一种烟草多分枝、矮化基因及其应用

1.本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种烟草多分枝、矮化基因及其 应用。


背景技术：

2.植物生长发育过程中，分枝的发生对根的生长模式以及茎和花序的形态都 具有非常重要的作用(klee,2008)。植物分枝发育影响植物茎叶的空间结构，合 理的分枝有利于植物适应不同的生长环境(domagalska and leyser,2011)。在番茄 和马铃薯的叶原基腋部，顶端分生组织(sam)在发育初期就分化出分生组织 细胞群(auldridge et al.,2006)。基于这些观察，gregor schmitz提出了sam主导 侧生分生组织形成(bartsch and schmitz,2003)。在拟南芥中，腋生分生组织只能 在sam转为生殖生长之后才能检测到，在根、下胚轴、茎、叶上的不定芽可能 发育为芽，说明分生组织也可能从部分或完全分化的细胞中产生。由于主芽顶 端对侧芽的抑制作用，使得腋芽向侧枝进一步发育。在腋生分生组织(am)形 成之后，分枝发育与植物随后的发育过程紧密相关(azizi et al.,2015)。
3.不同的植物其分枝形成过程也不相同。在有的植物中，am在叶腋处形成后 会直接发育成分枝；而在另一些植物当中，am形成后会进入休眠状态，在一定 的生长条件和环境条件下，am会打破休眠发育成分枝(bartsch and schmitz, 2003)。植物的分枝受遗传和环境因素的影响，植物主要的分枝方式有单轴分枝、 合轴分枝、二叉分枝、假二叉分枝和分蘖(beveridge et al.,2009)。烟草属于典型 的假二叉分枝。
4.烟草作为一种经济作物，主要以收获叶片为主。在烟叶大田生产的现蕾期， 通过打顶去掉顶部花序部分，以使养分向叶片集中供给。但打顶以后，植株顶 端优势丧失，导致腋芽快速生长，产生大量侧枝，消耗大量的营养物质。为了 抑制腋芽快速生长带来的养分流失，在生产中采取人工抹杈或者使用抑芽剂的 方法来控制腋芽生长，造成生产成本升高和对环境的污染。
5.因此，鉴定和分离出烟草腋芽发育相关基因，研究其功能，不仅有利于在 分子水平上解析烟草腋芽发育机理，而且对于通过抑制腋芽发育基因来调控侧 枝发育的少分枝烟草的育种具有重要意义，为烟叶生产的减工增效、降低农药 残留、提升烟叶质量等方面提供新的方法和研究方向。


技术实现要素：

6.针对现有烟草品种的生产由于需要人工抹杈或使用抑芽剂来控制腋芽，具 有高成本和不环保的问题，本发明提供了分离出一种烟草多分枝、矮化基因 ntmab4以及含有该基因的重组载体、重组宿主细胞，该ntmab4基因的突变或 过表达促进了烟草腋芽的生长，使烟草矮化且分枝增多，可利用该基因通过基 因工程的方法培育不需要人工抹杈或使用抑芽剂的少分枝、农业高效的烟草品 种，为控制提高烟草产量提供新的研究方向。
7.本发明的技术方案具体如下：
8.第一方面，本发明提供一种烟草多分枝、矮化基因，该基因的序列具有：
9.(1)seq id no：1或2中的任何一个核苷酸序列或者其互补序列；
10.(2)与(1)的核苷酸序列具有至少90％、尤其是至少95％或98％或99％ 序列同一性的核苷酸序列；
11.(3)与(1)或(2)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严 格杂交条件下杂交的核苷酸序列。
12.本发明利用烟草t-dna激活标签插入突变体库，在突变群体中发现了一个 多分枝、矮化的突变植株，对其命名为mab4(more axillary branches 4)，并对 这个突变株系进行分子生物学研究。通过侧翼序列扩增以及共分离分析确定插 入位点，根据插入位点附近基因的表达情况，确定突变基因，并将其命名为 ntmab4，并对该基因进行具体研究，确定其应用前景和应用方式。
