑l‑r2，r2‑l‑r1，r1‑r2或r2‑r1[0146]其中r1为ptip‑96多肽，r2为目的蛋白质。r1多肽直接地或通过接头(l)区段融合到r2多肽。术语“直接地”限定了多肽在无肽接头的情况下进行连接的融合。因此，“l”表示r1和r2两者均框内融合到其上的化学键或多肽区段，最常见的是，l为r1和r2通过酰胺键结合到其上的线性肽，所述酰胺键将r1的羧基末端连接到l的氨基末端并将l的羧基末端连接到r2的氨基末端。所谓“框内融合”意指r1与r2的阅读框之间没有翻译终止或中断。连接基团(l)通常为长度介于1与500个氨基酸之间的多肽。连接两个分子的接头优选地被设计为(1)允许这两个分子独立于彼此折叠和发挥作用，(2)没有倾向形成可干扰这两个蛋白的功能结构域的有序二级结构，(3)具有极少可与功能蛋白结构域相互作用的疏水或带电特性，以及(4)提供r1与r2的位阻分离，使得r1和r2可同时与其在单个细胞上的相应受体相互作用。通常，柔性蛋白区中的表面氨基酸包括gly、asn和ser。事实上，包含gly、asn和ser的氨基酸序列的任何排列预计都将满足接头序列的以上标准。其它中性氨基酸诸如thr和ala也可在接头序列中使用。另外的氨基酸也可包含在接头中，这是由于可在接头序列中添加独特的限制性位点以有利于构建融合体。[0147]在一些实施方案中，接头包含选自下式的序列：(gly3ser)n，(gly4ser)n，(gly5ser)n，(glynser)n或(alaglyser)n，其中n为整数。高度柔性的接头的一个示例是存在于丝状噬菌体例如噬菌体m13或fd的piii蛋白内的富含(glyser)的间隔区(schaller等人，1975)。该区域提供了piii表面蛋白的两个结构域之间较长的柔性间隔区。还包括其中包含肽链内切酶识别序列的接头。对于分离融合体的各个组分以确定它们在体外是否正确折叠并具有活性而言，此类裂解位点可能是有价值的。各种肽链内切酶的示例包括但不限于纤溶酶、肠激酶、激肽释放酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活物、梭菌蛋白酶、凝乳酶、胶原酶、圆斑蝰蛇毒蛋白酶、脯氨酸后裂解酶、v8蛋白酶、凝血酶和因子xa。在一些实施方案中，接头来自于多基因表达运载体(mgev)，其由如美国专利申请公布no.us2007/0277263中所公开的液泡蛋白酶裂解。在其它实施方案中，来自重链免疫球蛋白igg、iga、igm、igd或ige的铰链区的连接肽区段提供所连接的多肽之间的角度关系。尤其有用的是半胱氨酸被替代为丝氨酸的那些铰链区。本发明的接头包含源自半胱氨酸已更换为丝氨酸的鼠iggγ2b铰链区的序列。融合蛋白不受到所采用的接头序列的形态、大小或数量的限制，并且接头的唯一要求是在功能上其不会不利地干扰融合体的各个分子的折叠和功能。[0148]在另一个方面，提供了嵌合ptip‑96多肽，所述ptip‑96多肽通过连接最初编码单独ptip‑96蛋白的ptip‑96基因的两个或更多个部分形成嵌合基因来产生。嵌合基因的翻译得到了具有源自每个初始多肽的区域、基序或结构域的单个嵌合ptip‑96多肽。在某些实施方案中，嵌合蛋白包含任何组合的seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的ptip‑96多肽的部分、基序或结构域。[0149]已经认识到，可通过各种方法改变dna序列，并且这些改变可导致dna序列编码的蛋白具有与野生型(或天然)杀虫蛋白所编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ptip‑96多肽可以各种方式进行更改，所述方式包括一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短和插入，包括与seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108中任一项相比最多至2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145个或更多个氨基酸置换、缺失和/或插入或它们的组合。[0150]这类操纵的方法是本领域公知的。例如，ptip‑96多肽的氨基酸序列变体可通过在dna中突变来制备。这也可通过若干形式的诱变之一和/或在定向进化中完成。在一些方面，氨基酸序列中编码的变化基本上不会影响蛋白的功能。这种变体将具有所需的杀虫活性。然而，应当理解，可通过对本发明组合物使用此类技术，使ptip‑96多肽赋予杀虫活性的能力提高。[0151]例如，可在一个或多个ptip‑非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可从ptip‑96的野生型序列改变而不改变生物活性的残基。“保守氨基酸置换”是氨基酸残基被替代为具有类似侧链的氨基酸残基的氨基酸置换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；极性、带负电的残基及其酰胺(例如，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；较小脂族、非极性或弱极性的残基(例如，丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸)；非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；较大脂族、非极性的残基(例如，甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸)；β‑支化的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)；较大芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。[0152]氨基酸置换可在保留功能的非保守区中进行。一般来讲，此类置换不会对保守氨基酸残基或对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白活性必需的。保守的且可能是蛋白活性必需的残基的示例包括例如在相似或相关毒素与所述实施方案的序列的比对中所含的所有蛋白之间相同的残基(例如，在同源蛋白的比对中相同的残基)。保守的但可允许保守氨基酸置换且仍然保留活性的残基的示例包括例如在相似或相关毒素与所述实施方案的序列的比对中所含的所有蛋白之间仅具有保守置换的残基(例如，在同源蛋白的比对中所含的所有蛋白之间仅具有保守置换的残基)。然而，本领域技术人员应当理解，功能性变体可能在保守残基中具有微小的保守性或非保守性改变。有关不会影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导可在以下文献所述的模型中找到：dayhoff等人，(1978)atlasofproteinsequenceandstructure(natl.biomed.res.found.，washington，d.c.)，将该文献以引用方式并入本文。[0153]在进行此类改变时，可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在为蛋白赋予相互作用的生物功能方面的重要性是本领域中普遍理解的(kyte和doolittle，(1982)jmolbiol.157(1)：105‑32)。公认的是，氨基酸的相对亲水性特征促成了所得蛋白的二级结构，这继而限定了蛋白与其它分子例如酶、底物、受体、dna、抗体、抗原等等的相互作用。[0154]本领域已知的是，某些氨基酸可被具有类似亲水性指数或评分的其它氨基酸置换，并且仍然产生具有类似生物活性的蛋白，即仍然获得生物功能方面等效的蛋白。基于其疏水性和带电特性为每个氨基酸指定了亲水性指数(kyte和doolittle，同前)。这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(‑0.4)；苏氨酸(‑0.7)；丝氨酸(‑0.8)；色氨酸(‑0.9)；酪氨酸(‑1.3)；脯氨酸(‑1.6)；组氨酸(‑3.2)；谷氨酸(‑3.5)；谷氨酰胺(‑3.5)；天冬氨酸(‑3.5)；天冬酰胺(‑3.5)；赖氨酸(‑3.9)和精氨酸(‑ꢀ4.5)。在进行此类改变时，亲水性指数在+2内的氨基酸的置换是优选的，亲水性指数在+1内的那些是尤其优选的，并且亲水性指数在+0.5内的那些甚至更是尤其优选的。[0155]本领域中还应当理解，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。美国专利no.4,554,101陈述了如由其相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白的最大局部平均亲水性与蛋白的生物性质相关联。[0156]如美国专利no.4,554,101中详述，已为氨基酸残基指定下列亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.±0.1)；谷氨酸(+3.0.±ꢀ0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(‑0.4)；脯氨酸(‑0.5.±0.1)；丙氨酸(‑0.5)；组氨酸(‑0.5)；半胱氨酸(‑1.0)；甲硫氨酸(‑1.3)；缬氨酸(‑1.5)；亮氨酸(‑1.8)；异亮氨酸(‑1.8)；酪氨酸(‑ꢀ2.3)；苯丙氨酸(‑2.5)；色氨酸(‑3.4)。[0157]或者，可对许多蛋白的蛋白序列在氨基末端或羧基末端进行改变，而基本上不影响活性。这可包括通过现代分子方法引入的插入、缺失或改变，所述现代分子方法比如pcr，包括通过使pcr扩增中采用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白编码序列的pcr扩增。或者，所添加的蛋白序列可包括全部蛋白编码序列，比如本领域通常用于产生蛋白融合体的那些。此类融合蛋白通常用于(1)增加目的蛋白质的表达，(2)引入结合域、酶活性或表位以有利于蛋白纯化、蛋白检测或本领域已知的其它实验用途，(3)使蛋白的分泌或翻译靶向亚细胞细胞器，比如革兰氏阴性细菌的细胞周质间隙、植物的线粒体或叶绿体或者真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白的糖基化。[0158]本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖源自诱变和引起重组的程序(比如dna改组)的序列。采用此类程序时，一个或多个不同ptip‑96多肽编码区可用于形成具有所需性质的新ptip‑96多肽。以此方式，从一组相关的多核苷酸序列产生重组多核苷酸的文库，所述相关的多核苷酸序列包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用该方法，可将编码所关注结构域的序列基序在杀虫基因和其它已知的杀虫基因之间进行改组，以获得编码具有改善的所关注性质(比如提高的杀昆虫活性)的蛋白质的新基因。这种dna改组的策略是本领域已知的。参见，例如，stemmer(1994)proc.natl.acad.sci.usa91：10747‑ꢀ10751；stemmer，(1994)nature370：389‑391；crameri等人，(1997)naturebiotech.15：436‑438；moore等人，(1997)j.mol.biol.272：336‑347；zhang等人，(1997)proc.natl.acad.sci.usa94：4504‑4509；crameri等人，(1998)nature391：288‑291；以及美国专利no.5,605,793和5,837,458。[0159]结构域交换或改组是用于产生改变的ptip‑96多肽的另一种机制。结构域可在ptip‑96多肽之间进行交换，从而产生具有改善的杀昆虫活性或目标谱的杂合或嵌合毒素。用于产生重组蛋白并测试其杀虫活性的方法是本领域熟知的(参见，例如naimov等人，(2001)appl.environ.microbiol.67：5328‑5330；demaagd等人，(1996)appl.environ.micrabial.62：1537‑ꢀ1543；ge等人，(1991)j.biol.chem.266：17954‑17958；schnepf等人，(1990)j.biol.chem.265：20923‑20930；rang等人，91999)appl.environ.microbiol.65：2918‑2925)。[0160]ptip‑96同源物的比对(图1)允许鉴定该家族中天然同源物中高度保守的残基。[0161]组合物[0162]还涵盖了包含本公开ptip‑96多肽的组合物。在一些实施方案中，组合物包含seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的ptip‑96多肽。在一些实施方案中，组合物包含ptip‑96融合蛋白。[0163]抗体[0164]还涵盖针对实施方案的ptip‑96多肽或者针对其变体或片段的抗体。本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体以及它们的片断，所述片断保留了其与存在于昆虫肠道中的ptip‑96多肽结合的能力。抗体、单克隆抗体或其片段如果能够与分子发生特异性反应从而使该分子结合于该抗体、单克隆抗体或其片段，则被认为能够结合该分子。术语“抗体”(ab)或“单克隆抗体”(mab)意在包括能够结合半抗原的完整分子以及其片段或结合区或结构域(比如，fab和f(ab).sub.2片段)。此类片段通常由蛋白水解裂解(比如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)产生。或者，半抗原结合片段可通过应用重组dna技术或通过合成化学产生。用于制备本发明抗体的方法是本领域公知的。例如参见antibodies，alaboratorymanual，edharlowanddavidlane(eds.)coldspringharborlaboratory，n.y.(1988)(《抗体：实验室手册》，edharlow和davidlane编辑，纽约冷泉港实验室，1988年)以及其中引用的参考文献。说明免疫学一般原理的标准参考著作包括：klein，j.immunology：thescienceofcell‑noncelldiscrimination，johnwiley&sons，n.y.(1982)；dennett等人，monoclonalantibodies，hybridoma：anewdimensioninbiologicalanalyses，plenumpress，n.y.(1980)以及campbell，ꢀ“monoclonalantibodytechnology，”载于laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology，第13卷，burdon等人(编辑)elsevier，amsterdam(1984)。还可参见美国专利no.4,196,265；4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,716,111；4,716,117和4，720,459。ptip‑96多肽抗体或其抗原结合部分可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如kohlerandmilstein，(1975)nature256：495(kohler和milstein，1975年，《自然》，第256卷，第495页)的标准体细胞杂交技术。也可采用用于产生单克隆抗体的其它技术，比如b淋巴细胞的病毒转化或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。用于分离供融合用的免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。本发明的抗体和单克隆抗体可通过将ptip‑96多肽用作抗原来制备。[0165]提供了用于检测ptip‑96多肽的存在或检测样品中编码ptip‑96多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒提供了基于抗体的试剂以用于检测组织样品中ptip‑96多肽的存在。在另一个实施方案中，该试剂盒提供了可用于检测编码ptip‑96多肽的一个或多个多核苷酸的存在的标记核酸探针。该试剂盒连同执行检测方法的适当试剂和对照以及试剂盒使用说明一起提供。[0166]受体鉴定和分离[0167]还涵盖针对实施方案的ptip‑96多肽或者针对其变体或片段的受体。用于鉴定受体的方法是本领域熟知的(参见，hofmann等人，(1988)eur.j.biochem.173：85‑91；gill等人，(1995)j.biol.chem.27277‑27282)，可用于利用来自易感昆虫的刷状缘膜囊鉴定并分离识别ptip‑96多肽的受体。除了所引用的文献中列出的放射性标记方法以外，ptip‑96多肽还可用荧光染料和其它常见标签诸如链霉亲和素进行标记。易感昆虫诸如大豆尺蠖和椿象的刷状缘膜囊(bbmv)可根据参考文献中列出的方案制备，并且在sds‑ꢀpage凝胶上分离，并印迹在合适的膜上。可将标记的ptip‑96多肽与bbmv的印迹膜一起温育，并用标记的报告基因鉴定标记的ptip‑96多肽。可通过n末端氨基酸气相测序或基于质谱的蛋白鉴定方法检测与ptip‑96多肽相互作用的蛋白条带的身份(patterson，(1998)10.22，1‑24，currentprotocolinmolecularbiology，由johnwiley&soninc出版)。一旦已鉴定蛋白，就可从易感昆虫的基因组dna或cdna文库克隆相应基因，并且可直接用ptip‑96多肽测量结合亲和力。与ptip‑96多肽作用而表现杀昆虫活性的受体功能可通过rnai类型的基因敲除方法完成验证(rajagopal等人，(2002)j.biol.chem.277：46849‑46851)。[0168]核苷酸构建体、表达盒和载体[0169]本文中术语“核苷酸构建体”的使用无意于将所述实施方案局限于包含dna的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合构成的多核苷酸和寡核苷酸，也可应用于本文公开的方法中。所述实施方案的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这类构建体、分子和序列的所有互补形式。此外，所述实施方案的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖可在本发明实施方案的方法中采用以转化植物的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于那些由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸以及它们的组合所构成的核苷酸构建体、分子和序列。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子，也包括合成的类似物。所述实施方案的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖所有形式的核苷酸构建体，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎‑环结构等。[0170]另一个实施方案涉及转化的生物体，如选自植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类的生物体。转化的生物体包含所述实施方案的dna分子、含所述dna分子的表达盒或者含所述表达盒的载体，它们可稳定掺入到转化的生物体的基因组中。[0171]所述实施方案的序列在dna构建体中提供以用于在所关注生物体中表达。该构建体将包括可操作地连接至本发明实施方案的序列的5′和3’调控序列。本文所用的术语“可操作地连接”指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导与第二序列对应的dna序列的转录。一般来讲，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是在相同的阅读框内。该构建体可另外含有至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。或者，所述额外基因可在多个dna构建体上提供。[0172]这种dna构建体提供有多个限制性位点，以使ptip‑96多肽基因序列的插入处于调控区的转录调控之下。dna构建体可另外含有选择性标记基因。[0173]该dna构建体在5′至3′转录方向上通常将包含：转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明实施方案的dna序列、和在充当宿主的生物体中具有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。所述转录起始区(即启动子)相对于宿主生物体和/或相对于本发明实施方案的序列可以是天然的、类似的、外来的或者异源的。另外，该启动子可以是天然序列或另选地是合成序列。如本文所用的术语“外来的”表示启动子在引入该启动子的天然生物体中不存在。如果启动子相对于本发明实施方案的序列是“外来的”或者“异源的”，则意指该启动子不是所可操作地连接的本发明实施方案的序列的天然或天然存在的启动子。本文所用的嵌合基因包含可操作地连接至转录起始区的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。如果启动子是天然或自然的序列，则可操作地连接的序列的表达相比野生型表达被改变，这导致表型改变。[0174]在一些实施方案中，dna构建体还可包含转录增强子序列。如本文所用，术语“增强子”是指这样的dna序列，所述dna序列可以刺激启动子活性，并且可以是启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。各种增强子是本领域已知的，包括例如，植物中具有基因表达增强性质的内含子(美国专利申请公布no.2009/0144863，泛素内含子(即，玉蜀黍泛素内含子1(参见例如，ncbi序列s94464))、omega增强子或omegaprime增强子(gallie等人，(1989)molecularbiologyofrna，cech编辑(liss，newyork)237‑256和gallie等人，(1987)gene60：217‑25)、camv35s增强子(参见例如，benfey等人，(1990)emboj.9：1685‑96)，并且也可使用美国专利no.7,803,992的增强子，各个文献以引入方式并入本文。上面关于转录增强子的列表并不意指是限制性的。任何适当的转录增强子都可用于所述实施方案。[0175]终止区对于转录起始区而言可以是天然的，对于可操作地连接的目的dna序列而言可以是天然的，对于植物宿主而言可以是天然的，或者可以衍自另一来源(即对于该启动子、目的序列、植物宿主或者它们的任何组合而言是外来的或异源的)。[0176]易得的终止区可获自根瘤农杆菌(a.tumefaciens)的ti质粒，比如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另参见guerineau等人，(1991)mol.gen.genet.262：141‑144；proudfoot，(1991)cell64：671‑674；sanfacon等人，(1991)genesdev.5：141‑149；mogen等人，(1990)plantcell2：1261‑1272；munroe等人，(1990)gene91：151‑158；ballas等人，(1989)nucleicacidsres.17：7891‑7903以及joshi等人，(1987)nucleicacidres.15：9627‑9639。[0177]如适当，可将核酸进行优化以提高其在宿主生物体中的表达。因此，如果该宿主生物体是植物，则可用植物偏好的密码子合成出合成的核酸以改进表达。有关宿主偏好的密码子用法的讨论，参见例如campbell和gowri，(1990)plantphysiol.92：1‑11。例如，尽管本发明实施方案的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种两者中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和gc含量偏好性，因为这些偏好性已被证实是不同的(murray等人，(1989)nucleicacidsres.17：477‑498)。因此，特定氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子的用法在murray等人(出处同上)的表4中列出。合成植物偏好基因的方法是本领域现成的。参见例如美国专利no.5,380,831和5,436,391以及murray等人，(1989)nucleicacidsres.17：477‑498以及liuh等人，molbiorep37：677‑684，2010，其均以引用的方式并入本文。玉蜀黍(zeamaize)密码子用法表也可见于kazusa.or.jp/codon/cgi‑ꢀbin/showcodon.cgi？species＝4577(可使用www前缀访问)。[0178]大豆(glycinemax)密码子用法表在表4中示出并且也可见于kazusa.or.jp/codon/cgi‑bin/showcodon.cgi？