双位点嵌合巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原及其制备和应用

双位点嵌合巴氏杆菌plpe抗原表位的兔出血症病毒vp60重组抗原及其制备和应用
技术领域
1.本发明属生物医学技术领域，具体涉及一种嵌合了巴氏杆菌抗原表位的兔出血症病毒vp60重组抗原及其制备方法和应用。


背景技术：

2.兔病毒性出血症，俗称兔瘟，是由兔出血症病毒( rabbithemorrhagicdiseasevirus，rhdv) 引起的一种具有高度传染性、高发病率、高致死性的疾病，主要发生于 2 月龄以上成年兔。rhdv 衣壳蛋白 vp60 由 579 个氨基酸组成，是病毒衣壳组成的最基本单位。衣壳蛋白 vp60 是病毒的免疫保护性抗原，与诱导机体抗感染免疫直接相关，单独表达 vp60蛋白能够自聚成病毒样颗粒，由其制成的疫苗已经用于兔病毒性出血症的预防。
3.兔巴氏杆菌病（pasteurellosis）是主要由多杀性巴氏杆菌（pasteurella multocida）引起的一种危害养兔业的主要细菌性疫病。各种年龄、品种的家兔对于多杀性巴氏杆菌均易感，尤其2
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6月龄的家兔易感染发病，该病是造成9周龄到6月龄家兔死亡的主要疫病之一。目前已经有plpe等保护性抗原报道，动物实验显示出良好的免疫保护效力。
4.目前已经有兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联灭活疫苗用于同时防控兔病毒性出血症和兔巴氏杆菌病。但是该疫苗存在着生产成本偏高等、对巴氏杆菌病的免疫保护效果并不理想等问题。传统兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联灭活疫苗的制备工艺是先分别制备兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌灭活疫苗，再进行物理混合制成联苗。这种二联苗的生产过程需要经历两个疫苗的生产过程，耗费两份人工及物料、水电等，增加了生产成本。虽然近年来有使用基因工程亚单位疫苗（以vp60和plpe等为抗原）取代传统细菌或病毒灭活疫苗的趋势，但是目前基因工程二联亚单位疫苗的生产工艺依然需要经历分别制备单苗然后物理混合的过程，生产成本并未显著降低。因而将不同抗原及其表位嵌合连接在一起构成新抗原的方案正成为新的联苗发展方向，这将使二联疫苗生产过程简化，有效降低生产成本。
5.本发明的目的是将巴氏杆菌保护性抗原plpe的表位嵌合展示到兔出血症病毒vp60上，从而获得一种新的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联亚单位疫苗所需抗原。


技术实现要素：

6.本发明所解决的技术问题是：通过构建嵌合有巴氏杆菌保护性抗原plpe抗原表位的兔出血症病毒vp60重组蛋白抗原，获得一种只耗费一份人工就能够生产出对兔出血症病毒和巴氏杆菌都具有免疫保护作用的重组蛋白抗原，从而应用于兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联疫苗制备为了解决上述技术问题，本发明提供一种双位点嵌合了巴氏杆菌plpe抗原表位的兔出血症病毒vp60重组抗原，所述重组抗原包括兔出血症病毒vp60蛋白，且其n端和c端分别连接了plpe up多肽片段和plpe down多肽片段；其中，plpe up多肽片段和plpe down多
肽片段源自巴氏杆菌plpe蛋白抗原表位。
7.所述vp60蛋白n端和c端所嵌入的plpe抗原表位氨基酸序列分别为seq id no:1和seq id no:2。
8.编码所述vp60蛋白n端和c端所嵌入的plpe抗原表位核苷酸序列分别为seq id no:3和seq id no:4。
9.所述双位点嵌合了巴氏杆菌plpe抗原表位的兔出血症病毒vp60重组抗原氨基酸序列为seq id no:5；编码所述双位点嵌合巴氏杆菌plpe抗原表位的兔出血症病毒vp60重组抗原的核苷酸序列为seq id no:6。
10.此外，提供了一种重组抗原的表达载体，所述载体用于表达双位点嵌合了巴氏杆菌plpe抗原表位的兔出血症病毒vp60重组抗原，含有权利要求7所述核苷酸序列。
11.本发明所述双位点嵌合了巴氏杆菌plpe抗原表位的兔出血症病毒vp60重组抗原制备方法，其步骤如下：(1)通过pcr扩增巴氏杆菌plpe的第26位到第50位氨基酸所对应的dna序列、第51位到第95位氨基酸对应的dna序列;(2)将步骤(1)得到pcr产物依次分别连接到vp60基因的5’端和3’端上，并将重组基因连接到pfastbac1克隆位点上,得到重组穿梭质粒载体;(3)将步骤(2)得到的重组穿梭载体转化到dh10bac宿主菌中，通过该菌的转座作用获得杆状病毒质粒；（4）将重组杆状病毒质粒转入sf9细胞后获得嵌合了巴氏杆菌plpe表位的兔出血症病毒vp60重组蛋白抗原。