13.本技术要求保护的烟草多分枝、矮化基因基因不仅包括序列为seq id n0:1 和seq id n0:2的核苷酸序列(ntmab4-s1和ntmab4-t1)及其互补序列，还 包括在所述序列上进行进一步的碱基优化或修饰，但是依然能编码基本相同功 能的蛋白的其他核苷酸序列。
14.由于上述基因在随着植物基因组的复制过程中是容易发生突变，因而上述基 因的突变体也在本技术请求保护的范围内。上述基因ntmab4不仅包括具有如 seqidno:1或seqidno:2所示的核苷酸序列，还包括与seqidno:1或seqidno:2 序列同源性至少达到95％的突变序列。更优选的，所述突变序列有96％、97％、 98％或99％与上述ntmab4-s1和ntmab4-t1天然序列相同，且能编码具有相 同的活性或功能的蛋白。上述突变序列可为点突变、缺失突变或添加突变，相 对于最初的核苷酸序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、 9个、10个或更多核苷酸可发生变化。
15.本文中“具有”的涵义为：所述基因可以是序列仅为如seqidno:1或 seqidno:2所示的核苷酸序列，还可以是在如seqidno:1或seqidno:2所示的核 苷酸序列的基础上进行修饰加工得到的衍生序列，如在基因序列两端添加酶切 位点、增强子等基因元件或各类标签序列。
16.其中，本技术的序列ntmab4-s1表达的蛋白序列如seq id n0:7，序列 ntmab4-t1表达的蛋白序列如seq id n0:8。
17.第二方面，本发明提供一种重组载体，其包含上述基因ntmab4的多核苷 酸序列，所述重组载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。所 述重组载体包括现有的各种克隆载体和表达载体，不限于本发明的实施例中采 用的具体载体。
18.第三方面，本发明提供一种重组宿主细胞，其包含所述基因ntmab4的多 核苷酸序列或上述的重组载体，或它的基因组中整合所述基因ntmab4的多核 苷酸序列。所述宿主细胞可以选自植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细 胞，农杆菌细胞，优选植物细胞，最优选烟草细胞。所述细胞可以是分离的、 离体的、培养的、或者是植物的一部分。
19.优选地，所述细胞为大肠杆菌或农杆菌细胞。
20.第四方面，本发明还提供一种培育少分枝、农业高效品种的方法，所方法 为：通过防止或抑制烟草中ntmab4基因的表达，或者对ntmab4基因进行敲 除，构建烟草ntmab4基因的沉默或敲除植株。通过诱变烟草中ntmab4基因， 筛选烟草ntmab4基因表达终止的突变体。
21.第五方面，本发明还提供一种所述烟草多分枝、矮化基因在培育少分枝、 农业高
效烟草品种中的应用。
22.优选地，所述应用包括：
23.(1)通过rna沉默技术，对权利要求1所述的烟草多分枝、矮化基因的 核苷酸序列进行基因工程操作，抑制沉默其表达，培育少分枝、农业高效烟草 新品种；
24.或(2)通过基因编辑技术，对权利要求1所述的烟草多分枝、矮化基因的 靶标核苷酸序列进行基因编辑，敲除阻断其表达，培育少分枝、农业高效烟草 新品种；
25.或(3)通过tilling技术，对权利要求1所述的烟草多分枝、矮化基因 的序列片段筛选ems突变体库，获得其表达终止突变体，培育少分枝、农业高 效烟草新品种；
26.或(4)通过pcr技术，对权利要求1所述的烟草多分枝、矮化基因的序列 片段筛选片段缺失突变体库，获得其缺失突变体，培育少分枝、农业高效烟草 新品种。