species＝3847&aa＝1&style＝n(可使用www前缀访问)。[0179]在一些实施方案中，编码ptip‑96多肽的重组核酸分子具有玉蜀黍优化密码子。[0180]已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多聚腺苷酸化信号、外显子‑内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其它得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的gc含量调整至给定细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。如本文所用的术语“宿主细胞”指含有载体并支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(e.coli)或者真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或者哺乳动物细胞，或者单子叶或者双子叶植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个示例是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免可预见的发夹二级mrna结构。[0181]表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，并包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如emcv前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(elroy‑stein等人，(1989)proc.natl.acad.sci.usa86：6126‑6130)；马铃薯y病毒组前导序列，例如，tev前导序列(烟草蚀纹病毒)(gallie等人，(1995)gene165(2)：233‑238)、mdmv前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)、人免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)(macejak等人，(1991)nature353：90‑94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mrna(amvrna4)的非翻译前导序列(jobling等人，(1987)nature325：622‑625)；烟草花叶病毒前导序列(tmv)(gallie等人，(1989)载于molecularbiologyofrna，cech编辑(liss，newyork)，第237‑256页)以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列(mcmv)(lommel等人，(1991)virology81：382‑385)。另参见della‑cioppa等人(1987)plantphysiol.84：965‑968。此类构建体也可包含“信号序列”或“前导序列”以有利于肽共翻译转运或翻译后转运到特定细胞内结构，诸如叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体。[0182]如本文所用的“信号序列”是指已知或疑似引起跨越细胞膜的共翻译肽转运或翻译后肽转运的序列。在真核生物中，这通常涉及分泌到高尔基体中，产生一定程度的糖基化。细菌的杀昆虫毒素通常被合成为原毒素，其在靶标害虫的肠道中通过蛋白水解活化(chang，(1987)methodsenzymol.153：507‑516)。在一些实施方案中，信号序列位于天然序列内，或者可以来源于所述实施方案的序列。如本文所用的“前导序列”是指任意序列，当该序列被翻译时，其产生的氨基酸序列足以触发肽链共翻译转运到亚细胞细胞器。因此，这包括通过进入内质网、穿过液泡、质体(包括叶绿体)、线粒体等而靶向转运和/或糖基化的前导序列。靶向叶绿体类囊体内腔区室的细胞核编码蛋白质具有特征性的二连转运肽(bipartitetransitpeptide)，其由基质靶向信号肽和内腔靶向信号肽构成。基质靶向信息位于该转运肽的氨基近端部分。内腔靶向信号肽位于该转运肽的羧基近端部分，其含有靶向内腔的所有信息。近年来高等植物叶绿体的蛋白质组学研究成功鉴定了许多细胞核编码的内腔蛋白质(kieselbach等人，febslett480：271‑276，2000；peltier等人，plantcell12：319‑341，2000；bricker等人，biochim.biophysacta1503：350‑356，2001)，其内腔靶向信号肽存在依本发明使用的潜能。kieselbach等人，photosynthesisresearch，78：249‑264，2003报道了来自拟南芥(arabidopsis)的约80种蛋白质以及菠菜和豌豆的同源蛋白质。具体地讲，在此以引用方式并入本说明书中的该出版物的表2公开了以其登录号标识的来自叶绿体内腔的85种蛋白质(还可参见美国专利申请公布2009/09044298)。此外，近来发表的水稻基因组草图(goff等人，science296：92‑100，2002)是可根据本发明使用的内腔靶向信号肽的合适来源。[0183]合适的叶绿体转运肽(ctp)是本领域技术人员熟知的，也包括嵌合ctp，所述嵌合ctp包含但不限于来自如下酶的ctp的n末端结构域、中央结构域或c末端结构域：水稻(oryzasativa)1‑脱氧‑d‑木酮糖‑5‑磷酸合酶、水稻过氧化物歧化酶、水稻可溶性淀粉合酶、水稻nadp依赖型苹果酸酶、水稻磷酸‑2‑脱氢‑3‑脱氧庚糖酸醛缩酶2、水稻l‑抗坏血酸过氧化物酶5、水稻磷酸葡聚糖水二激酶、玉米(zeamays)ssrubisco、玉米β‑葡萄糖苷酶、玉米苹果酸脱氢酶、玉米m型硫氧还蛋白(美国专利申请公布2012/0304336)。[0184]要靶向叶绿体的ptip‑96多肽基因可优化用于在叶绿体中表达以考虑植物细胞核与该细胞器之间的密码子用法的差异。这样，可使用叶绿体偏好的密码子合成目的核酸。参见例如，美国专利no.5,380,831，其以引用方式并入本文。[0185]在制备表达盒时，可对多个dna片段进行操纵，以提供处于正确取向的dna序列，且适当时提供处于正确的阅读框的dna序列。为此目的，可应用衔接子或接头将dna片段连接在一起，或者可涉及其它的操纵以提供便利的限制性位点、移除多余的dna、移除限制性位点等。出于这个目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如转换和颠换)。[0186]有多种启动子可用于本发明实施方案的实践中。可根据期望的结果来选择启动子。可将核酸与组成型启动子、组织优选的启动子、诱导型启动子或其它启动子进行组合，以在宿主生物体中表达。适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如wo1999/43838和美国专利no.6,072,050中公开的rsyn7启动子和其它组成型启动子的核心启动子；核心camv35s启动子(odell等人，(1985)nature313：810‑812)；水稻肌动蛋白(mcelroy等人，(1990)plantcell2：163‑171)；遍在蛋白(christensen等人，(1989)plantmol.biol.12：619‑632以及christensen等人，(1992)plantmol.biol.18：675‑689)；pemu(last等人，(1991)theor.appl.genet.81：581‑ꢀ588)；mas(velten等人，(1984)emboj.3：2723‑2730)；als启动子(美国专利no.5,659,026)等等。其它的组成型启动子包括例如以下专利讨论的那些：美国专利no.5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。[0187]取决于所需的结果，从诱导型启动子表达基因可能是有利的。对于调控本发明实施方案的核苷酸序列在植物中的表达特别有意义的是损伤诱导型启动子。这种损伤诱导型启动子可响应昆虫取食所引起的损害，包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pinii)基因(ryan(1990)ann.rev.phytopath.28：425‑ꢀ449；duan等人，(1996)naturebiotechnology14：494‑498)；wun1和wun2(美国专利no.5,428,148)；win1和win2(stanford等人，(1989)mol.gen.genet.215：200‑208)；系统素(mcgurl等人，(1992)science225：1570‑ꢀ1573)；wip1(rohmeier等人，(1993)plantmol.biol.22：783‑792；eckelkamp等人，(1993)febsletters323：73‑76)；mpi基因(corderok等人，(1994)plantj.6(2)：141‑150)等等，这些文献以引用方式并入本文。[0188]另外，病原体诱导型启动子可在所述实施方案的方法和核苷酸构建体中使用。这种病原体诱导型启动子包括那些来自致病相关蛋白(pr蛋白)的在被病原体感染后被诱导的启动子；例如，pr蛋白、sar蛋白、β‑1，3‑ꢀ葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如redolfi等人，(1983)neth.j.plantpathol.89：245‑254；uknes等人，(1992)plantcell4：645‑656以及vanloon，(1985)plantmol.virol.4：111‑116。还可参见wo1999/43819，该专利以引用的方式并入本文。[0189]在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子值得关注。参见例如，marineau等人，(1987)plantmol.biol.9：335‑342；matton等人，(1989)molecularplant‑microbeinteractions2：325‑331；somsisch等人，(1986)proc.natl.acad.sci.usa83：2427‑2430；somsisch等人，(1988)mol.gen.genet.2：93‑98以及yang，(1996)proc.natl.acad.sci.usa93：14972‑ꢀ14977。还可参见chen等人，(1996)plantj.10：955‑966；zhang等人，(1994)proc.natl.acad.sci.usa91：2507‑2511；warner等人，(1993)plantj.3：191‑201；siebertz等人，(1989)plantcell1：961‑968；美国专利no.5,750,386(线虫诱导型)以及其中引用的参考文献。特别值得关注的是玉蜀黍prms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰刀菌(fusariummoniliforme)诱导(参见例如，cordero等人(1992)physiol.mol.plantpath.(《生理与分子植物病理学》)41：189‑200)。[0190]可通过施加外源化学调节剂将化学调控启动子用于调节基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学阻抑型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍in2‑2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂活化)、玉蜀黍gst启动子(其通过用作芽前除草剂的疏水性亲电化合物活化)和烟草pr‑1a启动子(其通过水杨酸活化)。其它所关注的化学调控启动子包括(参见，例如，糖皮质素诱导型启动子，载于schena等人，(1991)proc.natl.acad.sci.usa88：10421‑10425和mcnellis等人，(1998)plantj.14(2)：247‑257)和四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见，例如，gatz等人，(1991)mol.gen.genet.227：229‑237以及美国专利no.5,814,618和5,789,156)，这些文献和专利以引用的方式并入本文。[0191]组织优选的启动子可用来使增强的ptip‑96多肽表达靶向于特定的植物组织内。组织优选的启动子包括以下文献中描述的那些启动子：yamamoto等人，(1997)plantj.12(2)255‑265；kawamata等人，(1997)plantcellphysiol.38(7)：792‑803；hansen等人，(1997)mol.gengenet.254(3)：337‑ꢀ343；russell等人，(1997)transgenicres.6(2)：157‑168；rinehart等人，(1996)plantphysiol.112(3)：1331‑1341；vancamp等人，(1996)plantphysiol.112(2)：525‑535；canevascini等人，(1996)plantphysiol.112(2)：513‑ꢀ524；yamamoto等人，(1994)plantcellphysiol.35(5)：773‑778；lam，(1994)resultsprobl.celldiffer.20：181‑196；orozco等人，(1993)plantmolbiol.23(6)：1129‑1138；matsuoka等人，(1993)procnatl.acad.sci.usa90(20)：9586‑9590以及guevara‑garcia等人，(1993)plantj.4(3)：495‑505。如有必要，可对此类启动子进行修饰，以便弱化表达。[0192]叶优选的启动子是本领域已知的。参见例如，yamamoto等人，(1997)plantj.12(2)：255‑265；kwon等人，(1994)plantphysiol.105：357‑67；yamamoto等人，(1994)plantcellphysiol.35(5)：773‑778；gotor等人，(1993)plantj.3：509‑18；orozco等人，(1993)plantmol.biol.23(6)：1129‑ꢀ1138以及matsuoka等人，(1993)proc.natl.acad.sci.usa90(20)：9586‑ꢀ9590。[0193]根优选的启动子或者根特异性启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从各种相容的物种从头(denovo)分离。参见例如，hire等人，(1992)plantmol.biol.20(2)：207‑218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；keller和baumgartner,(1991)plantcell3(10)：1051‑1061(法国菜豆的grp1.8基因中的根特异性控制元件)；sanger等人，(1990)plantmol.biol.14(3)：433‑443(根瘤农杆菌的甘露氨酸合酶(mas)基因的根特异性启动子)；和miao等人，(1991)plantcell3(1)：11‑22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(gs)的全长cdna克隆，该酶在大豆的根和根瘤中表达)。另参见bogusz等人(1990)plantcell2(7)：633‑641，其中描述了从来自固氮非豆科植物榆科山黄麻(parasponiaandersonii)和相关的非固氮非豆科植物鸡屎藤山麻黄(trematomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β‑葡糖醛酸酶报告基因并引入非豆科植物烟草(nicotianatabacum)和豆科植物百脉根(lotuscorniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。leach和aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(agrobacteriumrhizogenes)的高度表达的rolc和rold根诱导基因的启动子的分析(参见plantscience(limerick)79(1)：69‑76)。他们得出结论认为，增强子和组织优选的dna决定子在那些启动子中是分离的。teeri等人(1989)使用与lacz的基因融合表明，编码章鱼碱合酶的农杆菌t‑ꢀdna基因在根尖的表皮中特别活跃，且tr2′基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激，这是与杀昆虫或杀幼虫基因一起使用的特别理想的特性组合(参见emboj.8(2)：343‑350)。融合到nptii(新霉素磷酸转移酶ii)的tr1′基因显示了相似的特性。另外的根优选的启动子包括vfenod‑grp3基因启动子(kuster等人(1995)plantmol.biol.29(4)：759‑772)；以及rolb启动子(capana等人(1994)plantmol.biol.25(4)：681‑691)。另参见美国专利no.5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。拟南芥(arabidopsisthaliana)根优选的调控序列公开于us20130117883中。[0194]“种子优选的”启动子包括“种子特异性”启动子(这种启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子)和“种子萌发”启动子(这种启动子在种子萌发期间活跃)。参见thompson等人(1989)bioessays10：108，该文献以引用方式并入本文。这类种子优选的启动子包括但不限于cim1(细胞分裂素诱导信息)；cz19b1(玉蜀黍19kda玉米醇溶蛋白)；以及milps(肌醇‑1‑磷酸合酶)(参见美国专利no.6,225,529，其以引用方式并入本文)。γ‑玉米醇溶蛋白基因启动子和glb‑1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于kunitz胰蛋白酶抑制剂3(kti3)(jofuku和goldberg，(1989)plantcell1：1079‑1093)、菜豆β‑菜豆素、油菜籽蛋白(napin)、β‑伴大豆球蛋白、大豆球蛋白1、大豆凝集素、十字花科蛋白等等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kda玉米醇溶蛋白、22kda玉米醇溶蛋白、27kda玉米醇溶蛋白、g‑玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken1、shrunken2、球蛋白1等。还可参见wo2000/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选的启动子；该专利以引用方式并入本文。在双子叶植物中，种子特异性启动子包括但不限于来自拟南芥的种皮启动子pban；以及来自拟南芥的早期种子启动子p26、p63和p63tr(美国专利no.7,294,760和7,847,153)。在特定组织中具有“偏好”表达的启动子在该组织中表达的程度高于在至少一种其它植物组织中表达的程度。一些组织优选的启动子几乎专门在特定组织中表达。[0195]如果需要低水平表达，则要使用弱启动子。一般来讲，如本文所用的术语“弱启动子”指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平表达”意指处于约1/1000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。作为另一种选择，认识到术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中而不在其它细胞中驱动表达从而造成总表达水平较低的启动子。如启动子驱动不可接受的高水平表达，则可缺失或者修饰启动子序列的一些部分以降低表达水平。[0196]这种弱组成型启动子包括例如rsyn7启动子的核心启动子(wo1999/43838和美国专利no.6,072,050)、核心35scamv启动子等。其它的组成型启动子包括例如以下专利中公开的那些：美国专利no.5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611，所述专利以引用方式并入本文。[0197]上面关于启动子的列表并不意指是限制性的。任何适当的启动子都可用于所述实施方案。[0198]一般来讲，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如那些编码新霉素磷酸转移酶ii(neo)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4‑二氯苯氧基乙酸(2，4‑d)。合适的选择性标记基因的另外示例包括但不限于：编码对氯霉素的抗性的基因(herreraestrella等人，(1983)emboj.2：987‑992)；甲氨蝶呤(herreraestrella等人，(1983)nature303：209‑213和meijer等人，(1991)plantmol.biol.16：807‑820)；链霉素(jones等人，(1987)mol.gen.genet.210：86‑ꢀ91)；壮观霉素(bretagne‑sagnard等人，(1996)transgenicres.5：131‑ꢀ137)；博来霉素(hille等人，(1990)plantmol.biol.7：171‑176)；磺酰胺(guerineau等人(1990)plantmol.biol.15：127‑136)；溴苯腈(stalker等人，(1988)science242：419‑423)；草甘膦(shaw等人，(1986)science233：478‑481和美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(deblock等人，(1987)emboj.6：2513‑2518)。主要参见：yarranton(1992)curr.opin.biotech.3：506‑511；christopherson等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：6314‑6318；yao等人，(1992)cell71：63‑72；reznikoff，(1992)mol.microbiol.6：2419‑2422；barkley等人，(1980)载于theoperon，第177‑220页；hu等人，(1987)cell48：555‑566；brown等人，(1987)cell49：603‑612；figge等人，(1988)cell52：713‑722；deuschle等人，(1989)proc.natl.acadsci.usa86：5400‑5404；fuerst等人，(1989)proc.natl.acad.sci.usa86：2549‑2553；deuschle等人，(1990)science248：480‑483；gossen，(1993)德国海德尔堡大学(universityofheidelberg)博士论文；reines等人，(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：1917‑1921；labow等人，(1990)mol.cell.biol.10：3343‑3356；zambretti等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：3952‑3956；baim等人，(1991)proc.natl.acad.sci.usa88：5072‑5076；wyborski等人，(1991)nucleicacidsres.19：4647‑4653；hillenand‑wissman，(1989)topicsmol.struc.biol.10：143‑162；degenkolb等人，(1991)antimicrob.agentschemother.35：1591‑1595；kleinschnidt等人，(1988)biochemistry27：1094‑1104；bonin，(1993)德国海德尔堡大学(universityofheidelberg)博士论文；gossen等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：5547‑5551；oliva等人，(1992)antimicrob.agentschemother.36：913‑919；hlavka等人，(1985)handbookofexperimentalpharmacology，第78卷(springer‑verlag，berlin)以及gill等人，(1988)nature334：721‑ꢀ724。这些公开内容以引用的方式并入本文。