12.上述双位点嵌合了巴氏杆菌plpe抗原表位的兔出血症病毒vp60重组抗原在制备预防兔病毒性出血症和兔巴氏杆菌病疫苗方面的应用。
13.本发明的有益效果是：与现有技术相比，尽管目前现有技术采用兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌二联灭活疫苗或基因工程亚单位疫苗来同时防控兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病，但是传统二联苗的制备工艺是先分别制备两种疫苗再进行物理混合，二联苗的生产过程需要经历两个疫苗的生产过程，耗费两份人工及物料、水电等，增加了生产成本，且带来不同组分相互干扰的风险。虽然理论上兔出血症病毒结构蛋白vp60的n端和c端具有展示外源表位的能力，但既要尽可能多的展示外源表位（特别是亲缘关系比较远的细菌抗原表位），又要保证自身表位不受影响则面临较大的困难（目前技术条件下vp60蛋白n端和c端最长仅能展示合计为40个氨基酸左右的外源动物病毒表位）。本发明在分析巴氏杆菌保护性抗原plpe表位组成的基础上，通过将plpe表位集中分布的一段区域（长度合计70个氨基酸）分两段嵌合展示到兔出血症病毒vp60蛋白n端和c端，意外发现该重组抗原仍然具有血凝活性（即能够形成病毒样颗粒，兔出血症病毒病毒中和表位未受影响）。免疫保护力实验结果表明该重组抗原既对巴氏杆菌有免疫保护作用，又对兔出血症病毒具有免疫保护作用。
14.总之，本发明通过构建嵌合了巴氏杆菌保护性抗原plpe表位的兔出血症病毒vp60重组蛋白，获得了对兔出血症病毒和巴氏杆菌都具有免疫保护作用的重组抗原，为后期生产更低成本的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病疫苗提供了基础。
15.附图说明
16.图1为plpe的氨基酸残基构成b细胞表位能力预测结果(使用在线软件bepipred
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2.0（http://tools.immuneepitope.org/bcell/），预测分值高于0.5构成b细胞表位的几率较大)；图2 为plpe表位双位点嵌合vp60重组抗原的重组穿梭质粒载体构建过程示意图；图3为plpe表位嵌合vp60重组蛋白vp60
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plpe的表达情况，其中m表示分子大小标识； vp60
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plpe为杆状病毒
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昆虫细胞表达系统表达的vp60
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plpe重组蛋白（68 kda）；vp60表示杆状病毒
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昆虫细胞表达系统表达的兔出血症病毒vp60蛋白（60 kda）；图4为本发明所述plpe表位嵌合vp60重组蛋白后vp60
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plpe的血凝特性，左图为vp60
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plpe对人o型红细胞的凝集；右图为对照，即野生型杆状病毒培养物对人o型红细胞的凝集；图5为本发明所述plpe表位嵌合vp60重组蛋白vp60
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plpe与plpe高免血清的反应情况，其中m表示分子大小标识；vp60
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plpe为杆状病毒
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昆虫细胞表达系统表达的vp60
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plpe重组蛋白；vp60表示杆状病毒
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昆虫细胞表达系统表达的兔出血症病毒vp60蛋白；图6为免疫保护力实验中特异性抗体产生情况（a）和巴氏杆菌攻毒后小鼠的存活情况（b）图7免疫保护力实验中兔出血症病毒攻毒（a）和巴氏杆菌攻毒（b）后家兔的存活情况。
