同时检测沙眼衣原体、淋病奈瑟氏球菌和解脲支原体的组合物及方法与流程

1.本发明属于核酸检测领域，更具体的涉及同时检测沙眼衣原体、淋病奈瑟氏球菌和解脲支原体的组合物及方法。


背景技术：

2.性传播疾病是一组以性接触为主要传播方式的疾病。一般而言，性传播疾病的传播途径主要有三种：直接性接触传播，间接接触感染和胎盘产道感染。由于性病的致病特征不同，一些被感染的患者通常没有明显的症状或无症状，因此很容易被忽略，许多患者直到出现并发症才去医院(tsevat dg，2017)。因此，漏诊诊断的比率非常高，尤其是在女性中。建立快速，准确和可靠的实验室诊断对性传播疾病的早期干预和治疗非常重要。在大多数国家，性传播疾病(std)的发病率仍然很高，在过去的二十年中，性病在中国也迅速流行。其中，淋球菌和非淋菌性尿道炎仍然是最常见的性传播疾病之一。其中沙眼衣原体(ct)和解脲支原体(uu)被认为是非淋菌性尿道炎的病原体，而淋病奈瑟氏球菌(ng)是淋球菌的代表。
3.性病的早期诊断是对患者进行早期干预和治疗的关键(hollier l.m.，2003)。它不仅可以提供进一步的诊断依据，有时还可以作为唯一的诊断依据，尤其是在感染者没有临床表现的情况下。目前，ct，ng和uu的诊断技术已从直接显微镜检测(nathan b，2015)，分离培养，生化鉴定和抗原抗体检测到病原体核酸诊断(nye mb，2009)发展起来。用于性传播疾病的早期筛查和诊断的分子生物学技术主要包括酶联免疫吸附测定(elisa)(oranje a.，1983)，链置换扩增，转录介导的扩增，pcr，分子信标等(muzny ca，2014)。还有多种实时pcr试剂盒可用于检测std病原体，但是，大多数普通的荧光pcr试剂盒只能检测一种病原体，检测效率低下。