[0199]以上选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因都可用于本发明实施方案。[0200]植物转化[0201]本发明实施方案的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物中。如本文所用，“引入”意指将多核苷酸或多肽提供给植物，使得该序列能够进入植物细胞的内部。本发明实施方案的方法不依赖于将多核苷酸或多肽引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽可进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。[0202]如本文所用，“稳定转化”意指被引入植物中的核苷酸构建体整合进植物的基因组中，并能够被其后代继承。如本文所用，“瞬时转化”意指将多核苷酸引入植物中但它没有整合进植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。如本文所用，“植物”是指整株植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可为分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。[0203]转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可以根据转化所指向的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)变动。将核苷酸序列引入植物细胞中并随后插入植物基因组中的合适方法，包括微注射(crossway等人，(1986)biotechniques4：320‑334)、电穿孔(riggs等人，(1986)proc.natl.acad.sci.usa83：5602‑5606)、农杆菌介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(paszkowski等人，(1984)emboj.3：2717‑2722)以及弹道粒子加速法(参见例如美国专利no.4,945,050；5,879,918；5,886,244和5,932,782；tomes等人，(1995)，载于plantcell，tissue，andorganculture：fundamentalmethods，gamborg和phillips编辑(springer‑verlag，berlin)以及mccabe等人，(1988)biotechnology6：923‑926)和lecl转化(wo00/28058)。关于马铃薯转化，参见tu等人(1998)plantmolecularbiology37：829‑838和chong等人(2000)transgenicresearch9：71‑78。另外的转化程序可见于weissinger等人，(1988)ann.rev.genet.22：421‑477；sanford等人，(1987)particulatescienceandtechnology5：27‑37(洋葱)；christou等人，(1988)plantphysiol.87：671‑674(大豆)；mccabe等人，(1988)bio/technology6：923‑ꢀ926(大豆)；finer和mcmullen，(1991)invitrocelldev.biol.27p：175‑182(大豆)；singh等人，(1998)theor.appl.genet.96：319‑324(大豆)；datta等人，(1990)biotechnology8：736‑740(水稻)；klein等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：4305‑4309(玉蜀黍)；klein等人，(1988)biotechnology6：559‑563(玉蜀黍)；美国专利5,240,855；5,322,783和5,324,646；klein等人，(1988)plantphysiol.91：440‑444(玉蜀黍)；fromm等人，(1990)biotechnology8：833‑839(玉蜀黍)；hooykaas‑vanslogteren等人，(1984)nature(london)311：763‑764；美国专利5,736,369(谷类)；bytebier等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84：5345‑5349(百合科)；dewet等人，(1985)载于theexperimentalmanipulationofovuletissues，chapman等人编辑，(longman，newyork)，第197‑209页(花粉)；kaeppler等人(1990)plantcellreports9：415‑418和kaeppler等人(1992)theor.appl.genet.84：560‑566(晶须介导的转化)；d′halluin等人，(1992)plantcell4：1495‑1505(电穿孔)；li等人，(1993)plantcellreports12：250‑255和christou和ford(1995)annalsofbotany75：407‑413(水稻)；osjoda等人，(1996)naturebiotechnology14：745‑750(玉蜀黍，经由根瘤农杆菌)；将所有这些文献和专利以引用方式并入本文。[0204]在具体的实施方案中，所述实施方案的序列可用多种瞬时转化方法提供给植物。这种瞬时转化方法包括但不限于直接向植物中引入ptip‑96多核苷酸或其变体和片段，或者向植物中引入ptip‑96多肽转录物。这类方法包括(例如)显微注射法或粒子轰击法。参见例如crossway等人，(1986)molgen.genet.202：179‑185；nomura等人，(1986)plantsci.44：53‑58；hepler等人，(1994)proc.natl.acad.sci.91：2176‑2180以及hush等人，(1994)thejournalofcellscience107：775‑784，所有这些文献都以引用方式并入本文。另选地，可使用本领域已知的技术将ptip‑96多肽多核苷酸瞬时转化到植物中。此类技术包括利用病毒载体系统，和将多核苷酸以避免dna随后释放的方式沉淀。因此，从粒子结合的dna可发生转录，但其释放出来而整合进基因组中的频率则大大降低。此类方法包括使用包被有聚乙基亚胺(pei；sigma#p3143)的粒子。[0205]用于在植物基因组中特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，在期望的基因组位置处插入多核苷酸是使用位点特异性重组系统实现的。参见，例如，wo1999/25821、wo1999/25854、wo1999/25840、wo1999/25855和wo1999/25853，上述专利以引用的方式并入本文。简而言之，可将本发明实施方案的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒旁侧是两个不相同的重组位点。将转移盒引入植物中，该植物基因组中稳定掺入有靶位点，其中所述靶位点旁侧是两个与该转移盒的所述位点相对应的不相同重组位点。提供适当的重组酶，将转移盒整合在该靶位点处。目的多核苷酸因此被整合在植物基因组中的特定染色体位置处。[0206]植物转化载体可由实现植物转化所需的一个或多个dna载体构成。例如，本领域通常的做法是采用由不止一个连续dna区段构成的植物转化载体。这些载体在本领域中常常称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的dna区段的大小和复杂性是相当大的，并且将功能分摊到单独的dna分子上是有利的。二元载体通常包含质粒载体，该质粒载体含有t‑dna转移所必需的顺式作用序列(诸如左边界和右边界)，经工程改造能够在植物细胞中表达的选择性标记，以及“目的基因”(经工程改造能够在期望产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。还存在于这种质粒载体上的是细菌复制所需的序列。顺式作用序列以允许有效转移入植物细胞中并在其中表达的方式排列。例如，选择性标记基因和杀虫基因位于左边界和右边界之间。通常第二质粒载体包含介导t‑dna从农杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。按照本领域中所理解的，该质粒通常包含允许植物细胞被农杆菌感染并通过在边界序列处的切割以及vir介导的dna转移来转移dna的毒力功能(vir基因)(hellens和mullineaux，(2000)trendsinplantscience5：446‑ꢀ451)。几类农杆菌属菌株(例如lba4404、gv3101、eha101、eha105等)可用于植物转化。该第二质粒载体不是通过诸如微喷射、微注射、电穿孔、聚乙二醇等等的其它方法转化植物所必需的。[0207]一般来讲，植物转化方法涉及将异源dna转移到靶植物细胞(例如，不成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等等)中，随后应用最大阈值水平的合适选择物(取决于选择性标记基因)来从未转化细胞团块群中回收转化的植物细胞。在将异源外来dna整合进植物细胞中后，然后在培养基中应用最大阈值水平的合适选择物以杀死未转化的细胞，并通过定期转移至新鲜培养基来分离和增殖从该选择处理中存活的据推测已转化的细胞。通过连续传代和使用合适的选择物进行攻击，可鉴定和增殖用所述质粒载体转化的细胞。然后，分子和生物化学方法可用于证实整合到转基因植物的基因组中的目的异源基因的存在。[0208]通常将外植体转移至新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。随后，在放置于补充了最大阈值水平的选择剂的再生培养基上后，已转化的细胞被分化成苗。然后将所述苗转移到选择性生根培养基中，以恢复成生根的苗或小植株。然后将转基因小植株生长成成熟的植株并产生可育种子(例如，hiei等人，(1994)theplantjournal6：271‑282；ishida等人，(1996)naturebiotechnology14：745‑750)。通常将外植体转移至新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。产生转基因植物的技术和方法的一般描述可见于ayres和park，(1994)criticalreviewsinplantscience13：219‑239以及bommineni和jauhar，(1997)maydica42：107‑120。由于被转化的材料包含许多细胞；在任何一片受试目标愈伤组织或组织或细胞群中都存在转化的和未转化的细胞两者。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖的能力产生了经转化的植物培养物。通常，移除未转化细胞的能力是对快速恢复经转化的植物细胞并成功产生转基因植物的限制。[0209]可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如mccormick等人，(1986)plantcellreports5：81‑84。然后可栽培这些植株并用同一转化株系或不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型或者诱导型表达的所得杂交种。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。[0210]本发明实施方案的核苷酸序列可通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而提供给植物。通常，这种方法涉及将目的核苷酸构建体掺入于病毒dna或rna分子内。应当认识到，实施方案的重组蛋白可最初作为病毒聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需ptip‑ꢀ96多肽。还应当认识到，这种包含实施方案的ptip‑96的氨基酸序列的至少一部分的病毒聚蛋白可具有所需的杀虫活性。这种病毒聚蛋白及其编码核苷酸序列为本发明实施方案所涵盖。给植物提供核苷酸构建体并在植物中产生所编码的蛋白质的方法(涉及病毒dna或rna分子)是本领域已知的。参见例如以下各号美国专利：5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367和5,316,931；这些专利以引用方式并入本文。[0211]转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如svab等人，(1990)proc.natl.acad.sci.usa87：8526‑8530；svab和maliga，(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：913‑917；svab和maliga，(1993)emboj.12：601‑606。该方法依赖于粒子枪输送含选择性标记的dna以及通过同源重组将dna靶向质体基因组。此外，质体转化可以通过细胞核编码和质体引导的rna聚合酶的组织偏好表达来反式激活沉默的质体携带的转基因而完成。此类系统已经在mcbride等人，(1994)proc.natl.acad.sci.usa91：7301‑7305)中报道。[0212]所述实施方案还涉及所述实施方案的转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶、以及根和苗的插条。[0213]本发明实施方案可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶(zoysiaspp.)；美洲雀稗(paspalumnotatum)；地毯草(axonopusaffinis)；百足草(eremochloaophiuroides)；狼尾草(pennisetumclandesinum)；海滨雀稗(paspalumvaginatum)；蓝格兰马草(boutelouagracilis)；野牛草(buchloedactyloids)；垂穗草(boutelouacurtipendula)。[0216]所关注的植物包括谷物植物(提供所关注的种子)、油籽植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦、粟等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。[0217]植物转化的评估[0218]在将异源外来dna引入植物细胞中以后，异源基因在植物基因组中的转化或整合通过各种方法如与整合基因有关的核酸、蛋白质和代谢物的分析来证实。[0219]pcr分析是移种到土壤之前筛选早期转化细胞、组织或苗中掺入基因存在的快速方法(sambrookandrussell，(2001)molecularcloning：alaboratorymanual.coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny(sambrook和russell，2001年，《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港))。使用对目的基因或农杆菌属载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行pcr。[0220]植物转化可以通过基因组dna的dna印迹分析来确定(sambrook和russell，(2001)(出处同上))。一般而言，从转化体提取总dna，用适当的限制性酶消化，在琼脂糖凝胶中进行分级分离并且转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜。然后根据标准技术(sambrook和russell，(2001)(出处同上))，可以用例如放射性标记的32p靶dna片段探测所述膜或“印迹”，以证实被引入的基因在植物基因组中的整合。[0221]在rna印迹分析中，根据本领域常规使用的标准程序(sambrook和russell，(2001)(出处同上))，从转化体的特定组织分离rna，所述rna在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级分离，并且印迹到尼龙滤膜上。然后通过本领域内已知的方法(sambrook和russell，(2001)(出处同上))，使所述滤膜与源自杀虫基因的放射性探针杂交，来检测由杀虫基因编码的rna的表达。[0222]根据标准程序(sambrook和russell，(2001)(出处同上))，使用与存在于ptip‑96多肽上的一个或多个表位结合的抗体，可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生化分析等，以证实由杀虫基因编码的蛋白质的存在。[0223]转基因植物中性状的堆叠[0224]转基因植物可包含本文所公开的一个或多个杀昆虫多核苷酸与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，从而导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列的堆叠的转基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括但不限于培育各自包含目的多核苷酸的单独品系，用后续基因转化包含本文所公开的基因的转基因植物，以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本文所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状(即，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性示例中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。本文所用的性状是指衍生自特定序列或序列群组的表型。可使用包含多个基因的单个转化载体或单独地携带于多个载体上的基因进行基因的共转化。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则目的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化方案将性状与目的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况下，可期望引入会抑制目的多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其它抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到，可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，wo1999/25821、wo1999/25854、wo1999/25840、wo1999/25855和wo1999/25853，上述专利以引用的方式并入本文。[0225]在一些实施方案中，编码单独的或与一种或多种另外的昆虫抗性性状堆叠的本文所公开的ptip‑96多肽的多核苷酸，可与一种或多种另外的投入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度等等)或产出性状(例如，增加的产量、改性淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增强的消化性、改善的纤维质量、抗旱性等等)堆叠。因此，该多核苷酸实施方案可用于提供具有灵活地且成本有效地防治许多农业害虫的能力的改善的作物质量的完整农学方案。[0226]可用于堆叠的转基因包括但不限于：[0227]1.赋予对昆虫或病害的抗性并编码以下各方面的转基因：[0228](a)植物抗病基因。植物防御往往由该植物中抗病基因(r)的产物与病原体中相应的无毒性(avr)基因的产物之间的特异性相互作用活化。可用克隆的抗性基因转化植物品种，以工程构建出对特定的病原体株系有抗性的植物。参见例如jones等人，(1994)science266：789(抵抗番茄叶霉菌(cladosporiumfulvum)的番茄cf‑9基因的克隆)；martin等人，(1993)science262：1432(抵抗丁香假单胞菌番茄致病变种(pseudomonassyringaepv.tomato)的番茄pto基因编码蛋白激酶)；mindrinos等人，(1994)cell78：1089(抵抗丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)的拟南芥rsp2基因)、mcdowell和woffenden,(2003)trendsbiotechnol.21(4)：178‑83以及toyoda等人，(2002)transgenicres.11(6)：567‑82。抗病植物是与野生型植物相比更能抵抗病原体的植物。[0229](b)编码苏云金芽孢杆菌蛋白、其衍生物或模拟其的合成多肽的基因。参见例如geiser等人，(1986)gene48：109，其公开了btδ‑内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ‑内毒素基因的dna分子可购自马里兰州罗克维尔市(rockville，md.)的美国模式培养物保藏所，例如atcc登录号40098、67136、31995和31998。经遗传工程改造的苏云金芽孢杆菌转基因的其它非限制性示例在以下专利和专利申请中给出，并出于此目的据此以引用方式并入：美国专利5，188,960；5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013，6,060,594，6,063,597，6,077,824，6,620,988，6,642,030，6,713,259，6,893,826，7,105,332；7,179,965，7,208,474；7,227,056，7,288,643，7,323,556，7,329,736，7,449,552，7,468,278，7,510,878，7,521,235，7,544,862，7,605,304，7,696,412，7,629,504，7,705,216，7,772,465，7,790,846，7,858,849以及wo1991/14778；wo1999/31248；wo2001/12731；wo1999/24581和wo1997/40162。[0230]也可堆叠编码杀虫蛋白的基因，包括但不限于：来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白，诸如pseen3174(monalysin，(2011)plospathogens，7：1‑ꢀ13)；来自生防假单胞菌(pseudomonasprotegens)菌株cha0和pf‑5(之前的荧光假单胞菌)的杀昆虫蛋白(pechy‑tarr，(2008)environmentalmicrobiology10：2368‑2386：genbank登录号eu400157)；来自台湾假单胞菌(pseudomonastaiwanensis)的杀昆虫蛋白(liu等人，(2010)j.agric.foodchem.58：12343‑12349)以及来自类产碱假单胞菌的杀昆虫蛋白(zhang等人，(2009)annalsofmicrobiology59：45‑50以及li等人，(2007)plantcelltiss.organcult.89：159‑168)；来自发光杆菌属物种(photorhabdussp.)和致病杆菌属物种(xenorhabdussp.)的杀昆虫蛋白(hinchliffe等人，(2010)theopentoxinologyjournal3：101‑118以及morgan等人，(2001)appliedandenvir.micro.67：2062‑2069)、美国专利no.6,048,838和美国专利no.6,379,946；美国专利公布us20140007292的pip‑1多肽；美国专利公布us20140033361的afip‑1a和/或afip‑1b多肽；美国专利序列号13/839702的phi‑4多肽；pct序列号pct/us14/51063的pip‑47多肽、pct序列号pct/us14/55128的pip‑72多肽、以及δ‑内毒素，包括但不限于δ‑内毒素基因中的cry1、cry2，cry3，cry4，cry5，cry6，cry7，cry8，cry9，cry10，cry11，cry12，cry13，cry14，cry15，cry16，cry17，cry18，cry19，cry20，cry21，cry22，cry23，cry24，cry25，cry26，cry27，cry28，cry29，cry30，cry31，cry32，cry33，cry34，cry35，cry36，cry37，cry38，cry39，cry40，cry41，cry42，cry43，cry44，cry45，cry46，cry47，cry49，cry50，cry51，cry52，cry53，cry54，cry55，cry56，cry57，cry58，cry59，cry60，cry61，cry62，cry63，cry64，cry65，cry66，cry67，cry68，cry69，cry70，、cry71和cry72类型以及苏云金芽孢杆菌溶细胞cyt1和cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的这些类型的成员是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/(可使用“www”前缀在万维网上访问)的crickmore等人，“bacillusthuringiensistoxinnomenclature”ꢀ(2011))。