27.第六方面，本发明提供一种鉴定烟草多分枝、矮化基因的特异引物对，所 述特异引物对包括序列依次分别如seq id no：3和seq id no：4所示的 ntmab4s1-f1和ntmab4s1-r1、以及序列依次分别如seq id no：5和seq idno：6所示的ntmab4t1-f1和ntmab4t1-r1。
28.第七方面，本发明提供一种烟草多分枝、矮化基因的鉴定方法，其包括以 下步骤：
29.以提取的待鉴定烟草的基因组为模板，以上述的特异引物对作为引物进行 pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测，并对扩增产物进行测序，将测序结果与 烟草多分枝、矮化基因的序列比对，即可得到鉴定结果。
30.本发明的技术方案具有以下有益效果：
31.1、本发明提供筛选到的一株多分枝、矮化的突变体植株，为烟草腋芽发育 的分子机制研究提供了很好的材料。更重要的是在烟草中确定了一个新的调控 腋芽发育的基因，并确定该基因属于烟草atⅲ氨基酸转移酶基因家族。
32.2、本发明克隆并验证了基因ntmab4的功能，该ntmab4基因的突变或过 表达促进了烟草腋芽的生长，使烟草矮化且分枝增多，可利用该基因通过基因 工程技术和育种技术培育不需要人工抹杈或使用抑芽剂的少分枝、农业高效的 理想型烟草新品种，为烟叶生产的减工增效、降低农药残留、提升烟叶质量提 供新的方法和研究方向。此外，上述基因的研究也可对其它作物分枝研究具有 借鉴作用。
33.3、本发明还提供了鉴定烟草多分枝、矮化基因的特异引物对，便于对携带 所述多分枝、矮化基因的重组载体、重组宿主细胞和转基因植株进行快速准确 的鉴定。
附图说明
34.图1为本发明的ntmab4基因的分离和鉴定方法的流程图；
35.图2为红大和突变体mab4株高变化；
36.图3为侧翼序列扩增结果；
37.图4为c1221插入位点的共分离结果；
38.图5为sc162插入位点的共分离结果；
39.图6为候选基因的位置；
40.图7为候选基因表达分析结果：
41.图8为ntmab4基因的扩增结果；
42.图9为ntmab4-s1与ntmab4-t1蛋白序列比对结果；
43.图10为pjet1.2/blunt载体转化结果；注：1-8泳道为ntmab4-s1；9-16 泳道为ntmab4-t1；
44.图11为p1300-35s过表达载体转化结果；
45.图12为转基因苗阳性鉴定结果；
46.图13转基因阳性植株表型；其中，a：空白载体转基因苗，b：转ntmab4-s1 基因阳性苗；a：a植株局部图，b：b植株局部图；
47.图14为ntmab4基因的不同突变程度的转基因阳性苗的表型；a-d都是突 变苗；
48.图15为不同突变程度的转基因阳性苗中ntmab4-s1基因的表达量。
具体实施方式
49.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳 动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中， 若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实 施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
50.如图1所示，本发明利用t-dna激活标签插入突变群体和烟草基因组数据 库等资源，筛选多分枝、矮化类型的烟草t-dna插入突变体，对突变体进行遗 传分析，通过侧翼序列扩增、共分离分析、候选基因表达分析等方法，确定目 的基因，并对基因功能进行研究。具体步骤和方法见以下具体实施例。
51.实施例一烟草多分枝、矮化突变体mab4的表型鉴定
52.1、植物材料：
53.选用供体亲本红花大金元(简称红大)和t-dna激活标签t1代突变体株 系mab4作为试验材料，红花大金元种子由中国农业科学院烟草研究所种质资源 库提供；mab4突变体由烟草行业基因资源利用重点实验室创建的烟草突变体库 提供，该突变体库是通过t-dna激活便签载体pski015插入方式所构建。