具体实施方式
17.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
18.实施例1：制备plpe表位嵌合的vp60重组蛋白(1)质粒、菌种及培养载体质粒pfastbac1、pfastbac1
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vp60 由本实验室构建并保存; e．coli dh5α 感受态购买自南京诺唯赞生物技术有限公司; e．coli dh10 bac 感受态购自上海唯地生物科技有限公司; 多杀性巴氏杆菌c51
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17株由本实验室保存提供；sf9 昆虫细胞由本实验室保存培养。
19.蛋白质氨基酸序列分析以genbank公布的多杀性巴氏杆菌c51
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17株的全基因组序列中的plpe基因序列为参考序列进行分析。使用bepipred
‑
2.0（http://tools.immuneepitope.org/bcell/）确定plpe的b细胞表位分布情况。
20.上述plpe的b细胞表位预测结果如图1所示:plpe一级结构共包含336个氨基酸残基。选择bepipred
‑
2.0软件默认的0.5作为氨基酸残基构成表位的阈值，预测结果表明plpe的表位主要分布于n端，特别是第26位
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105位氨基酸残基序列。因此本发明选择了将n端26位到95位氨基酸分段连接到兔出血症病毒vp60的n端和c端获得表位嵌合vp60，即本发明所述用作兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病疫苗制备的重组蛋白抗原,其氨基酸序列为seq id no :5.(3)重组杆粒构建以多杀性巴氏杆菌c51
‑
17株的plpe基因序列为参考序列，设计
引物plpeupf：5
’‑
aggcatgcggtaccaagcttatgtgtagcggtggtggcggt
‑3’
和plpeupr：5
’‑
gggctttgccctcatttgattgaaccggttgtgct
‑3’
用于扩增plpe的第26位到第50位氨基酸所对应的dna片段，plpedownf：5
’‑
ggcttttcttatgtcactccaatcaaacatcctatgactaatag
‑3’
和plpe downr：5
’‑
atcctctagtacttctcgacctatttttcttgttctagaggggcttg
‑3’
扩增plpe第51位到95位氨基酸所对应的dna片段。提取巴氏杆菌c51
‑
17菌株基因组并进行pcr扩增目的plpe基因片段。使用引物vp60f 5
’‑
atcaaatgagggcaaagcccgcaca
‑3’
和vp60r 5’ggagtgacataagaaaagccattggttgtg3’扩增pfastbac1
‑
vp60质粒载体制备vp60基因片段。使用引物pfastbacf5
’‑
gtcgagaagtactagaggatcataatcagcc
‑3’
和pfastbacr5
’‑
aagcttggtaccgcatgcc
‑3’
pcr扩增pfastbac1质粒载体制备线性化pfastbac1线性化载体。按照同源重组克隆试剂盒（诺唯赞，南京）说明书中的操作将plpe第26
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50位、第51
‑
95位氨基酸对应的基因片段分别连接到vp60基因的5’端和3’端上，然后将阳性重组质粒转入dh5α宿主菌。挑取阳性克隆pcr鉴定正确后送北京擎科新业有限公司南京分部测序，鉴定所克隆基因是否完整及是否正确连接到载体上,测序结果显示目的基因片段已经正确连接到载体上。提取阳性克隆质粒，按照e． coli dh10bac 感受态细胞说明书中的操作，将重组质粒转化到e． coli dh10bac 感受态细胞中并通过蓝白斑筛选和 pcr 鉴定获得确定阳性克隆，提取重组杆粒bacmid
‑
vp60
‑
plpe。所构建的重组杆粒如图2所示。
21.转染、表达与鉴定将bacmid
‑
vp60
‑
plpe通过脂质体 lipofectamin
tm
3000 转染至对数生长期的sf9 昆虫细胞。转染后每 12 h 观察 1 次，细胞病变明显时收集细胞及上清液，作为重组杆状病毒原液，4 ℃保存。将第 1 代病毒液反复冻融 3 次后以 1% 体积比接种 sf9 细胞，进行传代，得到第 2 代重组病毒。重复上述操作获得3代毒后将重组杆状病毒接种到对数期的悬浮sf9细胞中进行转瓶培养，培养约100h后收集培养物。反复冻融培养物3次后获得vp60