[0231]δ‑内毒素的示例还包括但不限于美国专利no.5,880,275和7,858,849的cry1a蛋白；美国专利no.8,304,604和8.304,605的dig‑3或dig‑11毒素(cry蛋白诸如cry1a的α‑螺旋1和/或α‑螺旋2变体的n末端缺失)；美国专利申请序列号10/525,318的cry1b；美国专利no.6,033,874的cry1c；美国专利no.5,188,960，6,218,188的crylf；美国专利no.7,070,982、6,962,705和6,713,063的cry1a/f嵌合体)；cry2蛋白，比如美国专利no.7,064,249的cry2ab蛋白)；cry3a蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同cry蛋白的可变区和保守区块的独特组合而形成的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(ehip)(美国专利申请公布no.2010/0017914)；cry4蛋白；cry5蛋白；cry6蛋白；美国专利no.7,329,736，7,449,552，7,803,943，7,476,781，7,105,332，7,378,499and7,462,760的cry8蛋白；cry9蛋白，比如cry9a、cry9b、cry9c、cry9d、cry9e和cry9f家族的成员；naimov等人，(2008)appliedandenvironmentalmicrobiology74：7145‑ꢀ7151的cry15蛋白；美国专利no.6,127,180，6,624,145and6,340,593的cry22、cry34ab1蛋白；美国专利no.6,248,535，6,326,351，6,399,330，6,949,626，7,385,107and7,504,229的cryet33和cryet34蛋白；美国专利公布no.2006/0191034、2012/0278954和pct公布no.wo2012/139004的cryet33和cryet34同源物；美国专利no.6,083,499，6,548,291and6,340,593的cry35abl蛋白；cry46蛋白、cry51蛋白、cry二元毒素；tic901或相关毒素；us2008/0295207的tic807；pctus2006/033867的et29、et37、tic809、tic810、tic812、tic127、tic128；美国专利no.8,236,757的axmi‑027、axmi‑036和axmi‑038；us7,923,602的axmi‑ꢀ031、axmi‑039、axmi‑040、axmi‑049；wo2006/083891的axmi‑ꢀ018、axmi‑020和axmi‑021；wo2005/038032的axmi‑010；wo2005/021585的axmi‑003；us2004/0250311的axmi‑008；us2004/0216186的axmi‑006；us2004/0210965的axmi‑007；us2004/0210964的axmi‑009；us2004/0197917的axmi‑014；us2004/0197916的axmi‑004；wo2006/119457的axmi‑028和axmi‑ꢀ029；wo2004/074462的axmi‑007、axmi‑008、axmi‑0080rf2、axmi‑ꢀ009、axmi‑014和axmi‑004；美国专利no.8,084,416的axmi‑150；us20110023184的axmi‑205；us2011/0263488的axmi‑011、axmi‑ꢀ012、axmi‑013、axmi‑015、axmi‑019、axmi‑044、axmi‑037、axmi‑043、axmi‑033、axmi‑034、axmi‑022、axmi‑023、axmi‑ꢀ041、axmi‑063和axmi‑064；us2010/0197592的axmi‑r1和相关蛋白；wo2011/103248的axmi221z、axmi222z、axmi223z、axmi224z和axmi225z；wo11/103247的axmi218、axmi219、axmi220、axmi226、axmi227、axmi228、axmi229、axmi230和axmi231；美国专利no.8,334,431的axmi‑115、axmi‑113、axmi‑005、axmi‑163和axmi‑184；us2010/0298211的axmi‑001、axmi‑002、axmi‑030、axmi‑035和axmi‑045；us20090144852的axmi‑066和axmi‑076；美国专利no.8,318,900的axmi128、axmi130、axmi131、axmi133、axmi140、axmi141、axmi142、axmi143、axmi144、axmi146、axmi148、axmi149、axmi152、axmi153、axmi154、axmi155、axmi156、axmi157、axmi158、axmi162、axmi165、axmi166、axmi167、axmi168、axmi169、axmi170、axmi171、axmi172、axmi173、axmi174、axmi175、axmi176、axmi177、axmi178、axmi179、axmi180、axmi181、axmi182、axmi185、axmi186、axmi187、axmi188、axmi189；us2010/0005543的axmi079、axmi080、axmi081、axmi082、axmi091、axmi092、axmi096、axmi097、axmi098、axmi099、axmi100、axmi101、axmi102、axmi103、axmi104、axmi107、axmi108、axmi109、axmi110、axmi111、axmi112、axmi114、axmi116、axmi117、axmi118、axmi119、axmi120、axmi121、axmi122、axmi123、axmi124、axmi1257、axmi1268、axmi127、axmi129、axmi164、axmi151、axmi161、axmi183、axmi132、axmi138、axmi137；和美国专利no.8,319,019的cry蛋白，比如具有经修饰的蛋白水解位点的cry1a和cry3a；以及美国专利申请公布no.2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株vbts2528的cry1ac、cry2aa和crylca毒素蛋白。其它cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/(可使用“www”前缀在万维网上访问)的crickmore等人，“bacillusthuringiensistoxinnomenclature”(2011))。cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(有关综述，参见vanfrannkenhuyzen，(2009)j.invert.path.101：1‑16)。cry蛋白作为转基因植物性状的用途是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于cry1ac、cry1ac+cry2ab、cry1ab、cry1a.105、cry1f、crylfa2、crylf+crylac、cry2ab、cry3a、mcry3a、cry3bb1、cry34ab1、cry35ab1、vip3a、mcry3a、cry9c和cbi‑bt的cry转基因植物已取得监管批准(参见，sanahuja，(2011)plantbiotechjournal9：283‑300和cera‑gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database(可使用“www”前缀在万维网上访问)的cera(2010)gmcropdatabasecenterforenvironmentalriskassessment(cera)，ilsiresearchfoundation，washingtond.c.(cera(2010)转基因作物数据库，环境风险评估中心(cera)，国际生命科学学院研究基金，华盛顿特区))。本领域的技术人员熟知的多于一种杀虫蛋白也可在植物中表达，例如vip3ab&cry1fa(us2012/0317682)、cry1be&cry1fmolec.biol.21：673，其提供了欧芹ubi4‑2多聚泛素基因的核苷酸序列，以及美国专利no.6,563,020；7,145,060和7,087,810。[0236](g)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见botella等人，(1994)plantmolec.biol.24：757，其公开了绿豆钙调蛋白cdna克隆的核苷酸序列，以及griess等人，(1994)plantphysiol.104：1467，其提供了玉蜀黍钙调蛋白cdna克隆的核苷酸序列。[0237](h)编码疏水力矩肽的多核苷酸。参见pct申请wo1995/16776和美国专利no.5,580,852(公开了鲎抗菌肽的肽衍生物，其抑制真菌植物病原体)，以及pct申请wo1995/18855和美国专利no.5,607,914(教导了合成的抗微生物肽，其赋予抗病性)。[0238](i)编码膜透性酶、通道离子载体或通道阻断剂的多核苷酸。例如参见，jaynes等人，(1993)plantsci.89：43公开的杀菌肽‑β溶胞肽类似物的异源表达以使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearum)有抗性。[0239](j)编码病毒侵入性蛋白或从中衍生的复合毒素的基因。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累，可赋予对该外壳蛋白基因衍生的病毒以及相关病毒所造成的病毒感染和/或病害发展的抗性。参见beachy等人，(1990)ann.rev.phytopathol.28：451。外壳蛋白介导的抗性已被赋予转化植物以抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条斑病毒、马铃薯x病毒、马铃薯y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒(同上)。[0240](k)编码昆虫特异性抗体或从中衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中的关键代谢功能的抗体将会灭活受影响的酶，从而杀死昆虫。cf.taylor等人，第497号摘要，seventhint′lsymposiumonmolecularplant‑microbeinteractions(edinburgh，scotland，1994)(通过产生单链抗体片段对转基因烟草进行酶促灭活)。[0241](l)编码病毒特异性抗体的基因。参见例如，tavladoraki等人，(1993)nature366：469，其显示表达重组抗体基因的转基因植物免于病毒攻击。[0242](m)编码在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内切α‑1,4‑d‑聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同型‑α‑1,4‑d‑半乳糖醛酸酶而有利于真菌定植和植物营养物释放。see，lamb等人，(1992)bio/technology10：1436。toubart等人，(1992)plantj.2：367描述了编码菜豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。[0243](n)编码在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白的多核苷酸。例如，logemann等人，(1992)bio/technology10：305已表明表达大麦核糖体灭活基因的转基因植物对真菌病害的抗性提高。[0244](o)参与系统获得性抗性(sar)响应的基因和/或病程相关基因。briggs，(1995)currentbiology5(2)，pieterse和vanloon，(2004)curr.opin.plantbio.7(4)：456‑64以及somssich，(2003)cell113(7)：815‑6。[0245](p)抗真菌基因(cornelissen和melchers，(1993)pl.physiol.101：709‑ꢀ712和parijs等人，(1991)planta183：258‑264以及bushnell等人，(1998)can.j.ofplantpath.20(2)：137‑149。还可参见美国专利申请序列号09/950,933、11/619,645、11/657,710、11/748,994、11/774,121以及美国专利6,891,085和no.7,306,946。用于作为抵抗真菌病原体的植物防御反应的第一步而感知几丁质片段的lysm受体样激酶(us2012/0110696)。[0246](q)解毒基因，比如伏马菌素、白僵菌素、串珠镰刀菌素和玉米赤霉烯酮以及它们的结构相关衍生物的解毒基因。例如，参见美国专利no.5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380。[0247](r)编码胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见美国专利no.7,205,453。[0248](s)防御素基因。参见wo2003/000863以及美国专利no.6,911,577；6,855,865；6,777,592和7,238,781。[0249](t)赋予对线虫的抗性的基因。参见例如pct申请wo1996/30517；pct申请wo1993/19181、wo2003/033651以及urwin等人，(1998)planta204：472‑479，williamson，(1999)curropinplantbio.2(4)：327‑31；美国专利no.6,284,948和7,301,069及mir164基因(wo2012/058266)。[0250](u)赋予对疫霉根腐病的抗性的基因，诸如rps1、rps1‑a、rps1‑ꢀb、rps1‑c、rps1‑d、rps1‑e、rps1‑k、rps2、rps3‑a、rps3‑ꢀb、rps3‑c、rps4、rps5、rps6、rps7和其它rps基因。参见例如，shoemaker，etal.，phytophthorarootrotresistancegenemappinginsoybean，plantgenomeivconference，sandiego，calif.(1995)(shoemaker等人，大豆中的疫霉根腐病抗性基因作图，第四届植物基因组大会，加利福尼亚州圣地亚哥，1995年)。[0251](v)赋予对褐茎腐病的抗性的基因，比如美国专利no.5,689,035中所述，该专利出于此目的以引用方式并入。[0252](w)赋予对炭疽菌(colletotrichum)的抗性的基因，诸如美国专利申请公布us2009/0035765中所述，该专利出于此目的以引用方式并入。这包括可用作单基因座转换的rcg基因座。[0253]2.赋予对除草剂的抗性的转基因，例如以下除草剂：[0254](a)编码对抑制生长点或分生组织的除草剂比如咪唑啉酮或磺酰脲的抗性的多核苷酸。这个类别的示例性基因编码突变的als酶和ahas酶，例如分别如lee等人，(1988)emboj.7：1241和miki等人，(1990)theor.appl.genet.80：449所述。另参见美国专利no.5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824；美国专利申请序列号11/683,737以及国际专利公布wo1996/33270。[0255](b)编码对如下物质具有抗性的蛋白的多核苷酸：草甘膦(抗性分别由突变的5‑烯醇式丙酮酰‑3‑磷酸莽草酸合酶(epsp)基因和aroa基因赋予)和其它膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(pat)基因和吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)草丁膦乙酰转移酶(bar)基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸(proprionicacid)和环己酮(cyclohexone)(acc酶抑制剂编码基因)。参见例如shah等人的美国专利no.4,940,835，其公开了epsps形式的能赋予草甘膦抗性的核苷酸序列。授予barry等人的美国专利no.5,627,061也描述了编码epsps酶的基因。另参见美国专利no.6,566,587；6,338,961；6,248,876；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；5,094,945，4,940,835；5,866,775；6,225,114；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；re.36,449；re37,287e和5,491,288，以及国际专利公布ep1173580；wo2001/66704；ep1173581和ep1173582，这些专利出于此目的以引用方式并入本文。草甘膦抗性也被赋予给能表达编码草甘膦氧化还原酶的基因的植物，如美国专利no.5,776,760和5,463,175中更完全地描述，这些专利出于此目的以引用方式并入本文。另外，可以通过过表达编码草甘膦n‑乙酰转移酶的基因向植物赋予草甘膦抗性。参见例如以下各号美国专利：7,462,481；7,405,074和美国专利申请公布no.us2008/0234130。编码突变的aroa基因的dna分子可以以登录号39256获得，该突变基因的核苷酸序列在授予comai的美国专利4,769,061中公开。授予kumada等人的ep申请no.0333033和授予goodman等人的美国专利no.4,975,374公开了赋予对除草剂(比如l‑草丁膦)的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。草丁膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列在授予leemans等人的ep申请no.0242246和0242236；degreef等人，(1989)bio/technology7：61中提供，其描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。另参见美国专利no.5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616以及5,879,903，这些专利出于此目的以引用方式并入本文。赋予对苯氧基丙酸和环己酮(诸如烯禾啶和氟吡甲禾灵)的抗性的示例性基因是marshall等人，(1992)theor.appl.genet.83：435。[0256](c)编码对抑制光合作用的除草剂具有抗性的蛋白的多核苷酸，所述除草剂为诸如三嗪(psba和gs+基因)和苯甲腈(腈水解酶基因)。przibilla等人，(1991)plantcell3：169描述了用编码突变的psba基因的质粒转化衣藻(chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列在授予stalker的美国专利4,810,648中公开，含有这些基因的dna分子可以以登录号53435、67441和67442获得。hayes等人，(1992)biochem.j.285：173描述了编码谷胱甘肽s‑转移酶的dna的克隆和表达。[0257](d)编码对乙酰羟酸合酶具有抗性的蛋白的多核苷酸，该乙酰羟酸合酶已被发现能使表达这种酶的植物抵抗多种类型的除草剂，其已被引入到多种植物中(参见例如hattori等人，(1995)molgengenet.246：419)。赋予除草剂抗性的其它基因包括：编码大鼠细胞色素p4507a1和酵母nadph‑细胞色素p450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(shiota等人，(1994)plantphysiol106：17)，编码谷胱甘肽还原酶和过氧化物歧化酶的基因(aono等人，(1995)plantcellphysiol36：1687)，以及编码各种磷酸转移酶的基因(datta等人，(1992)plantmolbiol20：619)。[0258](e)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多核苷酸，原卟啉原氧化酶是产生叶绿素所需的。protox酶充当多种除草化合物的靶标。这些除草剂还抑制所存在的所有不同植物物种的生长，造成它们全部毁灭。能抵抗这些除草剂的含有改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的开发在美国专利6,288,306；6,282,837和5,767,373以及国际公开wo2001/12825中有所描述。[0259](f)aad‑1基因(最初来自鞘脂单胞菌(sphingobiumherbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aad‑1)蛋白。该性状赋予对2，4‑二氯苯氧基乙酸和芳氧苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂诸如喹禾灵)除草剂的耐受性。在植物中实现除草剂耐受性的aad‑1基因自身首次公开于wo2005/107437(还可参见us2009/0093366)。aad‑12基因，源自代尔夫特食酸菌(delftiaacidovorans)，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aad‑12)蛋白，通过使若干具有芳氧基链烷酸酯部分的除草剂(包括苯氧基生长素(例如，2，4‑d、mcpa)以及吡啶氧基生长素(例如，氟草烟、绿草定))失活而赋予对2，4‑二氯苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。[0260](g)编码美国专利申请公布2003/0135879中公开的用于赋予麦草畏耐受性的除草剂抗性麦草畏单加氧酶的多核苷酸；[0261](h)编码美国专利no.4,810,648中公开的用于赋予溴苯腈耐受性的溴苯腈腈水解酶(bxn)的多核苷酸分子；[0262](i)编码misawa等人，(1993)plantj.4：833‑840和isawa等人，(1994)plantj.6：481‑489中所述的用于实现哒草伏耐受性的八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子。[0263]3.赋予或促成谷物特性改变的转基因[0264]所述特性例如：[0265](a)脂肪酸改变，例如，通过以下方式改变：[0266](1)减量调节硬脂酰‑acp以提高植物的硬脂酸含量。参见knultzon等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：2624和wo1999/64579(改变玉米中脂质分布的基因)；[0267](2)通过fad‑2基因修饰使油酸升高和/或通过fad‑3基因修饰使亚麻酸减少(参见美国专利no.6,063,947；6,323,392；6,372,965和wo1993/11245)。[0268](3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，参见wo2001/12800。[0269](4)改变lec1、agp、dek1、superall、milps、各种ipa基因(如ipal、ipa3、hpt或hggt)。例如，参见wo2002/42424、wo1998/22604、wo2003/011015、wo2002/057439、wo2003/011015、美国专利no.6,423,886，6,197,561，6,825,397以及美国专利申请公布no.us2003/0079247、us2003/0204870以及rivera‑madrid等人，(1995)proc.natl.acad.sci.92：5620‑5624。[0270](5)编码如下的基因：产生长链多不饱和脂肪酸的8‑8去饱和酶(美国专利no.8,058,571和8,338,152)、降低饱和脂肪的δ‑9去饱和酶(美国专利no.8,063,269)、改善ω‑3脂肪酸分布的报春花δ6去饱和酶。