54.供试材料按照托盘育苗方法进行育苗。30天之后，将烟苗假植到32孔假植 盘内，放在烟草研究所温室内培养。两周之后将烟苗移至即墨烟草试验基地温 室中。
55.2、仪器与设备：32孔假植盘，育苗基质，佳能5ds照相机，卷尺
56.3、试验方法
57.观察红花大金元和t1代mab4突变体在整个生育期内的腋芽表型，利用佳 能5ds照相机对植株生长情况进行拍照。在旺长期，统计mab4突变体植株3 个株系共300棵单株中有无突变表型的植株数目。分别在移栽后30天、60天、 90天、120天、150天、180天，用卷尺测量并记录红花大金元和有突变表型的 mab4突变体的株高。
58.4、结果与分析
59.烟草多分枝、矮化突变体mab4是由t-dna激活标签插入引起的突变，t1 代是性状分离的一代。在大田种植了三个株系，每个株系有100棵植株，对它 们的表现型进行统计分析，三个株系的卡方值χ2均小于χ20.05，无显著性差异， 符合3:1的理论分离比例，由此可以证明：该突变为单基因引起的显性突变。
60.与红大相比，突变体植株从苗期就能看出明显差别。在移栽之前，突变体 mab4和
野生型红大没有明显的表型差异。但是在移栽后30天，与同时期红大 相比，突变体mab4在叶基近轴侧出现了腋芽。在移栽后60天，mab4主茎基部 的腋芽开始生长，腋芽发育成两片小叶，同时，其他部位的腋芽也开始萌发， 而红大主茎腋芽并未萌发。移栽180天之后，突变体mab4的腋芽大部分生长在 中下部并且发育成了侧枝。红大在整个生长周期内，腋芽的发育似乎一直处在 休眠状态。这些结果表明，ntmab4基因的突变促进了腋芽的生长。
61.表1烟草mab4突变体的表型统计
[0062][0063]
如图2所示，通过对突变体mab4和红大在不同阶段的株高进行测量统计， 结果发现，在移栽之前，二者株高大致相同，在移栽后60天，突变体mab4植 株高度与红大有了明显差距。随着烟株的生长发育，突变体mab4植株垂直生长 变慢，与红大的株高差距越来越大。这说明，mab4基因的突变引起了突变体的 矮化。
[0064]
实施例二烟草ntmab4突变基因的筛选及鉴定
[0065]
明确了mab4突变体的表型特征，需要对引起表型发生变化的基因进行筛选 研究。本试验采用tail-pcr的方法扩增特异序列，根据共分离和荧光定量分 析确定目的基因。
[0066]
试剂及试剂盒：
[0067]
cwbio植物基因组dna提取试剂盒、植物rna提取试剂盒、反转录试 剂盒、rtaq酶、kod酶、takara荧光定量反应聚合酶试剂盒。
[0068]
1、侧翼序列扩增
[0069]
(1)实验方法
[0070]
本试验使用tail-pcr(thermal asymmetric interlaced pcr)的方法对t-dna 激活标签两侧的片段进行扩增。以t1代阳性植株dna作为模板，根据pski015 特异性嵌套引物sp1、sp2、sp3，及随机引物ad，进行三次pcr扩增，每 次反应体系如下：
[0071]
设定pcr反应程序：
[0072][0073]
将经过三步pcr反应扩增所获得的产物，进行电泳试验，因为小于500bp 的片段多为载体序列，很难分析出有效的侧翼序列信息，所以将条带大于500bp 的产物进行切胶回收并送测序，将测序结果在烟草基因组数据库中进行blast比 对分析，确定t-dna插入位
置。
[0074]
(2)实验结果及分析
[0075]
扩增产物的电泳结果见图3，由于sp3引物距离t-dna插入序列的边界大 约为450bp，而且测序前后两端的序列可信度不高，所以选取大于500bp的片 段测序(图4中用框标记的片段)，才能得到有效的序列。将8个样品切胶送测 序，将测序结果在烟草基因组数据库中进行blast比对分析，结果得到了两个插 入位点，分别为c1221和sc162。