‑
plpe重组蛋白，进行sds
‑
page，考马斯亮蓝染色后进行观察，样品中存在约68kda的条带（图3），符合vp60
‑
plpe理论预测大小。
22.实施例2 双位点嵌合vp60
‑
plpe重组蛋白的血凝试验在50孔u型板上两个孔内分别加入vp60
‑
plpe和野生型杆状病毒培养物，每孔 50 μl。然后每孔加入 50 μl 1%人 o 型红细胞悬液，4 ℃作用30 min 后，观察血凝情况。结果表明vp60
‑
plpe重组蛋白存在明显的血凝现象（图4），即认为vp60
‑
plpe重组蛋白仍然可以形成兔出血症病毒样颗粒，有效展现兔出血症病毒中和表位。
23.实施例3双位点嵌合vp60
‑
plpe重组蛋白与plpe高免血清反应将vp60
‑
plpe重组蛋白和vp60重组蛋白（对照）进行sds
‑
page凝胶电泳后将蛋白转印到nc膜上。经过5%的脱脂乳封闭后，加入本实验室保存的1/500稀释的小鼠抗plpe血清，37℃孵育1 h；pbst漂洗5遍，加入1/10000稀释的hrp偶联的羊抗鼠igg，37℃孵育1 h； pbst漂洗5遍，进行ecl显色。western blot结果显示，vp60
‑
plpe泳道存在一条68 kda左右的条带（图5），但作为对照的vp60泳道则不存在符合预期大小的条带，这就表明vp60
‑
plpe重组蛋白能够与小鼠抗plpe血清发生特异性反应，即plpe部分免疫原性片段顺利整合到vp60上。
24.实施例4免疫保护力实验(1)小鼠免疫保护力实验取20 只 4
‑
6 周龄icr雌鼠，随机分成2组，1组对照，另一组实验，每组10只。实验组免疫vp60
‑
plpe重组蛋白：200μg/μl重组蛋白中加入20%体积铝胶
后，腹腔注射免疫小鼠，每只100μl。21天后加强免疫，剂量、方式等与初免相同。阴性对照组：pbs代替重组蛋白，使用的佐剂与实验组的佐剂相同。加强免疫10天后对所有小鼠尾静脉采血，确认已经产生高水平特异性抗体（图6a）以后，使用巴氏杆菌c51
‑
17株对小鼠皮下注射攻毒，每只50cfu左右（约5
×
ld50）。攻毒后小鼠的存活情况如图6b所示，对照组仅有2只小鼠存活，实验组小鼠存活8只。这就表明vp60
‑
plpe使小鼠具有了对巴氏杆菌攻毒的免疫保护力。
25.(2)家兔免疫保护力实验选取60只2
‑
3月龄健康易感家兔，随机分成6组，2组对照，另4组实验，每组10只。两个实验组免疫vp60
‑
plpe重组蛋白组：200mg/ml重组蛋白中加入20%体积的铝胶佐剂后皮下注射免疫家兔，每只1ml；另两个实验组免疫vp60和plpe重组蛋白的物理混合物（mixture），其中包含vp60重组蛋白和plpe重组蛋白各100mg/ml，加入20%体积的铝胶佐剂后免疫家兔。剩余两组作为阴性对照组：免疫pbs代替重组蛋白，使用的佐剂与实验组的佐剂相同。免疫3周后使用兔出血症病毒皖阜株对vp60
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plpe嵌合抗原免疫组、物理混合mixture组和一组对照组攻毒，100
×
ld50/只，连续7天观察家兔存活情况。免疫3周后使用巴氏杆菌c51
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17株对剩余vp60
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plpe嵌合抗原免疫组、物理混合mixture组和另一组对照组攻毒，100cfu（10
×
mld）/只，连续7天观察家兔存活情况。兔出血症病毒攻毒后实验组家（免疫vp60
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plpe嵌合抗原重组蛋白组和免疫两种蛋白物理混合物组）兔存活率100%，对照组全部死亡（存活率0/10，图7a）。巴氏杆菌攻毒后实验组家兔存活率100%，而对照组仅存活20%（图7b）。这些实验结果表明vp60
‑
plpe重组蛋白的免疫能使家兔同时对兔出血症病毒和巴氏杆菌的攻毒产生免疫保护作用，且vp60
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plpe重组蛋白具有与两种蛋白物理混合物疫苗相同的保护力。
26.实施例 5 工艺及耗时比较本专利所提供的嵌合抗原与两种蛋白混合物疫苗虽然具有相似的免疫保护效果，但是制备工艺差别明显。如表1所示，嵌合抗原制备过程不需要经历纯化抗原、内毒素去除、物理混合等步骤，制备时间缩短了50%，也不存在相应步骤的物料、水电消耗，生产成本显著降低，具有很好的应用前景。
27.表1制备工艺比较以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。