[0271](6)与脂质和糖代谢调控相关的分离的核酸和蛋白质，具体地讲，在产生转基因植物和调节种子贮藏化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子贮藏蛋白)水平的方法中使用的以及在调节植物种子大小、种子数量、种子重量、根长和叶片大小的方法中使用的脂质代谢蛋白(lmp)(ep2404499)。[0272](7)改变高水平表达糖诱导2(hsi2)蛋白在植物中的表达以提高或降低hsi2在植物中的表达。提高hsi2的表达会增加油含量，而降低hsi2的表达会降低脱落酸敏感性和/或增强抗旱性(美国专利申请公布no.2012/0066794)。[0273](8)细胞色素b5(cb5)单独表达或与fad2一起表达以调节植物种子中的油含量，尤其是增加ω‑3脂肪酸的水平并提高ω‑6与ω‑3脂肪酸的比率(美国专利申请公布no.2011/0191904)。[0274](9)编码用于调节糖代谢的wrinkled1样多肽的核酸分子(美国专利no.8,217,223)。[0275](b)磷含量改变，例如，通过以下方式改变：[0276](1)引入植酸酶编码基因将增强肌醇六磷酸的分解，从而给转化植物增加更多的游离磷酸盐。例如，参见vanhartingsveldt等人，(1993)gene127：87，其公开了黑曲霉(aspergillusniger)植酸酶基因的核苷酸序列。[0277](2)调节降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉蜀黍中，这例如可通过以下方式来实现：将与一种或多种等位基因如lpa等位基因(在以低水平植酸为特征的玉蜀黍突变株中鉴定到)相关的dna进行克隆并再引入，如wo2005/113778所述，和/或改变肌醇激酶活性，如wo2002/059324、美国专利申请公布no.2003/0009011、wo2003/027243、美国专利申请公布no.2003/0079247、wo1999/05298、美国专利no.6,197,561、美国专利no.6,291,224、美国专利no.6,391,348、wo2002/059324、美国专利申请公布no.2003/0079247、wo1998/45448、wo1999/55882、wo2001/04147中所述。[0278](c)碳水化合物改变，例如通过改变能影响淀粉的分支模式的酶的基因来影响，或者通过改变能改变硫氧还蛋白比如ntr和/或trx(参见美国专利no.6,531,648，其出于此目的以引用方式并入)和/或γ玉米醇溶蛋白敲除或突变体诸如cs27或tusc27或en27(参见美国专利no.6,858,778以及美国专利申请公布no.2005/0160488、美国专利申请公布no.2005/0204418，这些专利出于此目的以引用方式并入)的基因来影响。参见shiroza等人，(1988)j.bacteriol.170：810(变异链球菌(streptococcusmutant)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，steinmetz等人，(1985)mol.gen.genet.200：220(枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，pen等人，(1992)bio/technology10：292(表达地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)α‑淀粉酶的转基因植物的生产)，elliot等人，(1993)plantmolec.biol.21：515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，等人，(1993)j.biol.chem.268：22480(大麦α‑淀粉酶基因的定点诱变)以及fisher等人，(1993)plantphysiol.102：1045(玉蜀黍胚乳淀粉分支酶ii)，wo1999/10498(通过修饰udp‑d‑木糖4‑表异构酶、fragile1和2、ref1、hchl、c4h改善消化性和/或淀粉提取)，美国专利no.6,232,529(通过改变淀粉水平(agp)来生产高油种子的方法)。本文提到的脂肪酸修饰基因还可用来通过淀粉途径和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。[0279](d)抗氧化物含量或组成改变，如生育酚或生育三烯醇的改变。例如，参见涉及抗氧化物水平操纵的美国专利no.6,787,683、美国专利申请公布no.2004/0034886和wo2000/68393以及通过改变尿黑酸牻牛儿基牻牛儿基转移酶(hggt)的wo2003/082899。[0280](e)必需种子氨基酸改变。例如，参见美国专利no.6,127,600(提高种子中的必需氨基酸的积累的方法)、美国专利no.6,080,913(提高种子中的必需氨基酸的积累的二元方法)、美国专利no.5,990,389(高赖氨酸)、wo1999/40209(改变种子中的氨基酸组成)、wo1999/29882(改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利no.5,850,016(改变种子中的氨基酸组成)、wo1998/20133(具有提高的水平的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利no.5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利no.5,885,801(高苏氨酸)、美国专利no.6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利no.6,459,019(赖氨酸和苏氨酸提高)、美国专利no.6,441,274(植物色氨酸合酶β亚单位)、美国专利no.6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利no.5,939,599(高硫)、美国专利no.5,912,414(甲硫氨酸提高)、wo1998/56935(植物氨基酸生物合成酶)、wo1998/45458(具有更高百分比的必需氨基酸的工程改造的种子蛋白)、wo1998/42831(赖氨酸提高)、美国专利no.5,633,436(含硫氨基酸含量提高)、美国专利no.5,559,223(具有确定的结构、含有可编程的必需氨基酸水平的合成贮藏蛋白，用来改进植物的营养价值)、wo1996/01905(苏氨酸提高)、wo1995/15392(赖氨酸提高)、美国专利申请公布no.2003/0163838、美国专利申请公布no.2003/0150014、美国专利申请公布no.2004/0068767、美国专利no.6,803,498、wo2001/79516。[0281]4.控制雄性不育的基因：[0282]有几种方法可用来赋予遗传性雄性不育，比如基因组内单独位置处的赋予雄性不育的多个突变基因，如授予brar等人的美国专利no.4,654,465和4,727,219中公开，以及染色体易位，如patterson在美国专利no.3,861,709和3,710,511中所描述。除这些方法以外，albertsen等人的美国专利no.5,432,068描述了核雄性不育的系统，其包括：鉴定对雄性能育性关键的基因；沉默这个对于雄性能育性关键的天然基因；从该必要的雄性能育性基因移除天然启动子并将其用诱导型启动子替代；将这个经遗传工程改造的基因插回植物中；从而产生雄性不育的植物，因为该诱导型启动子不“启动”而导致该雄性能育性基因不被转录。通过诱导(或“开启”)启动子，其继而允许赋予雄性能育性的基因被转录，来恢复能育性。[0283](a)在绒毡层特异性启动子的控制下和在施加化学物质n‑ac‑ppt的情况下引入脱乙酰酶基因(wo2001/29237)。[0284](b)引入各种雄蕊特异性启动子(wo1992/13956、wo1992/13957)。[0285](c)引入芽孢杆菌rna酶(barnase)和芽孢杆菌rna酶抑制剂(barstar)基因(paul等人，(1992)plantmol.biol.19：611‑622)。[0286]核雄性和雌性不育系统以及基因的另外的示例，另参见美国专利no.5,859,341；6,297,426；5,478,369；5,824,524；5,850,014和no.6,265,640，所有这些专利据此以引用方式并入。[0287]5.产生用于位点特异性dna整合的位点的基因。[0288]这包括引入可用于flp/frt系统中的frt位点和/或可用于cre/loxp系统中的lox位点。例如，参见lyznik等人，(2003)plantcellrep21：925‑ꢀ932和wo1999/25821，所述文献据此以引用方式并入。其它可使用的系统包括噬菌体mu的gin重组酶(maeser等人，1991年；vickichandler，themaizehandbookch.118(springer‑verlag1994)(vickichandler，《玉蜀黍手册》，第118章，(斯普林格出版社，1994年))、大肠杆菌的pin重组酶(enomoto等人，1983年)以及psri质粒的r/rs系统(araki等人，1992年)。[0289]6.影响非生物胁迫抗性的基因[0290]包括但不限于开花、穗和种子发育、氮利用率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性和抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。[0291](a)例如，参见：wo2000/73475，其中通过改变苹果酸盐而改变水利用率；美国专利no.5,892,009，5,965,705，5,929,305，5,891,859，6,417,428，6,664,446，6,706,866，6,717,034，6,801,104、wo2000/060089、wo200i/026459、wo2001/035725、wo2001/034726、wo2001/035727、wo2001/036444、wo2001/036597、wo2001/036598、wo2002/015675、wo2002/017430、wo2002/077185、wo2002/079403、wo2003/013227、wo2003/013228、wo2003/014327、wo2004/031349、wo2004/076638、wo199809521。[0292](b)wo199938977，其描述了能有效减轻严寒、高盐和干旱对植物的不利作用以及赋予植物表型以其它有利作用的基因，包括cbf基因和转录因子。[0293](c)美国专利申请公布no.2004/0148654和wo2001/36596，其中植[0294]物中的脱落酸被改变，导致植物表型改善，比如产量提高和/或对非生物胁迫的耐受性提高。[0295](d)wo2000/006341、wo2004/090143、美国专利no.7,531,723和6,992,237，其中细胞分裂素表达经修饰，产生具有增强的胁迫耐受性(如耐旱性)和/或增加的产量的植物。还可参见wo2002/02776、wo2003/052063、jp2002/281975、美国专利no.6,084,153、wo2001/64898、美国专利no.6,177,275和美国专利no.6,107,547(增强氮利用和改变氮响应度)。[0296](e)有关乙烯改变，参见美国专利申请公布no.2004/0128719、美国专利申请公布no.2003/0166197和wo2000/32761。[0297](f)有关植物转录因子或者非生物胁迫的转录调节剂，参见例如美国专利申请公布no.2004/0098764或美国专利申请公布no.2004/0078852。[0298](g)增加液泡焦磷酸酶的表达的基因，诸如实现产量增加的avp1(美国专利no.8,058,515)；编码hsfa4或hsfa5(a4或a5类的热休克因子)多肽、寡肽转运蛋白(opt4样)多肽的核酸；plastochron2样(pla2样)多肽或wuschel相关的同源盒1样(wox1样)多肽(美国专利申请公布no.us2011/0283420)。[0299](h)编码聚(adp‑核糖)聚合酶(parp)蛋白的多核苷酸的减量调节以调节程序性细胞死亡(美国专利no.8,058,510)使活力增强。[0300](i)编码用于赋予抗旱性的dtp21多肽的多核苷酸(美国专利申请公布no.us2011/0277181)。[0301](j)编码用于调节发育、调节对胁迫的响应以及调节胁迫耐受性的acc合成酶3(acs3)蛋白的核苷酸序列(美国专利申请公布no.us2010/0287669)。[0302](k)编码赋予耐旱性表型(dtp)以赋予抗旱性的蛋白的多核苷酸(wo2012/058528)。[0303](l)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(tc)基因(美国专利申请公布no.2012/0272352)。[0304](m)实现胁迫耐受性的caax氨基末端家族蛋白(美国专利no.8,338,661)。[0305](n)sal1编码基因中的突变增强了胁迫耐受性，包括增强的抗旱性(美国专利申请公布no.2010/0257633)。[0306](o)编码选自如下的多肽的核酸序列的表达：grf多肽、raa1样多肽、syr多肽、arkl多肽和ytp多肽，增强了产量相关性状(美国专利申请公布no.2011/0061133)。[0307](p)调节编码iii类海藻糖磷酸磷酸酶(tpp)多肽的核酸在植物中的表达，以增强植物中的产量相关性状，尤其是增加种子产量(美国专利申请公布no.2010/0024067)。[0308]可将其它影响植物生长和农学性状(比如产量、开花、植物生长和/或植物结构)的基因和转录因子引入或基因渗入植物中，参见如wo1997/49811(lhy)、wo1998/56918(esd4)、wo1997/10339和美国专利no.6,573,430(tfl)、美国专利no.6,713,663(ft)、wo1996/14414(con)、wo1996/38560、wo2001/21822(vrn1)、wo2000/44918(vrn2)、wo1999/49064(gi)、wo2000/46358(fr1)、wo1997/29123、美国专利no.6,794,560、美国专利no.6,307,126(gai)、wo1999/09174(d8和rht)以及wo2004/076638和wo2004/031349(转录因子)。[0309]7.赋予增加的产量的基因[0310](a)由1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸脱氨酶样多肽(accdp)编码核酸所转化的转基因作物，其中该核酸序列在作物中的表达导致与植物的野生型品种相比，植物根生长增加和/或产量增加，和/或对环境胁迫的耐受性增强(美国专利no.8,097,769)。[0311](b)使用种子优选的启动子过表达玉蜀黍锌指蛋白基因(zm‑zfp1)已显示出能增强植物生长，增加籽粒数量和单株植物的总籽粒重量(美国专利申请公布no.2012/0079623)。[0312](c)玉蜀黍侧生器官边界(lob)结构域蛋白(zm‑lobdp1)的组成性过表达已显示出能增加籽粒数量和单株植物的总籽粒重量(美国专利申请公布no.2012/0079622)。[0313](d)通过调节编码vim1(甲基化变体1)样多肽或vtc2样(gdp‑ꢀl‑半乳糖磷酸化酶)多肽或duf1685多肽或arf6样(生长素响应因子)多肽的核酸在植物中的表达来增强植物中的产量相关性状(wo2012/038893)。[0314](e)调节编码ste20样多肽或其同源物的核酸在植物中的表达得到相对于对照植物具有增加的产量的植物(ep2431472)。[0315](f)编码用于改变植物根构型的二磷酸核苷激酶(ndk)多肽及其同源物的基因(美国专利申请公布no.2009/0064373)。[0316]8.赋予植物消化性的基因。[0317](a)通过调节木聚糖合酶的表达来改变存在于植物细胞壁中的木聚糖的水平(美国专利no.8,173,866)。[0318]在一些实施方案中，堆叠的性状可为得到监管批准的性状或事件，包括但不限于为本领域技术人员所熟知并且可见于环境风险评估中心(cera‑ꢀgmc.org/？action＝gm_crop_database，可使用www前缀对其进行访问)和国际农业生物技术应用服务组织(internationalservicefortheacquisitionofagri‑biotechapplications)(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，可使用www前缀对其进行访问)的得到监管批准的事件。[0319]基因沉默[0320]在一些实施方案中，堆叠性状可为一种或多种目的多核苷酸的沉默形式，从而造成对一种或多种靶标害虫多肽的抑制。在一些实施方案中，所述沉默通过使用抑制dna构建体而实现。[0321]在一些实施方案中，一种或多种编码ptip‑96多肽或其片段或变体的多肽的多核苷酸可与如上文所述的编码具有杀昆虫活性或农学性状的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸堆叠，并且任选地还可包含使如下文讨论的一种或多种靶多核苷酸发生基因沉默的一种或多种多核苷酸。[0322]“抑制dna构建体”是这样的重组dna构建体，其在转化或稳定整合到植物的基因组中时导致植物中靶基因的“沉默”。靶基因对于植物可为内源的或转基因的。如本文相对于靶基因所用的“沉默”一般是指对由靶基因表达的mrna或蛋白/酶的水平和/或酶活性或蛋白功能的水平的抑制。术语“抑制”包括降低、减少、下降、减小、抑制、消除和防止。ꢀ“沉默”或“基因沉默”并无特定机制，并且包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎‑环抑制、基于rnai的方法以及基于小rna的方法。[0323]抑制dna构建体可包含源自目的靶基因的区域，并且可包含目的靶基因的有义链(或反义链)的全部或部分核酸序列。根据将要采用的方法，该区域可与目的基因的全部或部分有义链(或反义链)100％相同或少于100％相同(例如，至少50％相同或51％与100％相同之间的任何整数)。[0324]抑制dna构建体是本领域熟知的，易于在选择目的靶基因后进行构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎‑环抑制构建体、产生双链rna的构建体，以及更一般地，rnai(rna干扰)构建体和小rna构建体诸如sirna(短干扰rna)构建体和mirna(微rna)构建体。[0325]“反义抑制”是指产生能够抑制靶蛋白的表达的反义rna转录物。[0326]“反义rna”是指与靶初级转录物或mrna的全部或部分互补，并且能阻断靶分离核酸片段的表达的rna转录物(美国专利no.5,107,065)。反义rna的互补性可存在于特定基因转录物的任何部分，即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或者编码序列。[0327]“共抑制”是指产生能够抑制靶蛋白的表达的有义rna转录物。“有义”rna是指包括该mrna并且可在细胞内或者在体外被翻译成蛋白质的rna转录物。此前，植物中的共抑制构建体的设计是通过聚焦与天然mrna具有同源性的核酸序列在有义取向上的过表达，使得所有与过表达序列具有同源性的rna减少(参见vaucheret等人，(1998)plantj.16：651‑ꢀ659和gura，(2000)nature404：804‑808)。[0328]另一种变型描述了植物病毒序列用于引导近端mrna编码序列的抑制的用途(pct公布wo1998/36083)。[0329]最近的研究已描述了“发夹”结构的用途，所述“发夹”结构掺入了互补取向的全部或部分mrna编码序列，从而使所表达的rna产生可能的“茎‑环”结构(pct公布wo1999/53050)。在这种情况下，茎由与相对于启动子在有义或反义取向上插入的目的基因相对应的多核苷酸形成，并且环由目的基因的在构建体中不具有互补序列的一些多核苷酸形成。这增加了恢复的转基因植物中共抑制或沉默的频率。有关发夹抑制的综述，参见wesley等人，(2003)methodsinmolecularbiology，plantfunctionalgenomics：methodsandprotocols236：273‑286。[0330]一种构建体也已经有效地用于抑制，该构建体的茎由至少30个来自待抑制的基因的核苷酸形成，而环由随机的核苷酸序列形成的(pct公布wo1999/61632)。[0331]多聚t和多聚a序列用于建立茎‑环结构中的茎的用途也有所描述(pct公布wo2002/00894)。[0332]又一种变型包括，使用合成的重复序列来促进茎‑环结构中的茎的形成。已经证实，用这样的重组dna片段制备的转基因生物体具有降低水平的蛋白，该蛋白由形成环的核苷酸片段编码，如pct公布wo2002/00904所述。[0333]rna干扰是指由短干扰rna(sirna)介导的动物中序列特异性的转录后基因沉默的过程(fire等人，(1998)nature391：806)。植物中的相应过程通常称作转录后基因沉默(ptgs)或rna沉默，而在真菌中也称作压制(quelling)。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基因的表达的进化上保守的细胞防御机制，并且通常由不同的植物区系和门共有(fire等人，(1999)trendsgenet.15：358)。这种防止外来基因表达的保护可能是响应于双链rna(dsrna)的生成而逐渐形成，所述双链rna源自病毒感染，或源自通过特异性破坏病毒基因组rna的同源单链rna的细胞反应而将转座子元件随机整合到宿主基因组中。dsrna在细胞中的存在会通过有待充分表征的机制触发rnai响应。[0334]长dsrna在细胞中的存在会刺激称作切丁酶(dicer)的核糖核酸酶iii酶的活性。切丁酶参与了将dsrna加工成为称作短干扰rna(sirna)的dsrna短片段的过程(berstein等人，(2001)nature409：363)。由切丁酶的作用得到的短干扰rna的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19碱基对的双链体(elbashir等人，(2001)genesdev.15：188)。切丁酶也涉及从参与翻译控制的保守结构的前体rna中切除21‑核苷酸和22‑核苷酸的小时序rna(strna)(hutvagner等人，(2001)science293：834)。rnai反应也表征了通常称作rna诱导的沉默复合物(risc)的内切核酸酶复合物，其介导与sirna双链体的反义链具有序列互补性的单链rna的裂解。靶rna的裂解发生在与sirna双链体的反义链互补的区域的中间(elbashir等人，(2001)genesdev.15：188)。另外，rna干扰也可以涉及小rna(例如，mirna)介导的基因沉默，据推测是通过调控染色质结构的细胞机制，从而阻止靶基因序列的转录(参见例如，allshire，(2002)science297：1818‑1819；volpe等人，(2002)science297：1833‑1837；jenuwein，(2002)science297：2215‑2218和hall等人，(2002)science297：2232‑2237)。这样，本公开的mirna分子可用于通过与rna转录物的相互作用或通过与特定基因序列的相互作用而介导基因沉默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后层面的基因沉默。[0335]还提供了使由沉默元件产生的rnai增加的方法和组合物。在此类实施方案中，所述方法和组合物采用第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包含可操作地连接至在植物细胞中有活性的启动子的靶标害虫序列沉默元件；所述第二多核苷酸包含可操作地连接至在植物细胞中有活性的启动子的抑制增强元件，所述抑制增强元件包含靶标害虫序列或其活性变体或片段。沉默元件与抑制增强元件的联合表达使得由沉默元件产生的抑制性rna的扩增较仅单独使用沉默元件表达可实现的扩增有所增加。除增强特定rnai物质本身的扩增之外，所述方法和组合物还允许产生不同种群的rnai物质，其可增强干扰靶基因表达的效力。因此，当在植物细胞中结合沉默元件表达抑制增强元件时，所述方法和组合物可允许整个植物系统性产生rnai；与仅单独使用沉默元件构建体观察到的相比产生更大量的rnai；并且改善将rnai载入植物的韧皮部中，因而通过rnai方法对进食韧皮部的昆虫提供更好的防治。因此，各种方法和组合物提供了将抑制性rna递送至靶生物体的改善方法。参见例如美国专利申请公布2009/0188008。[0336]如本文所用，“抑制增强元件”包含多核苷酸，所述多核苷酸包含待抑制的靶序列或其活性片段或变体。已认识到，抑制增强元件无需与靶序列相同，相反，抑制增强元件可以包含靶序列的变体，只要抑制增强元件与靶序列具有足够的序列同一性，从而允许与仅使用沉默元件表达可实现的相比，由沉默元件产生的rnai的水平提高。类似地，抑制增强元件可包含靶序列的片段，其中片段具有足够长度从而允许与仅使用沉默元件表达可实现的相比，由沉默元件产生的rnai的水平提高。