[0076]
2、共分离分析
[0077]
(1)实验方法：
[0078]
根据插入位置上游和下游基因组1000bp序列设计一对基因组特异性引物 gf/gr，根据t-dna插入序列设计一个特异性引物tp并与gr组成一对引物 (表2)，分别进行两次pcr反应，判断植株是纯合突变还是杂合突变以及证明 插入位置的准确性。pcr反应体系与程序参照常规pcr反应。
[0079]
表2共分离实验引物
[0080][0081]
(2)实验结果及分析
[0082]
根据两个插入位点上下游序列设计共分离引物，以红大为对照进行共分离 实验。
[0083]
a、c1221插入位点的共分离实验结果如图4所示，c1221插入位点的基因 型和表现型不能匹配，大部分有突变体表型的植株利用tp和gr引物不能扩增 出条带，部分没有突变体表型的植株能够扩增出条带。通过该结果基本可以断 定此插入位置并不是导致突变的插入位置。
[0084]
b、sc162插入位点的共分离实验结果如图5所示，根据该电泳结果得知： sc162插入位点的基因型和表现型能够相匹配。没有突变表型的植株利用tp和 gr引物均不能扩增出条带，而利用gf和gr引物均能扩增出条带；纯合突变 体仅以tp和gr为引物时有条带产生；杂合突变体则能产生两条带。这说明 sc162就是引起突变体表型变化的目标插入位点。
[0085]
对整个株系100个植株的共分离实验统计，结果发现，纯合基因型植株数 为22，杂合基因型植株数为51，野生型植株数为27，卡方值χ2＝0.74《χ20.05 ＝3.84，无显著性差异，符合1:2:1的理论分离比例，这同样验证了此突变是单基 因控制的显性突变。
[0086]
3、候选基因的确定
[0087]
(1)实验方法：
[0088]
通过侧翼序列分析和共分离确定目标插入位置，利用gbrows工具对其插入 位点上下游100kb内的基因进行检索，获取插入位点旁侧候选基因。
[0089]
(2)实验结果及分析：
[0090]
根据共分离分析得知sc162为目标插入位点。在普通烟草基因组数据库中， 利用gbrows工具对插入位点附近100kb以内的基因进行检索，获得了六个旁 侧候选基因，分布如图6所示。
[0091]
基因分布于插入位点的左右两侧。左侧有三个基因分别为l1，l2，l3；l1 基因距离插入位点最近，距离为13kb；l3基因距离插入位点最远，距离为70kb。 右侧有两个基因分别为r1和r2，距离插入位点分别为35kb和41kb。r0基因 启动子区域与插入位点重合。
[0092]
4、候选基因的表达
[0093]
(1)rna提取
[0094]
在温室以相同的栽培方法与管理条件种植纯合突变体与红花大金元，在旺 长期分别取突变体与红花大金元的新鲜叶片和腋芽，并用锡箔纸包好迅速置于 液氮中保存。使用takara植物rna小量提取试剂盒提取总rna，具体步 骤依据说明书进行。
[0095]
(2)cdna链的合成
[0096]
本试验采用takara primescript
tm ii 1st strand cdna synthesis kit反转录试 剂盒对提取的rna进行反转录，体系步骤参照说明书。反转录后的cdna保 存至-20℃冰箱。
[0097]
(3)荧光定量pcr确定目的基因
[0098]
参照实时荧光定量pcr引物设计原则，根据候选基因序列设计引物(表3)。 将cdna浓度稀释4倍后作为qrt-pcr(real-time quantitative reversetranscription-pcr)反应模板，以烟草管家基因ubiquitin-conjugating enzyme e2 (ntubc2)作为内参，使用takara公司的荧光定量试剂盒(sybr premix extaq tm)进行qrt-pcr扩增，每个反应设计三个技术重复，体系和反应程序完 全参照说明书。利用abi 7500荧光定量分析软件分析试验数据。