[0337]已认识到，可采用来自相同靶序列或来自不同靶序列或来自相同靶序列的不同区域的多个抑制增强元件。例如，所采用的抑制增强元件可以包含源自靶序列的不同区域的靶序列片段(即，源自3′utr、编码序列、内含子和/或5′utr)。此外，如本文别处所述，抑20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(rna或双链rna)，其在被昆虫害虫物种摄入后起减量调节所述昆虫害虫中靶基因的表达的作用，其中所述rna包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件为双链rna区域，所述双链rna区域包含退火的互补链，其中的一条链包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成。美国专利申请公开2012/0164205描述了干扰双链核糖核酸以抑制无脊椎害虫的潜在靶标，包括：chd3同源序列、β微管蛋白同源序列、40kdav‑atp酶同源序列、ef1α同源序列、26s蛋白酶体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物水解酶同源序列、依赖溶胀的氯通道蛋白同源序列、葡萄糖‑6‑磷酸1‑ꢀ脱氢酶蛋白同源序列、act42a蛋白同源序列、adp‑核糖基化因子1同源序列、转录因子iib蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶同源序列、泛素b同源序列、保幼激素酯酶同源物、以及α微管蛋白同源序列。[0342]杀虫防治的用途[0343]将包含所述实施方案的核酸序列或其变体的菌株用于杀虫剂控制或用于将其它生物体工程改造为杀虫剂的一般方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利no.5,039,523和ep0480762a2。[0344]可选择已知会占领一种或者多种所关注作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争，提供表达ptip‑96多肽的基因的稳定维持和表达，并且理想的是，提供对该杀虫剂的改善保护使其不受环境降解和失活。[0345]或者，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生ptip‑96多肽。异源基因的表达直接或间接导致该杀虫剂的胞内产生和维持。然后将这些细胞在当将细胞施用于靶标害虫的环境时能延长该产生的毒素在细胞中的活性的条件下进行处理。所得的产物保持该毒素的毒性。然后可按照常规技术配制这些天然封装的ptip‑96多肽以便施用于靶标害虫的寄生环境，例如土壤、水和植物的叶。参见例如epa0192319，以及其中引用的参考文献。[0346]杀虫组合物[0347]在一些实施方案中，活性成分可以组合物的形式施用，并且可以同时或相继地与其它化合物一起施用于待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀虫皂、休眠油、聚合物和/或定时释放或可生物降解的载体制剂，其允许在单次施用所述制剂后对靶区域进行长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或几种这些制剂的混合物，如果需要，还与其它农业上可接受的载体、表面活性剂或在配制领域中通常使用的促进施用的助剂一起使用。合适的载体和助剂可以是固体或者液体，并对应于通常用于配制技术中的物质，例如天然或者再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或者肥料。同样地，可将所述制剂制备成可食用的“诱饵”或塑造成害虫“陷阱”，以允许靶标害虫摄食或摄取所述杀虫制剂。[0348]施用活性成分或农业化学组合物(包含至少一种由细菌菌株产生的ptip‑96多肽)的方法包括叶面施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用率取决于相应害虫侵染的强度。[0349]可以将组合物配制成粉剂、散剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂、溶液剂等，并且可以通过常规方法，例如包含所述多肽的细胞培养物的干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备所述组合物。在包含至少一种此类杀虫多肽的所有这些组合物中，所述多肽可以约1重量％到约99重量％的浓度存在。[0350]可通过本发明的方法在给定区域内杀死鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目害虫或减少其数目，或者可将本发明的方法预防性地应用于环境区域以防止被易感害虫侵染。优选地，害虫摄取杀虫有效量的多肽，或与杀虫有效量的多肽接触。如本文所用，“杀虫有效量”是指这样的杀虫剂的量，所述量能够引起至少一只害虫死亡，或者明显减少害虫生长、取食或正常的生理发育。该量将随下列因素而变化：例如，待防治的特定的靶标害虫，待处理的特定的环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件，以及施用杀虫有效的多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性和数量。所述制剂还可以随气候条件、环境考虑和/或施用频率和/或害虫侵染的严重程度而变化。[0351]可通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬浮液或者分离的蛋白质组分与所需的农业上可接受的载体配制在一起来制备所述的杀虫剂组合物。在施用前，可以合适的方法例如冻干、冷冻干燥、干燥，或者在水性载体、介质或合适稀释剂例如盐水或其它的缓冲液中配制所述组合物。配制的组合物可以为粉尘或颗粒材料的形式，或者在油(植物或矿物油)中的悬浮液的形式，或者水或油/水乳剂的形式，或者作为可润湿的粉剂，或者与适合于农业应用的任何其它载体材料相组合。合适的农业载体可以是固体或液体，并且是本领域熟知的。术语“农业上可接受的载体”包括通常用于杀虫剂配制技术的所有助剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些对于杀虫剂配制领域的技术人员来说是熟知的。所述制剂可以与一种或多种固体或液体助剂相混合，并且可以通过多种方法来制备，例如通过使用常规配制技术将杀虫组合物与合适的助剂一起均匀地混合、共混和/或研磨。合适的制剂和施用方法描述于美国专利no.6,468,523中，其以引用方式并入本文。还可以用一种或多种化学组合物来处理植物，这些化学组合物包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。示例性的化学组合物包括：果实/蔬菜类除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵膦、氯吡嘧磺隆(gowan公司)、百草枯、炔苯酰草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、三嗪茚草胺(indaziflam)；果实/蔬菜类杀昆虫剂：涕灭威、转苏云金芽孢杆菌(bacillusthuriengiensis)、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β‑氟氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、λ‑三氟氯氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ‑ꢀ三氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、乙基多杀菌素(spinoteram)、杀铃脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氟虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、腈吡螨酯(cyanopyrafen)、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、乙基多杀菌素、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀‑苯甲酸盐、茚虫威、噻唑膦(forthiazate)、苯线磷、硫线磷、吡丙醚、苯丁锡氧化物、噻螨酮(hexthiazox)、灭多威、4‑[[(6‑氯吡啶‑3‑基)甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5h)‑酮；果实/蔬菜类杀真菌剂：多菌灵、百菌清、ebdc、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、三乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸恶咪唑、赛座灭、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷类除草剂：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酯、禾草灵、氟虫腈、精恶唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘甲磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、甲基二磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻磺隆、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、磺酰草吡唑、甲氧磺草胺、氟噻草胺、三甲苯草酮、吡咯磺隆(pyroxasulfon)；谷类杀真菌剂：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷类杀昆虫剂：乐果、λ‑氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、α‑氯氰菊酯、β‑氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、毒死蜱、甲胺磷、乙酰甲胺磷(oxidemethon‑methyl)、抗蚜威、甲硫威；玉蜀黍除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(s‑)二甲吩草胺、草铵膦、草甘膦、异恶唑草酮、(s‑)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、环磺酮、嘧啶肟草醚、噻酮磺隆、氟噻草胺、吡咯磺隆；玉蜀黍杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ‑氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β‑氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀铃脲(triflumoron)、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉蜀黍杀真菌剂：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、咪唑磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草丹、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、恶嗪草酮、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔恶草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特糠酯酮、恶草酮(oxadiazone)、精恶唑禾草灵、吡丙醚；水稻杀昆虫剂：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氟虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、因灭汀‑苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4‑[[(6‑氯吡啶‑3‑基))甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5h)‑酮、克百威、丙硫克百威；水稻杀真菌剂：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯喹酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂：敌草隆、氟草隆、msma、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、丁基吡氟禾草灵、草甘膦、氟草敏、二甲戊灵、嘧草硫醚、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、噻苯隆；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀‑苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ‑氟氯氰菊酯、多杀菌素、硫双威、y‑氟氯氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、β‑氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫双酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、γ‑氟氯氰菊酯、4‑[[(6‑氯吡啶‑3‑基))甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5h)‑酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹；棉花杀真菌剂：土菌灵、甲霜灵、五氯硝基苯；大豆除草剂：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精恶唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(s‑)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊灵、得杀草、草铵膦；大豆杀昆虫剂：λ‑氟氯氰菊酯、灭多威、对硫磷、硫双威(thiocarb)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氟虫酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素、因灭汀‑苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β‑氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4‑ꢀ[[(6‑氯吡啶‑3‑基))甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5h)‑酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀铃脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β‑harris)(秋尺蠖)；桃枝麦蛾(anarsialineatellazeller)(桃条麦蛾)；犀额蛾(anisotasenatoriaj.e.smith)(orangestripedoakworm)；antheraeapernyiguérin‑méneville(中国橡树柞蚕蛾)；家蚕(bombyxmorilinnaeus)(蚕)；棉潜蛾(bucculatrixthurberiellabusck)(cottonleafperforator)；苜蓿黄蝶(coliaseurythemeboisduval)(alfalfacaterpillar)；datanaintegerrimagrote&robinson(胡桃毛虫)；dendrolimussibiricustschetwerikov(西伯利亚丝蛾)，ennomossubsignariahübner(榆树尺蠖)；菩提尺蠖(erannistiliariaharris)(椴木尺蠖)；黄毒蛾(euproctischrysorrhoealinnaeus)(棕尾毒蛾)；黑拟蛉蛾(harrisinaamericanaguérin‑méneville)(葡萄叶食虫)；hemileucaoliviaecockrell(牧场毛虫)；美国白蛾(hyphantriacuneadrury)(fallwebworm)；番茄蠹蛾(keiferialycopersicellawalsingham)(番茄蠹蛾)；二尾蛱蝶(lambdinafiscellariafiscellariahulst)(easternhemlocklooper)；西部铁杉尺蠖(l.fiscellarialugubrosahulst)(westernhemlocklooper)；leucomasalicislinnaeus(柳毒蛾)；lymantriadisparlinnaeus(舞毒蛾)；番茄天蛾(manducaquinquemaculatahaworth)(五斑天蛾、番茄天蛾)；烟草天蛾(m.sextahaworth)(番茄天蛾、烟草天蛾)；冬尺蠖(operophterabrumatalinnaeus)(松白条尺蠖蛾)；春尺蠖(paleacritavernatapeck)(springcankerworm)；papiliocresphontescramer(巨燕尾蝶，橙狗(orangedog))；加州槲蛾(phryganidiacalifornicapackard)(californiaoakworm)；柑橘潜叶蛾(phyllocnistiscitrellastainton)(citrusleafminer)；斑幕潜叶蛾(phyllonorycterblancardellafabricius)(spottedtentiformleafminer)；大菜粉蝶(pierisbrassicaelinnaeus)(largewhitebutterfly)；小菜粉蝶(p.rapaelinnaeus)(菜白蛾)；暗脉菜粉蝶(p.napilinnaeus)(greenveinedwhitebutterfly)；洋蓟羽蛾(platyptiliacarduidactylariley)(artichokeplumemoth)；plutellaxylostellalinnaeus(小菜蛾)；pectinophoragossypiellasaunders(棉红铃虫)；pontiaprotodiceboisduvalandleconte(南方菜青虫)；sabulodesaegrotataguenée(杂食尺蠖)；红疣天社蛾(schizuraconcinnaj.e.smith)(redhumpedcaterpillar)；麦蛾(sitotrogacerealellaolivier)(angoumoisgrainmoth)；thaumetopoeapityocampaschiffermuller(松树列队毛虫)；结网衣蛾(tineolabisselliellahummel)(webbingclothesmoth)；tutaabsolutameyrick(番茄斑潜蝇)；yponomeutapadellalinnaeus(巢蛾)；heliothissubflexaguenée；天幕毛虫属物种(malacosomaspp.)和毒蛾属物种(orgyiaspp.)。[0359]值得关注的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(anthribidae)、豆象科(bruchidae)和象甲科(curculionidae)的象鼻虫(包括但不限于：棉铃象甲(anthonomusgrandisboheman)(棉籽象鼻虫)；lissorhoptrusoryzophiluskuschel(稻水象甲)；sitophilusgranariuslinnaeus(谷象)；s.oryzaelinnaeus(米象)；三叶草叶象(hyperapunctatafabricius)(cloverleafweevi)；向日葵茎象甲(cylindrocopturusadspersusleconte)(sunflowerstemweevi)；红色葵花籽象甲(smicronyxfulvusleconte)(redsunflowerseedweevi)；灰色葵花籽象甲(s.sordidusleconte)(graysunflowerseedweevi)；sphenophorusmaidischittenden(玉米象虫))；叶甲科(chrysomelidae)的跳甲、守瓜、根虫、叶甲、马铃薯甲虫和潜叶虫(包括但不限于：科罗拉多州马铃薯甲虫(leptinotarsadecemlineatasay)(科罗拉多马铃薯甲虫)；diabroticavirgiferavirgiferaleconte(西方玉米根虫)；d.barberismithandlawrence(北方玉米根虫)；黄瓜十一星叶甲(d.undecimpunctatahowardibarber)(南方玉米根虫(southerncornrootworm))；chaetocnemapulicariamelsheimer(玉米跳甲)；phyllotretacruciferaegoeze(十字花科跳甲)；黄曲条跳甲(phyllotretastriolata)(strippedfleabeetle)；colaspisbrunneafabricius(葡萄肖叶甲)；黑角负泥虫(oulemamelanopuslinnaeus)(禾谷叶甲(cerealleafbeetle))；zygogrammaexclamationisfabricius(向日葵甲虫)；来自瓢甲科(coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：epilachnavarivestismulsant(墨西哥豆瓢虫))；来自金龟科(scarabaeidae)的金龟子和其它甲虫(包括但不限于：popilliajaponicanewman(日本金龟子)；北方圆头犀金龟(cyclocephalaborealisarrow)(northernmaskedchafer，蛴螬)；南方圆头犀金龟(c.immaculataolivier)(southernmaskedchafer，蛴螬)；rhizotrogusmajalisrazoumowsky(欧洲金龟子)；phyllophagacrinitaburmeister(白蛴螬)；ligyrusgibbosusdegeer(胡萝卜金龟)；来自皮蠹科(dermestidae)的地毯圆皮蠹(carpetbeetle)；来自叩头虫科(elateridae)的线虫、伪金针虫属物种(eleodesspp.)；金针虫属物种(melanotusspp.)；宽胸叩头虫属物种(conoderusspp.)；丘胸叩甲属物种(limoniusspp.)；细胸叩甲属物种(agriotesspp.)；旱地金针虫属物种(cteniceraspp.)；aeolus属物种；来自小蠹科(scolytidae)的树皮甲虫以及来自拟步甲科(tenebrionidae)的甲虫。[0360]双翅目(diptera)的成体和未成熟体是值得关注的，包括潜叶虫agromyzaparvicornisloew(玉米斑潜叶虫)；蠓(包括但不限于：高粱瘿蚊(contariniasorghicolacoquillett(高粱摇蚊(sorghummidge))；黑森瘿蚊(mayetioladestructorsay)(黑森蝇(hessianfly))；麦红吸浆虫(sitodiplosismosellanagéhin)(小麦摇蚊)；neolasiopteramurtfeldtianafelt(向日葵籽摇蚊))；果蝇(实蝇科(tephritidae))、oscinellafritlinnaeus(果蝇)；蛆(包括但不限于：deliaplaturameigen(玉米种蝇)；d.coarctatafallen(麦种蝇)以及其它地种蝇属(deliaspp.)：meromyzaamericanafitch(麦秆蝇)；舍蝇(muscadomesticalinnaeus)(家蝇类)；夏厕蝇(fanniacanicularislinnaeus)、小舍蝇(f.femoralisstein)(lesserhouseflies)；厩螫蝇(stomoxyscalcitranslinnaeus)(厩蝇类)；面蝇、角蝇、丽蝇、金蝇属物种(chrysomyaspp.)；伏蝇属(phormiaspp.)和其它蝇类(muscoidfly)害虫、马蝇类虻属物种(tabanusspp.)；肤蝇类胃蝇属物种(gastrophilusspp.)；狂蝇属物种(oestrusspp.)；牛蝇类皮蝇属物种(hypodermaspp.)；鹿蝇类斑虻属物种(chrysopsspp.)；melophagusovinuslinnaeus(虱蝇类)和其它短角亚目(brachycera)、蚊类伊蚊属物种(aedesspp.)；按蚊属物种(anophelesspp.)；库蚊属物种(culexspp.)；黑蝇类原蚋属物种(prosimuliumspp.)；蚋属物种(simuliumspp.)；铗蠓、白蛉、尖眼蕈蚊(sciarid)和其它长角亚目(nematocera)。[0361]作为所关注的昆虫而包括的是半翅目和同翅目的成体和幼虫，例如但不限于来自球蚜科(adelgidae)的球蚜；来自盲蝽科(miridae)的盲蝽；来自蝉科(cicadidae)的蝉；来自叶蝉科(cicadellidae)的叶蝉、小绿叶蝉属(empoascaspp.)；来自菱飞虱科(cixiidae)、蛾蜡蝉科(flatidae)、蜡蝉总科(fulgoroidea)、圆飞虱科(issidae)以及稻虱科(delphacidae)的飞虱；来自角蝉科(membracidae)的角蝉；来自木虱科(psyllidae)的木虱；来自粉虱科(aleyrodidae)的粉虱；来自蚜科(aphididae)的蚜虫；来自根瘤蚜科(phylloxeridae)的根瘤蚜；来自粉蚧科(pseudococcidae)的粉蚧；来自链介壳虫科(asterolecanidae)、软介壳虫科(coccidae)、洋红蚧科(dactylopiidae)、盾介壳虫科(diaspididae)、绒蚧科(eriococcidae)、旌介壳虫科(ortheziidae)、刺葵介壳虫科(phoenicococcidae)以及硕介壳虫科(margarodidae)的介壳虫；来自网蝽科(tingidae)的网蝽；来自蝽科(pentatomidae)的椿象；麦长蝽；土长蝽属(blissusspp.)；以及来自长蝽科(lygaeidae)的其它长蝽(seedbug)；来自沫蝉科(cercopidae)的沫蝉；来自缘蝽科(coreidae)的南瓜缘蝽以及来自红蝽科(pyrrhocoridae)的红蝽和棉蝽象。[0362]来自同翅目的在农业上重要的成员还包括但不限于：豌豆蚜(acyrthisiphonpisumharris)(豆长管蚜)；花生蚜(aphiscraccivorakoch)(黑豆蚜)；a.fabaescopoli(黑豆蚜)；棉蚜(a.gossypiiglover)(棉蚜、瓜蚜)；玉米根蚜(a.maidiradicisforbes)(cornrootaphid)；苹果黄蚜(a.pomidegeer)(苹果蚜)；绣线菊蚜(a.spiraecolapatch)(卷叶蚜)；aulacorthumsolanikaltenbach(茄无网长管蚜)；chaetosiphonfragaefoliicockerell(草莓蚜)；diuraphisnoxiakurdjumov/mordvilko(俄罗斯小麦蚜)；玫瑰苹果蚜(dysaphisplantagineapaaserini)(rosyappleaphid)；eriosomalanigerumhausmann(苹果绵蚜)；甘蓝短棒蚜(brevicorynebrassicaelinnaeus)(甘蓝蚜)；hyalopterusprunigeoffroy(桃大尾蚜)；lipaphiserysimikaltenbach(萝卜蚜)；metopolophiumdirrhodumwalker(麦长管蚜)；macrosiphumeuphorbiaethomas(马铃薯蚜)；烟蚜(myzuspersicaesulzer)(桃蚜)；nasonoviaribisnigrimosley(莴苣蚜)；瘿绵蚜属物种(pemphigusspp.)(根蚜和瘿蚜)；玉米缢管蚜(rhopalosiphummaidisfitch)(玉米叶蚜)；r.padilinnaeus(禾谷缢管蚜)；schizaphisgraminumrondani(麦二叉蚜)；siphaflavaforbes(yellowsugarcaneaphid)；sitobionavenaefabricius(麦长管蚜)；斑点苜蓿蚜(therioaphismaculatabuckton)(苜蓿斑蚜)；toxopteraaurantiiboyerdefonscolombe(桔二岔蚜)和t.citricidakirkaldy(褐色橘蚜)；球蚜属(adelgesspp.)(球蚜)；长山核桃根瘤蚜(phylloxeradevastatrixpergande)(美洲山核桃根瘤蚜)；bemisiatabacigennadius(烟粉虱，甘薯粉虱)；b.argentifoliibellows&perring(银叶粉虱)；dialeurodescitriashmead(柑桔白粉虱)；trialeurodesabutiloneus(纹翅粉虱)和t.vaporariorumwestwood(温室白粉虱)；蚕豆微叶蝉(empoascafabaeharris)(马铃薯小绿叶蝉)；laodelphaxstriatellusfallen(灰飞虱)；macrolestesquadrilineatusforbes(二点叶蝉)；黑尾叶蝉(nephotettixcinticepsuhler)(青叶蝉)；二条黑尾叶蝉(nnigropictus)(黑尾叶蝉)；nilaparvatalugens(褐飞虱)；peregrinusmaidisashmead(玉米飞虱)；sogatellafurciferahorvath(白背飞虱)；sogatodesorizicolamuir(稻飞虱)；typhlocybapomariamcatee(苹果白叶蝉)；erythroneouraspp.(葡萄小叶蝉)；magicicadaseptendecimlinnaeus(周期蝉)；iceryapurchasimaskell(吹绵介壳虫)；梨园蚧(quadraspidiotusperniciosuscomstock)(圣约瑟虫)；桔臀纹粉蚧(planococcuscitririsso)(柑桔粉蚧)；粉蚧属物种(pseudococcusspp.)(其它粉蚧复合体)；梨木虱(cacopsyllapyricolafoerster)(梨黄木虱)；triozadiospyriashmead(柿木虱)。[0363]来自半翅目的所关注的在农业上重要的物种包括但不限于：喜绿蝽(acrosternumhilaresay)(稻绿蝽)；anasatristisdegeer(南瓜缘蝽)；美洲谷长蝽(blissusleucopterusleucopterussay)(高粱长蝽)；方翅网蝽(corythucagossypiifabricius)(棉花网蝽)；cyrtopeltismodestadistant(番茄蝽)；棉蝽(dysdercussuturellusherrich‑)(污棉虫)；褐臭椿(euschistusservussay)(brownstinkbug)；一斑臭蝽(e.variolariuspalisotdebeauvois)(one‑spottedstinkbug)；长蝽属物种(graptostethusspp.)(长蝽科复合体(complexofseedbugs))；leptoglossuscorculussay(松叶根蝽)；lyguslineolarispalisotdebeauvois(牧草盲蝽)；l.hesperusknight(西部牧草盲蝽)；牧草盲蝽(l.pratensislinnaeus)(commonmeadowbug)；长毛草盲蝽(l.rugulipennispoppius)(欧洲牧草盲蝽)；长绿盲蝽(lygocorispabulinuslinnaeus)(commongreencapsid)；稻绿蝽nezaraviridulalinnaeus)(南部稻绿蝽)；稻蝽(oebaluspugnaxfabricius)(稻褐蝽)；oncopeltusfasciatusdallas(大马利筋长蝽)；pseudatomoscelisseriatusreuter(棉盲蝽)。[0364]此外，实施方案可有效地针对半翅目，如calocorisnorvegicusgmelin(草莓长蝽)；orthopscampestrislinnaeus；苹盲蝽(plesiocorisrugicollisfallen)(applecapsid)；cyrtopeltismodestusdistant(番茄蝽)；烟草小盲蝽(suckfly)；spanagonicusalbofasciatusreuter(白斑盲蝽)；皂荚蝽(diaphnocorischlorionissay)(honeylocustplantbug)；labopidicolaalliiknight(洋葱蝽)；pseudatomoscelisseriatusreuter(棉盲蝽)；苜蓿褐盲蝽(adelphocorisrapidussay)(rapidplantbug)；四线盲蝽(poecilocapsuslineatusfabricius)(four‑linedplantbug)；拟麦长蝽(nyslusericaeschilling)(falsechinchbug)茶黄蓟马(nysiusraphanushoward)(假麦长蝽)；稻绿蝽nezaraviridulalinnaeus)(南部稻绿蝽)；扁盾蝽属物种(eurygasterspp.)；缘蝽属物种(coreidaespp.)；红蝽属物种(pyrrhocoridaespp.)；谷蛾属物种(tinidaespp.)；负子蝽属物种(blostomatidaespp.)；锥蝽属物种(reduviidaespp)和臭虫属物种(cimicidae)。[0365]另外，包括蜱螨目(acari)(螨类)的成体和幼虫，诸如aceriatosichellakeifer(小麦卷叶螨)麦岩螨(petrobialatensmüller)(褐色小麦螨)；叶螨科(tetranychidae)的叶螨和红螨，panonychusulmikoch(欧洲红螨)；tetranychusurticaekoch(二斑叶螨)；(t.mcdanielimcgregor(迈叶螨)；t.cinnabarinusboisduval(红蜘蛛螨)；土耳其斯坦叶螨(t.turkestaniugarov&nikolski)(草莓蛛螨)；细须螨科(tenuipalpidae)的葡萄短须螨、brevipalpuslewisimcgregor(柑橘红蜘蛛)；瘿螨科(eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其它食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(ixodidae)的蜱类。黑脚硬蜱(ixodesscapularissay)(鹿蜱)；全环硬蜱(i.holocyclusneumann)(澳洲寄生蜱(australianparalysistick))；变异革蜱(dermacentorvariabilissay)(美洲犬蜱)；amblyommaamericanumlinnaeus(孤星蜱)以及痒螨科(psoroptidae)、蒲螨科(pyemotidae)和疥螨科(sarcoptidae)的痒螨和疥螨。[0366]缨尾目(thysanura)的昆虫害虫是值得关注的，诸如lepismasaccharinalinnaeus(蠹虫)；家衣鱼(thermobiadomesticapackard)(小灶衣鱼(firebrat))。[0367]涵盖的另外的节肢害虫包括：蜘蛛目(araneae)中的蜘蛛，如褐色隐士蜘蛛(loxoscelesreclusagertschandmulaik，brownreclusespider)和黑寡妇蜘蛛(latrodectusmactansfabricius，blackwidowspider)以及蚰蜓目(scutigeromorpha)的多足类例如蚰蜒(scutigeracoleoptratalinnaeus，housecentipede)。[0368]所关注的昆虫害虫包括椿象和其它相关昆虫的总科，包括但不限于属于蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽、璧蝽(piezodorusguildini)、褐臭蝽、喜绿蝽、大豆褐椿、euschistustristigmus、喜绿蝽、dichelopsfurcatus、dichelopsmelacanthus和bagradahilaris(菘蝽))、龟蝽科(筛豆龟蝽‑豆圆蝽(beanplataspid))和土蝽科(scaptocoriscastanea‑根椿象)的物种，以及鳞翅目物种，包括但不限于：小菜蛾，例如美洲棉铃虫(helicoverpazeaboddie)；大豆夜蛾，例如大豆尺夜蛾以及黎豆毛虫，例如黎豆夜蛾(anticarsiagemmatalishübner)。[0369]用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如，czaplaandlang，(1990)j.econ.entomol.83：2480‑2485；andrews等人，(1988)biochem.j.252：199‑206；marrone等人，(1985)j.ofeconomicentomology78：290‑293以及美国专利no.5,743,477，所有这些文献全文以引用方式并入本文。一般而言，将蛋白混合并用于摄食测定。参见例如marrone，etal.，(1985)j.ofeconomicentomology78：290‑293(marrone等人，1985年，《经济昆虫学杂志》，第78卷，第290‑293页)。此类测定法包括将植物与一种或多种害虫接触以及测定植物存活和/或促使害虫死亡的能力。[0370]线虫包括寄生线虫比如根结、孢囊和根腐线虫，包括孢囊线虫属(heteroderaspp.)、根结线虫属(meloidogynespp.)和球异皮线虫属(globoderaspp.)；特别是孢囊线虫的成员，包括但不限于heteroderaglycines(大豆孢囊线虫)；heteroderaschachtii(甜菜孢囊线虫)；heteroderaavenae(禾谷孢囊线虫)以及globoderarostochiensis和globoderapailida(马铃薯孢囊线虫)。根腐线虫包括根腐线虫属物种(pratylenchusspp.)。[0371]种子处理剂[0372]为了保护并提高产率产量和性状技术，种子处理剂选项可提供另外的作物计划灵活性以及对于昆虫、杂草和病害的经济有效的防治。可用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和活化剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀乌剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物，对种子材料进行处理，通常进行表面处理。这些化合物通常与在配制领域中惯常使用的其它载体、表面活性剂或促进施用的助剂一起配制。包衣可以通过用液体制剂浸渍繁殖材料或通过用混合的湿或干制剂涂覆来实施。可用作种子处理剂的各种类型化合物的示例在由英国农作物保护委员会(britishcropproductioncouncil)出版的thepesticidemanual：aworldcompendium，c.d.s.tomlined.(《杀虫剂手册：世界纲要》，c.d.s.tomlin编辑)中提供，该文献据此以引用方式并入。[0373]可用于作物种子上的一些种子处理剂包括但不限于如下的一种或多种：脱落酸、阿拉酸式苯‑s‑甲基、阿维菌素、杀草强、氧环唑、固氮螺菌、印楝素、嘧菌酯、芽孢杆菌属物种(包括蜡样芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌(b.firmus)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、短小芽孢杆菌(b.pumilis)、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌物种中的一种或多种)、慢生根瘤菌属物种(bradyrhizobiumspp.)(包括甜菜慢生根瘤菌(b.betae)、加那利慢生根瘤菌(b.canariense)、埃氏慢生根瘤菌(b.elkanii)、西表岛慢生根瘤菌(b.iriomotense)、大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)、辽宁慢生根瘤菌(b.liaonigense)、地瓜慢生根瘤菌(b.pachyrhizi)和/或圆明慢生根瘤菌(b.yuanmingense)中的一种或多种)、克菌丹、萎锈灵、壳聚糖、噻虫胺、铜、氰虫酰胺、苯醚甲环唑、土菌灵、氟虫腈、咯菌腈、氟嘧菌酯、氟喹唑、解草胺、氟草肟、超敏蛋白、抑霉唑、吡虫啉、种菌唑、异黄酮、脂壳寡糖、代森锰锌、锰、代森锰、精甲霜灵、甲霜灵、叶菌唑、腈菌唑、pcnb、戊苯吡菌胺、青霉菌、吡噻菌胺、氯菊酯、啶氧菌酯、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、氯虫苯甲酰胺、s‑异丙甲草胺、皂苷、氟唑环菌胺、tcmtb、戊唑醇、噻苯哒唑、噻虫嗪、硫双灭多威、福美双、甲基立枯磷、三唑醇、木霉、肟菌酯、灭菌唑和/或锌。pcnb种子包衣是指epa注册号00293500419，含有五氯硝基苯和依得利。tcmtb是指2‑(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。[0374]可测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪种种子处理剂选项和施用率可补充此类品种和转基因性状以提高产量。例如，具有良好产量潜力但存在丝黑穗病易感性的品种可受益于提供防丝黑穗病的保护的种子处理剂的使用，具有良好产量潜力但存在胞囊线虫易感性的品种可受益于提供防胞囊线虫的保护的种子处理剂的使用，以此类推。同样地，涵盖赋予昆虫抗性的转基因性状的品种可受益于种子处理剂所赋予的第二作用模式，涵盖赋予除草剂抗性的转基因性状的品种可受益于用增强植物对该除草剂的抗性的安全剂进行的种子处理，等等。此外，由种子处理剂的适当使用所引起的良好根系建成和提早出苗可使得在与种子处理剂结合时包含特定性状的一个品种或多个品种更有效地使用氮、抵御干旱的能力更佳、以及产量潜力总体增加。[0375]用于杀灭昆虫害虫并防治昆虫种群的方法[0376]在一些实施方案中，提供了用于杀灭昆虫害虫的方法，该方法包括使所述昆虫害虫同时地或顺序地与杀昆虫有效量的重组ptip‑96多肽接触。在一些实施方案中，提供了用于杀灭昆虫害虫的方法，该方法包括使昆虫害虫与杀昆虫有效量的seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的重组杀虫蛋白或其变体接触。[0377]在一些实施方案中，提供了用于防治昆虫害虫种群的方法，该方法包括使昆虫害虫种群同时地或顺序地与杀昆虫有效量的重组ptip‑96多肽接触。在一些实施方案中，提seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的ptip‑96多肽或其变体的重组多核苷酸。[0380]昆虫抗性治理(irm)策略[0381]已证实，苏云金芽孢杆菌δ‑内毒素在转基因玉米植物中的表达是防治农业上重要的昆虫害虫的有效手段(perlak等人，1990年；1993)。然而，昆虫已进化成能抵抗在转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌δ‑内毒素。此类抗性如果广泛分布的话将明显限制包含编码此类苏云金芽孢杆菌δ‑内毒素的基因的种质的商业价值。[0382]增加转基因杀昆虫剂抵抗靶标害虫的效力并且同时降低具有杀昆虫剂抗性的害虫的发育的一种方法是，提供非转基因(即，非杀昆虫蛋白)庇护所(一部分非杀昆虫作物/玉米)以与产生对于靶标害虫有活性的单一杀昆虫蛋白的转基因作物一起使用。美国环境保护局(unitedstatesenvironmentalprotectionagency)(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm，可使用www前缀对其进行访问)公布了与产生对于靶标害虫有活性的单一bt蛋白的转基因作物一起使用的要求。此外，全国玉米种植者协会(nationalcorngrowersassociation)在其网站上：(ncga.com/insect‑resistance‑management‑ꢀfact‑sheet‑bt‑corn，可使用www前缀对其进行访问)也提供了有关庇护所要求的类似指南。由于庇护区域内的昆虫所造成的损失，较大的庇护所可降低总产量。[0383]增加转基因杀昆虫剂应对靶标害虫的效力并且同时降低具有杀昆虫剂抗性的害虫的发育的另一种方法将是，保有能有效抵抗昆虫害虫种群并通过不同作用模式显示其效应的杀昆虫基因的库。[0384]在植物中表达对相同的昆虫物种具有毒性的两种或更多种杀昆虫组合物(每种杀昆虫剂以有效水平表达)将是实现控制抗性发展的另一种方法。这是基于这样的原理：相比仅一种作用模式，针对两种单独作用模式更不可能进化出抗性。roush例如概括了双重毒素策略，也称为“金字塔堆砌”或“堆叠”，以用于管理杀昆虫转基因作物。(theroyalsociety.phil.trans.r.soc.lond.b.(1998)353：1777‑1786(英国皇家学会，《伦敦皇家学会哲学汇刊：b辑》，1998年，第353卷，第1777‑1786页))。各自能有效抵抗靶标害虫且具有很少或没有交叉抗性的两种不同蛋白的堆叠或金字塔堆砌可允许使用较小的庇护所。美国环境保护局要求所种植的非bt玉米的结构庇护所(一般5％)显著小于单一性状产品(一般20％)。提供庇护所的irm效应有多种方法，包括田间的多种几何种植模式和包装好(in‑ꢀbag)的种子混合物，如roush进一步讨论。[0385]在一些实施方案中，本发明的ptip‑96多肽可用作与其它杀虫蛋白组合的昆虫抗性治理策略(即金字塔堆砌)，所述其它杀虫蛋白包括但不限于bt毒素、致病杆菌属物种或发光杆菌属物种杀昆虫蛋白等等。[0386]提供了防治转基因植物中的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染的方法，所述方法促进了昆虫抗性治理，包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。[0387]在一些实施方案中，防治转基因植物中的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性治理的方法，杀昆虫蛋白中的至少一种包括对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的ptip‑96多肽。no：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的ptip‑96多肽或其变体以及cry蛋白。[0393]此外，提供了用于获得表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法，包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述昆虫测定结合数据表明，在此类昆虫中，ptip‑96多肽不与cry蛋白的结合位点竞争。此外，提供了用于获得表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的种植或商业化的监管批准的方法，包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述昆虫测定结合数据表明，在此类昆虫中，seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26；seqidno：28；seqidno：30、seqidno：32、seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50、seqidno：52、seqidno：54、seqidno：56、seqidno：58、seqidno：60、seqidno：62、seqidno：64、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76、seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92、seqidno：94、seqidno：96、seqidno：98、seqidno：100、seqidno：102、seqidno：104、seqidno：106或seqidno：108的ptip‑96多肽或其变体不与cry蛋白的结合位点竞争。[0394]用于增加植物产量的方法[0395]提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本文所公开的杀虫多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，以及在被害虫侵染的田间使该植物或其种子生长，其中所述多肽对所述害虫具有杀虫活性。在一些实施方案中，所述多肽对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫害虫具有杀虫活性，并且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫害虫侵染。[0396]如本文所定义的，植物的“产量”是指由植物产生的生物质的质量和/或数量。如本文所用，“生物质”是指任何被测量的植物产品。生物质产生的增加是被测量植物产品的产量上的任何改善。增加植物产量具有若干商业应用。例如，增加植物叶片生物质可以增加用于人或动物消费的叶菜类的产量。