[0099]
表3荧光定量pcr引物
[0100][0101][0102]
(2)试验结果与分析
[0103]
以野生型红大为对照，对六个候选基因在突变体mab4的腋芽和叶片组织中 表达分析结果见图7。从图7的结果可知，r0基因在突变体mab4腋芽中的表达 量大，约是在红大腋芽中的6倍，在突变体mab4叶片中的表达量大约是在红大 叶片中的9倍。而其他五个基因在突变体mab4和红大中表达量差异不大，因此 可以确定，引起突变的基因就是r0基因，将该基因命名为ntmab4。
[0104]
实施例三烟草ntmab4基因过表达载体构建及遗传转化
[0105]
本实施例将ntmab4基因转化进入野生型红花大金元中，观察其是否具有 突变体的表型。若能恢复突变体的表型，即可确定，该基因过量表达导致mab4 突变体植株矮化、分枝增多。
[0106]
1、过表达载体的构建
[0107]
(1)ntmab4基因的克隆
[0108]
实验方法：因为普通烟草为四倍体，由林烟草和绒毛状烟草共同进化而来， 所以根据林烟草特异性和绒毛状烟草特异性分别设计一对引物(表4)，将红花 大金元根、茎、叶cdna等比例混合，并稀释至50ng/μl，以此为模板用kod 高保真酶进行目的基因的扩增，两个目的基因分别命名为ntmab4-s1(林烟草 来源)和ntmab4-t1(绒毛状烟草来源)，使用takara dna片段纯化试剂盒纯 化pcr反应产物。
[0109]
表4 ntmab4基因扩增引物
[0110][0111][0112]
实验结果及分析
[0113]
根据图8的电泳结果可知，目的片段约为1800bp，扩增条带与目的条带大 小吻合。比较了这两个基因的蛋白序列(ntmab4-s1和ntmab4-t1)(结果见 图9)，发现二者存在13个氨基酸差异位点，将两个基因分别转入烟草中，观察 它们的表型是否不同。
[0114]
(2)pjet1.2/blunt载体构建
[0115]
使用pjet1.2/blunt试剂盒将纯化的dna片段连接到pjet1.2/blunt载体上， 将上述反应体系放在100μl离心管中混合均匀，在pcr仪中22℃反应30分钟。
[0116]
(3)pjet1.2/blunt载体转化大肠杆菌及阳性鉴定
[0117]
实验方法：将连接好的pjet1.2/blunt载体转化进入大肠杆菌中，待lb培 养基上长出大肠杆菌，在1.5ml离心管中加入1ml液体lb培养基和1μl氨苄 青霉素，在超净台中挑取单菌落，置于此离心管中，依次编号，放在37℃摇床 震荡5-6h，做菌液pcr检测目的片段。pcr体系和程序参照普通r-taq体系。 选取阳性菌株送华大基因测序。
[0118]
实验结果：
[0119]
挑取转化后的大肠杆菌单克隆菌落进行摇菌，ntmab4-s1和ntmab4-t1 各选8个进行菌落pcr阳性鉴定(图10)，ntmab4-s1有5个检测为阳性， ntmab4-t1有6个检测为阳性。ntmab4-s1和ntmab4-t1各选1个阳性菌株 摇菌，提取质粒。
[0120]
(4)p1300-35s过表达载体构建
[0121]
a、质粒提取
[0122]
根据上一步大肠杆菌阳性菌株测序结果，选取序列比对正确的菌株加入到6 ml的含有氨苄青霉素的lb液体培养基中过夜培养，进行质粒的提取。提取步 骤按照cwbio快速质粒小提试剂盒(quickpure plasmid mini kit)说明书进行。
[0123]
b、酶切和同源重组连接
[0124]
本试验采用同源重组的方法构建过表达载体，根据infusion引物设计原则设 计两组引物(表5)，以质粒为模板，利用kod高保真酶扩增目的片段。