另外，增加叶片生物质可以用于增加植物衍生的药用或工业产品的生产。产量的增加可以包括任何统计学上显著的增加，包括但不限于与不表达杀虫序列的植物相比，产量增加至少1％、增加至少3％、增加至少5％、增加至少10％、增加至少20％、增加至少30％、增加至少50％、增加至少70％、增加至少100％或增加更多。[0397]在具体方法中，植物产量由于表达本文所公开的ptip‑96多肽的植物对害虫的抗性增强而增加。ptip‑96多肽的表达导致害虫侵染或采食植物的能力降低，从而提高植物产量。[0398]加工方法[0399]还提供了加工植物、植物部分或谷物以获得包含ptip‑96多肽的食物或饲料产品的方法。可加工本文提供的植物、植物部分或种子以产生油、蛋白产品和/或副产品，所述油、蛋白产品和/或副产品是通过加工获得的具有商业价值的衍生物。非限制性示例包括包含编码ptip‑96多肽的核酸分子的转基因种子，可加工所述转基因种子以产生大豆油、大豆产品和/或大豆副产品。[0400]“加工”是指用于获得任何大豆产品的任何物理和化学方法，并且包括但不限于热调节、压片和研磨、挤出、溶剂提取或水浸以及完整或部分种子的提取。[0401]以下实施例是以说明性而非限制性方式提供的。[0402]实验[0403]实施例1‑得自小翠云草(selaginellakraussiana)的杀昆虫蛋白活性的鉴定[0404]当在内部dupont‑pioneer数据库的小翠云草转录组中搜索pct公开wo2015/120270的编码ptip‑65杀昆虫多肽的多核苷酸序列时，使用blast(基本局部比对搜索工具；altschul等人，(1993)j.mol.biol.215：403‑410；另参见ncbi.nlm.nih.gov/blast/，其可使用wwwprefix前缀对其进行访问)鉴定出seqidno：9的氨基酸序列。使用转录组序列设计引物以克隆ptip‑96aacdna序列。该克隆使用kodhotstartdnapcr试剂盒(novagen，merckkgaa，darmstadt，germany)并将得自小翠云草(样品id.ps‑8780)的总rna作为模板通过聚合酶链反应产生。通过测序来确认所克隆的pcr产物。基于dna测序，ptip‑96aa多核苷酸序列示为seqidno：4并且所编码的多肽序列示为seqidno：9。[0405]在96‑孔板格式中，使用覆盖在基于琼脂的鳞翅目饲料(southlandproductsinc.，lakevillage，ar)上的得自小翠云草样品ps‑8780的植物组织蛋白质提取物对三种害虫物种即大豆夜蛾(sbl)(黄豆银纹夜蛾(chrysodeixisincludens))、玉米穗虫(cew)(谷实夜蛾(helicoverpazea))和欧洲玉米螟(ecb)(玉米螟(ostrinianubialis))进行生物测定。每个样品平行测定六次。使样品在饲料顶部上干燥并将2至5只新生昆虫置于经处理板的各个孔中。在27℃下孵育四天之后，对幼虫的死亡率或生长迟缓严重程度或进行评分。评分按数值记录为死亡(3)、生长极度迟缓(2)(很少或无生长但存活并且等同于1龄幼虫)、生长迟缓(1)(生长到二龄期，但不等同于对照)、或正常(0)。使样品经受蛋白酶k和热处理而导致活性损失，这表明有效成分为蛋白质性质。生物测定结果示于表1中。[0406]表1[0407]cewecbsblps‑8780蛋白质提取物ꢀꢀꢀ[0408]实施例2‑小翠云草的转录组测序[0409]如下制备得自样品id.ps‑8780的小翠云草的转录组。使用用于总rna分离的试剂盒从冷冻组织中分离总rna。使用得自inc.的truseqtmmrna‑seq试剂盒和方案(sandiego，ca)制备来自所得总rna的测序文库。简言之，mrna通过连接到寡聚(dt)磁珠来分离，片段化成180nt的平均大小，通过随机六聚体引物逆转录成cdna，进行末端修复，对3’加a尾，并与带有索引的truseqtm接头连接。使用truseqtm引物对连接的cdna片段进行pcr扩增，并在agilentdna7500芯片上检查纯化pcr产物的质量和数量。质量和数量评价后，通过用双链特异性核酸酶(duplexspecificnuclease，dsn)(moscow，russia)处理使100ng的转录物文库标准化。标准化通过添加200mmhepes缓冲液，之后在68℃下热变性并退火五小时来实现。退火的文库用2ul的dsn酶处理25分钟，根据制造商的方案通过柱纯化，并用接头特异性引物扩增十二个循环。用xp珠(beckmangenomics，danvers，ma)纯化最终产品，并在agilentdna7500芯片上检查的质量和数量。[0410]根据制造商的方案，在基因组分析仪iix上对标准化的转录物文库进行测序。在上利用克隆簇生成过程使各个文库杂交至两个流动槽通道并扩增、嵌段、线性化和杂交引物。测序在基因组分析仪iix上完成，每一标准化文库产生六千万个75bp双末端读长。[0411]实施例3‑ptip‑96多肽同源物的鉴定[0412]利用blast在蕨类及其它原生植物的内部dupontpioneer转录组数据库中表现的基因身份鉴定出ptip‑96aa多肽(seqidno：4)的同源物。表2示出了从中所鉴定的ptip‑96aa多肽同源物和生物体。在一些情况下，从在表2中示为“混合物1”、“混合物3”和“混合物4”的蕨类分离物和/或物种的合并样品鉴定出同源物。合并样品中的蕨类植物在表3中示出。[0413]表2[0414][0415][0416]表3[0417][0418][0419]cdna通过由总rna逆转录从具有鉴定的同源物的原始生物体产生或者基于由转录组装配而成的序列合成。使用设计用来编码各个同源物的序列的引物使编码ptip‑96同源物的cdna衍生的基因从其相应cdna中pcr扩增并亚克隆到植物瞬时表达载体中。通过测序来确认所克隆pcr产物。[0420]如在needle程序(emboss工具组合)中实现的，用needleman‑ꢀwunsch算法计算的ptip‑96多肽同源物之间的氨基酸序列同一性百分比于表4a‑4e示为矩阵表。矩阵表的空白部分未示出。[0421]表4a[0422][0423][0424]表4b[0425][0426][0427]表4c[0428][0429][0430][0431]表4d[0432][0433][0434][0435]表4e[0436][0437][0438][0439][0440]实施例4‑通过蛋白质纯化鉴定ptip‑96同源物[0441]还可通过蛋白质纯化、质谱(ms)和pcr克隆对来自小翠云草或其它石松类和蕨类的ptip‑96多肽同源物进行鉴定。[0442]收集植物组织，在液氮中快速冷冻并在‑80℃下储存。在储存之后，在液氮温度下用geno球磨机((spex，metuchen，nj)将其研磨成细粉。为了提取蛋白质，向每5g鲜重组织中添加20ml的50mmtris缓冲液(ph8.0)、150mmkcl、2.5mmedta、1.5％聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)和蛋白酶抑制剂混合物(rochediagnostics，germany)。将匀浆离心以移除细胞碎片，过滤通过0.22um过滤器并用10mlzebaspin脱盐柱(thermoscientific，il.)脱盐。[0443]对于蛋白质纯化，将植物材料在液氮温度下用geno球磨机((spex，metuchen，nj)研磨成细粉。在100mmtris缓冲液(ph8.0)、150mmkcl、2.5mmedta、1.5％pvpp和蛋白酶抑制剂混合物(rochediagnostics，germany)中提取蛋白质。使提取的材料离心以移除细胞碎片，过滤通过(calbiochem)并将硫酸铵添加达至35％并使其平衡。对悬浮液进行离心并使所得沉淀物重新悬浮于较小体积的20mmtris缓冲液(ph8)中。在通过离心澄清之后，用在20mmtris缓冲液(ph8)中平衡的sephadexg25柱(ge，piscataway，nj)进行脱盐。将合并的经脱盐蛋白质级分装载到1mlmonoq柱(ge，piscataway，n.j.)上并用含线性(60cv(柱体积))梯度的0m至0.7mnacl的20mmtris(ph8.0)洗脱。混合对sbl和ecb呈活性的级分并脱盐到25mmmops(ph6.7)中。使用4cv线性梯度(0％缓冲液b)将活性级分装载到4mlmonop柱(缓冲液a：25mmmops，ph6.7；缓冲液b：polybuffer74，ph4)上，之后用15cv100％缓冲液b进行洗涤。[0444]在用胰蛋白酶消化蛋白质之后，通过ms分析进行蛋白鉴定。在经亮蓝g‑250染料染色的lds‑page凝胶上对样品进行电泳之后，获得供ms鉴定的蛋白质。从凝胶中切下目的条带，脱色，用二硫苏糖醇还原并然后用碘乙酰胺烷基化。在用胰蛋白酶消化过夜之后，在thermoqexactiveorbitrap质谱仪(thermofisherscientific)上通过纳米液相色谱/电喷雾串联质谱(nano‑lc/es‑msms)对样品进行分析，该质谱仪与eksigentnanolcultra1‑d和nano‑lc系统以及nanolc‑as2自动进样器(absciex)接口连接。使用mascot搜索引擎(matrixscience)，通过在包含来自源植物材料的转录物的内部转录组数据库和公开蛋白质数据库swiss‑prot中搜索nano‑lc/msms数据进行蛋白质鉴定。[0445]实施例5：在叶片和昆虫生物测定中瞬时表达[0446]利用在病毒启动子dmmv和/或atubq10控制下于瞬时表达系统中表达的ptip‑96多肽(dav等人，(1999)plantmol.biol.40：771‑782；norrissr等人(1993)plantmolbiol.21(5)：895‑906)。将农杆菌细胞悬浮液引入完整组织的植物细胞使得可以测量或研究可重复感染和后续植物来源转基因表达的农杆菌渗入方法是本领域熟知的(kapila，et.al.，(1997)plantscience122：101‑108(kapila等人，1997年，《植物科学》，第122卷，第101‑108页))。简而言之，用测试和对照菌株的正常化细菌细胞培养物对单叶期的矮菜豆(菜豆，phaseolusvulgaris)或大豆(glycinemax)进行农杆菌渗入。在4至7日后，从各个小植株切下叶圆片并单独用2只新生大豆夜蛾(sbl)(黄豆银纹夜蛾(chrysodeixisincludens))、2只新生玉米穗虫(cew)(谷实夜蛾(helicoverpazea))、或4只新生欧洲玉米螟(ecb)(玉米螟(ostrinianubialis))侵染。用仅包含dsred荧光标记(clontechtm，1290terrabellaave.mountainview，ca94043)表达载体的农杆菌生成对照叶圆片。所包括的得自未渗透植物的叶圆片作为第二对照。在侵染之后两(cew)或三(ecb，sbl，faw)天对绿色叶组织的消耗进行评分。瞬时表达的ptip‑96多肽保护叶圆片不被侵染的昆虫消耗，而对于阴性对照和未处理的组织则观察到完全的绿色组织消耗(表5)。nd＝未测定[0447]表5骤)。在这个步骤中，将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中以引发接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在该感染步骤之后，可将未成熟胚在固体培养基上进行培养。在这个共培养期之后，设想到任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加用于植物转化的选择剂(步骤3：静息步骤)。将未成熟胚在固体培养基上与抗生素一起培养，但不加选择剂，这为了消除农杆菌并为了受感染细胞的静息期。接着，将经接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植物。[0452]实施例7：大豆(glycinemax)的转化和再生[0453]使用bioradbiolisticpds1000/he仪器和质粒或片段dna，通过粒子枪轰击的方法(klein等人，nature(london)327：70‑73(1987)；美国专利no.4,945,050)生成转基因大豆品系。使用以下原液和培养基进行大豆植物的转化和再生：[0454]原液：[0455]硫酸盐100x原液：[0456]37.0gmgso4.7h2o、1.69gmnso4.h2o、0.86gznso4.7h2o、0.0025gcuso4.5h2o[0457]卤化物100x原液：[0458]30.0gcacl2.2h2o、0.083gki、0.0025gcocl2.6h2o[0459]p、b、mo100x原液：[0460]18.5gkh2po4、0.62gh3bo3、0.025gna2moo4.2h2o[0461]feedta100x原液：[0462]3.724gna2edta、2.784gfeso4.7h2o[0463]2，4‑d原液：[0464]10mg/ml维生素[0465]b5维生素，1000x原液：[0466]100.0g肌醇、1.0g烟酸、1.0g盐酸吡哆醇、10g盐酸硫胺素。[0467]培养基(每升)：[0468]sb199固体培养基：[0469]1包装ms盐(gibco/brl‑目录号11117‑066)、1mlb5维生素1000x原液、30g蔗糖、4ml2，4‑d(40mg/l终浓度)，ph7.0，2g结冷胶[0470]sb1固体培养基：[0471]1包装ms盐(gibco/brl‑目录号11117‑066)、1mlb5维生素1000x原液、31.5g葡萄糖、2ml2，4‑d(20mg/l终浓度)，ph5.7，8gtc琼脂[0472]sb196：[0473]上述原液1‑4各10ml、1mlb5维生素原液、0.463g(nh4)2so4、2.83gkno3、1ml2，4d原液、1g天冬酰胺、10g蔗糖，ph5.7[0474]sb71‑4：[0475]甘博格(gamborg)b5盐，20g蔗糖、5gtc琼脂，ph5.7。[0476]sb103：[0477]1pk.murashige&skoog盐混合物、1mlb5维生素原液、750mgmgcl2六水合物、60g麦芽糖、2g脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)，ph5.7。[0478]sb166：[0479]补充有5g/l活性炭的sb103。[0480]大豆胚发生悬浮培养物的引发：[0481]在种植45‑55天后从可用的大豆植株挑取带有不成熟种子的豆荚，剥壳并放入无菌绛红色盒子中。将大豆种子在含有1滴ivorytm皂的5％溶液(即，95ml的高压灭菌蒸馏水加5ml和1滴皂，充分混合)中振摇15分钟，对它们进行灭菌。用2l无菌蒸馏水清洗种子，将小于3mm的种子各自放在单独的显微镜载玻片上。切开种子的小的一端，将子叶挤出种皮。将子叶转移到含有sb199培养基的平板(每个平板25‑30个子叶)2周，然后转移到sb12‑4周。用纤维带包住平板。这个时间后，切取次生胚并放入sb196液体培养基中7天。[0482]培养条件：[0483]将大豆胚发生悬浮培养物(栽培变种93y21)在100‑150rpm、26℃的回转摇床上保持在50ml液体培养基sb196中，光周期为16：8小时白天/黑夜，光强度为80‑100μe/m2/s。每7‑14天通过将最多1/2硬币大小数量的组织(组织块聚团在一起)接种到50ml新鲜液体sb196中，进行培养物继代培养。[0484]用于轰击的dna的制备：[0485]在粒子枪轰击程序中，可以使用纯化的1)整个质粒dna；或2)仅含有所关注的重组dna表达盒的dna片段。对于每十七次轰击转化，制备85μl悬浮液，其中含有每个dna质粒的每碱基对1至90皮克的质粒dna。按照如下方式将dna质粒或片段共沉淀到金粒子上。将悬浮液中的dna添加到50μl的10‑60mg/ml0.6μm金粒子悬浮液中，然后与50μlcacl2(2.5m)和20μl亚精胺(0.1m)混合。将混合物涡旋5秒，在微量离心机中短暂离心5秒，然后移除上清液。然后用150μl的100％乙醇洗涤dna‑ꢀ包被的粒子一次，涡旋并在微量离心机中短暂离心，然后重新悬浮于85μl的无水乙醇中。然后将5μldna‑包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。[0486]组织制备和用dna轰击：[0487]将大约100mg的两周龄悬浮培养物置于空的60mm×15mm培养皿中，用移液管从组织移除残余液体。将组织距离阻滞屏(retainingscreen)大约3.5英寸放置，每个平板的组织轰击一次。将膜破裂压力设定为650psi，并将室抽至28英寸汞柱的真空。轰击后，将每个平板中的组织分至两个培养瓶，放回进液体培养基中，并如上所述进行培养。[0488]转化胚的选择与植物再生[0489]轰击后，将每个经轰击的平板中的组织分放至sb196液体培养维持培养基的两个培养瓶(单位平板的经轰击的组织)。轰击后七天，用补充有100ng/ml选择剂的新鲜sb196培养维持培养基(选择培养基)更换每个培养瓶中的液体培养基。对于转化的大豆细胞的选择，所用选择剂可以为磺酰脲(su)化合物，其化学名为2‑氯‑n‑((4‑甲氧基‑6甲基‑1，3，5‑三嗪‑2‑基)氨基羰基)苯磺酰胺(常用名：dpx‑w4189和氯磺隆)。氯磺隆为dupont磺酰脲类除草剂中的活性成分。每两周更换一次包含su的选择培养基，进行8周。8周选择期之后，观察到绿色转化组织的岛状物从未转化的坏死的胚发生簇长出来。将这些推定转基因事件分离并保持在含有100ng/mlsu的sb196液体培养基中另外5周，并且每1‑2周更换一次培养基，从而产生新的无性繁殖的转化胚发生悬浮培养物。胚与su接触总共约13周。然后将悬浮培养物继代培养，并作为未成熟胚簇维持，并且还通过使单独体细胞胚成熟和萌发而再生成完整植株。[0490]在成熟培养基上四周(在sb166上1周，接着在sb103上3周)后，体细胞胚变得适于萌发。然后将其从成熟培养基中移除并在空培养皿中干燥至多七天。然后将经干燥的胚种植到sb71‑4培养基中，使它们在与如上所述相同的光照和温度条件下萌发。将萌发的胚转移到盆栽基质并生长至成熟以产生种子。[0491]实施例8‑转基因植物的粒子轰击转化和再生[0492]用含有编码杀昆虫蛋白的核苷酸序列的质粒对来自温室供体植物的未成熟玉蜀黍胚进行轰击。将穗去壳并在30％漂白剂加0.5％micro去污剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水清洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。采用如下的cacl2沉淀程序，将包含可操作地连接至启动子的编码杀昆虫蛋白的核苷酸序列的质粒载体dna沉淀到1.1μm(平均直径)钨小球上：100μl制备的钨粒子水溶液；10μl(1μg)dna/trisedta缓冲液(1μg总dna)；100μl2.5mcacl2和10μl0.1m亚精胺。[0493]将每种试剂依序加到钨粒子悬浮液，同时保持在多管涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理，并且让其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml100％乙醇洗涤，离心30秒。再次除去液体，将105ul的100％乙醇加到最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击，将钨/dna粒子进行短暂超声处理，并取10μl点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。将样品板在粒子枪中以水平#4进行轰击。所有样品接受650psi的单次射击，每管的制备粒子/dna共取十个等分试样。[0494]在轰击之后，将胚保持在560y培养基上2天，然后转移到含有3mg/l双丙氨膦的560r选择培养基，每隔2周进行传代培养。在进行大约10周的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288j培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2‑4周)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基进行萌发并转移到有光照的培养室。大约7‑10天后，将发育的小植株转移到管中的272v无激素培养基7‑10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的浅箱嵌块(insertsinflats)(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1周，随后在温室中另外生长1‑2周，然后转移到典型的600个盆(1.6加仑)并生长至成熟。通过本领域已知的测定法，如免疫测定和蛋白质印迹，监测植株并对ptip‑96多肽的表达进行评分。[0495]使用本领域已知的标准生物测定法，测试对杀昆虫蛋白表达呈阳性的转基因玉蜀黍植物的杀虫活性。此类方法包括例如根切除生物测定和整株植物生物测定。参见例如美国专利申请公布no.us2003/0120054和国际公布no.wo2003/018810。[0496]轰击培养基(560y)包含4.0g/ln6基础盐(sigmac‑1416)、1.0ml/leriksson维生素混合物(1000倍，sigma‑1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4‑d和2.88g/ll‑脯氨酸(用koh调至ph5.8后用去离子水定容)；2.0g/lgelrite(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基(560r)包含4.0g/ln6基础盐(sigmac‑1416)、1.0ml/leriksson维生素混合物(1000倍，sigma‑ꢀ1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l2，4‑d(用koh调至ph5.8后用去离子水定容)；3.0g/lgelrite(在用去离子水定容后加入)和0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨磷(均在培养基灭菌并冷却到室温后加入)。[0497]植物再生培养基(288j)包含4.3g/lms盐(gibco11117‑074)、5.0ml/lms维生素原液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)(murashige和skoog，(1962)physiol.plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l0.1mm脱落酸(调至ph5.6后用精炼去离子水定容)；3.0g/lgelrite(在用去离子水定容后加入)和1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(均在培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。无激素培养基(272v)包含4.3g/lms盐(gibco11117‑074)、5.0ml/lms维生素原液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至ph5.6后用精炼去离子水定容)和6g/lbacto‑agar(在用精炼去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。[0498]实施例9‑‑稳定转化的大豆和玉米植株对广谱鳞翅目昆虫的昆虫防治功效[0499]从转化的植物切下叶圆片并测试ptip‑96多肽对大豆夜蛾(sbl)(黄豆银纹夜蛾)、玉米穗虫(cew)(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(ecb)(玉米螟(ostrinianubialis))、绒毛豆毛虫(vbc)(黎豆夜蛾(nticarsiagemmatalis))和秋夜蛾(草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda))的杀昆虫活性。[0500]以上对本公开各种例示性实施方案的描述并不是穷举的或者将范围限制于所公开的精确形式。尽管具体的实施方案以及实施例出于说明性目的在本文进行了描述，但相关领域的技术人员将认识到，各种等同修改形式都可能在本公开的范围内。本文中提供的教导可以适用于除上述实施例之外的其它目的。因此，根据上述教导进行的许多修改和改变也在所附的权利要求的范围内。[0501]根据以上具体描述可以作出这些变化和其它变化。一般来讲，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将范围限制为说明书和权利要求书中所公开的具体实施方案。[0502]
背景技术：
：、具体实施方式和实施例中所引用的每篇文献(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、手册、书籍或其它公开内容)的全部公开内容均以引用的方式全文并入本文。[0503]已作出努力以确保所使用的数据(例如，数量、温度、浓度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另外指明，份数是重量份，分子量是平均分子量；温度以摄氏度计；并且压力为大气压或接近大气压。当前第1页12当前第1页12