[0125]
表5目的片段扩增引物
[0126][0127]
对p1300-35s过表达载体进行sacⅰ和xbaⅰ双酶切，将kod扩增的产物 和双酶切的产物使用takara dna片段纯化试剂盒进行纯化，然后进行连接反应。 连接时kod扩增的产物和酶切后的p1300-35s载体各取2μl加入到离心管中， 再向离心管中加入1μl的5
×
infusion连接酶，轻轻混匀，于pcr仪中50℃反 应15分钟。
[0128]
2、p1300-35s过表达载体转化大肠杆菌及阳性鉴定
[0129]
(1)实验方法：
[0130]
取1μl p1300-35s过表达载体连接产物，用移液枪轻轻打入到大肠杆菌感受 态dh5α中，转化方法同4.1.4.3，但要注意的是，转化的大肠杆菌抗性是卡那 霉素。对转化后的大肠杆菌进行阳性检测，选取阳性菌株送华大基因测序。
[0131]
(2)实验结果及分析
[0132]
ntmab4-s1和ntmab4-t1各选8个进行菌落pcr阳性鉴定(结果见图 11)，ntmab4-s1有6个检测为阳性，ntmab4-t1有7个检测为阳性。ntmab4-s1 和ntmab4-t1各选1个阳性菌株提取质粒。
[0133]
3、农杆菌转化
[0134]
将上一步测序准确的大肠杆菌过夜培养并使用cwbio高纯度质粒提取试 剂盒提取质粒。按照电机转化的方法将该质粒转到到农杆菌感受态细胞 lba4404中，将取转化后溶液100μl涂在含有kan和rift抗性的yeb培养板 上。放在28℃培养箱中倒置培养48h。
[0135]
待农杆菌长成单菌斑后，在1.5ml离心管中加入含有kan和rif的yeb培 养基1ml。每个载体挑取8个农杆菌单菌斑置于离心管中，放在28℃摇床上过 夜培养(12h)。第二天进行菌液阳性检测。
[0136]
对ntmab4-s1和ntmab4-t1基因转化的农杆菌挑取单克隆，进行菌落 pcr阳性鉴定。在鉴定的10个菌落中，全部检测为阳性，而且条带明亮无拖尾。 随机各选取一个鉴定为阳性的菌落进行下一步侵染操作。
[0137]
4、农杆菌介导的烟草遗传转化
[0138]
(1)普通烟草无菌苗的培养
[0139]
农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化需要无菌的烟草叶片，因此在转化之前需 要培养烟草无菌苗。在超净工作台中，对红花大金元的种子进行灭菌处理，在 ms培养基上25℃恒温培养40天左右，选择叶色浓绿、生长健壮的无菌苗待 用。
[0140]
(2)农杆菌介导的烟草叶盘转化
[0141]
利用叶盘转化法使重组载体转化烟草，在分化培养基中应加入潮霉素作为 抗性
筛选。操作步骤完全参照现有的烟草叶盘转化法进行。
[0142]
(3)烟草转基因苗的阳性鉴定及表型分析
[0143]
1)实验方法
[0144]
本试验采用植物叶片直接pcr试剂盒进行转基因苗的阳性检测，具体步骤 如下：
[0145]
使用剪过的枪头作为打孔器取直径5-7mm叶片组织到100μl离心管中。 向离心管中加入50μl buffer p1。盖好离心管盖，将其置于pcr仪中，95℃裂 解10min。加入50μl buffer p2，用移液器吸打混匀。所得裂解混合液可直接作 为模板进行pcr反应。根据载体片段与连入的基因片段设计阳性鉴定引物 jc-f、jc-r(表6)。
[0146]
表6转基因苗阳性鉴定引物
[0147][0148]
pcr反应体系：
[0149][0150]
pcr反应程序同常规pcr程序。
[0151]
2)实验结果及分析
[0152]
以空白载体转基因苗作为对照，分别对ntmab4-s1和ntmab4-t1转基因 烟草苗进行阳性鉴定分析，如图12的结果表明，ntmab4-s1转基因阳性率比较 高，大部分阳性植株都有多分枝、矮化的表型出现，少部分阳性植株未出现多 分枝、矮化的表型，推测过表达载体转入植株之后未表达。
[0153]
从图13的结果可知：对转基因苗的表型进行分析，发现ntmab4-s1和 ntmab4-t1转基因阳性苗表型没有差别，这说明这两个基因都具有生物学功 能。以空白载体转基因苗作为对照，发现过表达ntmab4-s1和ntmab4-t1基因 的转基因阳性苗能够产生与mab4突变体相同的表型，植株腋芽增多并且矮化。
[0154]
(4)ntmab4基因在转基因阳性苗中的表达量
[0155]
1)实验方法：
[0156]
以转入空白载体的烟苗为对照，对鉴定为阳性的烟苗的叶片进行目标基因 的相对表达量分析。rna提取、反转录、相对荧光定量等过程参见实施例二中 候选基因的表达的方法。
[0157]
2)实验结果
[0158]
对转基因阳性苗进一步观察显示，阳性植株虽然都具有突变表型，但他们 的突变程度不同，有些阳性苗不产生突变表型或者表型不明显，而有些转基因 阳性苗表型明显。
以空白载体转基因苗作为对照，在不同突变程度阳性植株叶 片中对ntmab4-s1基因做相对荧光定量分析。
[0159]
结果如图14和图15所示，空白对照表型与野生型一致；a植株虽然鉴定 为阳性，但是没有表现出突变体的表型，荧光定量显示其体内的ntmab4-s1基 因也并没有过量表达。b植株中ntmab4-s1基因表达量与对照相比有一定升高， 但是与c、d植株相比还有差距，腋芽也没有c、d植株上的多，这说明随着 ntmab4基因表达量增多，腋芽也相应增多，这个结果进一步证明了目标基因 ntmab4的过表达能够引起突变表型。
[0160]
实施例四 烟草多分枝、矮化基因ntmab4在烟草育种中的应用
[0161]
1、该基因的应用方式和应用范围
[0162]
基于ntmab4的上述研究基础上，确定该基因的功能后，可将该基因在以 下方面进行应用：
[0163]
(1)用于少分枝、农业高效烟草突变新品种的培育
[0164]
在ems化学突变体库中筛选ntmab4基因表达提前终止的突变体，或者在 物理诱变突变体库中筛选ntmab4基因的片段缺失突变体，通过诱变育种手段 培育少分枝、农业高效的烟草新品种。
[0165]
(2)用于常规烟草品种的少分枝性状改良品种的培育
[0166]
将ntmab4基因丧失功能的突变体与常规品种杂交，将突变基因导入常规 烟草品种，并通过多次回交，改良常规品种的分枝性状。
[0167]
(3)能用于常规烟草品种的基因工程改良品种的培育
[0168]
对常规品种中的ntmab4基因直接进行靶标核苷酸序列的基因编辑，敲除 阻断其表达，培育少分枝、农业高效的烟草基因工程改良品种。
[0169]
2、可通过以下多种不同的基因工程方法培育少分枝、农业高效(不需要进 行人工抹杈或者使用抑芽剂的方法来控制腋芽发生)的烟草品种的方法：
[0170]
(1)通过rna沉默技术，对本发明的烟草多分枝、矮化基因的核苷酸序 列进行基因工程操作，抑制沉默其表达，培育少分枝、农业高效烟草新品种。
[0171]
(2)通过基因编辑技术，对本发明的烟草多分枝、矮化基因的靶标核苷酸 序列进行基因编辑，敲除阻断其表达，培育少分枝、农业高效烟草新品种。
[0172]
(3)通过tilling技术，对本发明的烟草多分枝、矮化基因的序列片段 筛选ems突变体库，获得其表达终止突变体，培育少分枝、农业高效烟草新品 种。
[0173]
(4)通过pcr技术，对本发明的烟草多分枝、矮化基因的序列片段筛选片段 缺失突变体库，获得其缺失突变体，培育少分枝、农业高效烟草新品种。可以 理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明 构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利 要求的保护范围。