技术实现要素：

4.1、发明目的。
5.本发明的目的是提供可以同时高效检测沙眼衣原体、淋病奈瑟氏球菌和解脲支原体的组合物。
6.2、本发明所采用的技术方案。
7.本发明公开了一种同时检测沙眼衣原体、淋病奈瑟氏球菌和解脲支原体的组合物，包括引物对和探针；
8.所述引物对包括：
9.所述引物对包括：
10.沙眼衣原体引物组c1f:gcaagatatcgagtatgcgttgttagg
11.c1r:ttcattgtactcattaaacgagcgg；
12.淋病奈瑟氏球菌引物组g1f:tatcggaacgtaccgggtagc
13.g1r:gtattaccgcggctgctggca；
14.解脲支原体引物组u6f1:ccaagttgaagttactttcccagatg
15.u6r1:5
‑
aggacggtcaccagtatttttaatg；
16.所述探针包括：
17.沙眼衣原体c1探针:lys(dabcyl)
‑
lys
‑
gctaaacaggtataga
‑
glu
‑
第一荧光基团；
18.淋病奈瑟氏球菌n1探针:
19.lys(dabcyl)
‑
lys
‑
gtccatggcagtagcc
‑
glu
‑
第二荧光基团；
20.解脲支原体u2探针：lys(dabcyl)
‑
lys
‑
tcaattaacgaggacc
‑
glu
‑
第三荧光基团，其中第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团发光颜色不同。
21.优选的，第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团从vic、ned、rox、texas red或fam中选择。
22.优选的，探针为：
23.沙眼衣原体c1探针:
24.lys(dabcyl)
‑
lys
‑
gctaaacaggtataga
‑
glu
‑
vic；
25.淋病奈瑟氏球菌n1探针:
26.lys(dabcyl)
‑
lys
‑
gtccatggcagtagcc
‑
glu
‑
ned或texas red；
27.解脲支原体u2探针：
28.lys(dabcyl)
‑
lys
‑
tcaattaacgaggacc
‑
glu
‑
fam。
29.本发明还公开了一种同时检测沙眼衣原体、淋病奈瑟氏球菌和解脲支原体的试剂盒，包含上述的组合物。
30.本发明还公开了一种同时检测沙眼衣原体、淋病奈瑟氏球菌和解脲支原体的方法，其步骤包括：
31.(1)取样，提取样品的基因组dna；
32.(2)以样品为模板，采用上述的组合物进行荧光定量pcr反应，以获得定量曲线，观察定量曲线中是否有沙眼衣原体c1探针、淋病奈瑟氏球菌n1探针和解脲支原体u2探针对应的荧光信号，如有，则表示对应的病原体呈阳性。
33.3、本发明所产生的技术效果。
34.本发明通过使用三种标记有不同染料和病原体特异性引物的荧光探针，在单个pcr管中可同时实时检测出ct，uu和ng。pcr引物的tm相似，没有明显的3'端重叠，可以增强多重扩增。在pcr反应过程中，通过pcr仪器的不同荧光通道检测并区分出不同的荧光信号，从而鉴定出不同的病原体。本发明pcr扩增和产物分析的整个过程均在单管的条件下进行，实验的整个过程只需在加入样品时打开反应管一次，可防止外界污染。在pcr的每个循环中，可实现扩增产物的实时动态检测和结果的自动分析。多重实时pcr具有高特异性和高灵敏度，检测限约为10个拷贝，符合试剂盒的检测标准。
附图说明
35.图1为实施例1中多重实时pcr的定量曲线。
36.图2为实施例1中凝胶电泳图。
37.图3为实施例2中凝胶电泳图。
具体实施方式
38.应该指出，以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本文所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
39.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：试验手册(new york：cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
40.除特殊说明外，本实验中使用的pcr试剂和材料均为生产厂家原创医疗的试剂。荧光pcr仪器是abi7000，abi7300和abi7500。引物均从tech dragon hong kong购买。将所有引物脱盐并纯化等级。荧光探针是从panagene订购的pna探针。通过测序确定所有pcr扩增产物确认分析。
41.实施例1
42.1、引物和探针的设计和合成
43.从genebank中找到ct/ng/uu基因组序列，并使用primer express 2.0软件搜索和设计pna探针和用于核酸扩增区域的pcr引物。设计主要考虑引物的tm值和二级结构，tm值应在60℃左右，目标基因应位于保守区域。最终设计的引物和探针的序列如表1所示。
44.表1设计的引物和探针
[0045][0046][0047]
表2可用于三重pcr的荧光染料组合
[0048][0049]
rox可以用texas red代替。
[0050]
2、取样，基因组dna的提取
[0051]
多重实时pcr分析法旨在检测宫颈，阴道和男性尿道拭子样本以及尿液样本中ct，ng或uu的存在，每种样本的数量：n＝200。不同的采样方法如下：男性：在男性尿毒症急性
期，通过常规消毒棉获得化脓性分泌物，在非急性期，用棉签轻轻插入尿道男性可以在吸收尿液分泌之前先吸1
‑
2个小时。前列腺按摩液可用于有前列腺症状的人。精液样品被取样。女性：成年女性患者首先用无菌试纸擦拭子宫颈分泌物，然后将另一张试纸或无菌棉签插入子宫颈约几秒钟，然后轻轻旋转并除去分泌物。女婴需要外阴脓性分泌物。
[0052]
将100μl样品加到带盖的适当试管中，以最大速度(>10000rpm)离心5
‑
10分钟，并使用带有已插入气溶胶屏障尖端的微量移液枪，小心地从每个管中移出并丢弃上清液，而不会干扰沉淀，并在试管之间更换吸头。之后，向每个试管中加入500μl洗涤液(pbs缓冲液)。剧烈涡旋并以10000rpm离心30s，从每个试管中取出上清液并丢弃，如有必要时，可以重复该步骤。将沉淀重悬于50μl dna洗脱液中，在100℃下孵育10分钟。将试管以12000rpm离心1分钟，取上清液，上清液中即包含准备扩增的dna。如果在提取的同一天未进行扩增，则可以将处理后的样品在2
‑
8℃下最多保存5天，或在
‑
20
°
/
‑
80℃下冷冻保存。
[0053]
3、多重实时pcr
[0054]
pcr体系：引物0.4μm，fam探针100nm，ned/vic探针200nm，mg2+4.0mm，dntp 0.2mm，缓冲液1.0x，taq酶0.5μl。样品dna。荧光pcr仪：abi7500。pcr循环条件：50℃2min，94℃2min，95℃20s，60℃60s；40个周期。结果如图1所示，图1中使用的dna样品为临床样品ct/ng/uu混合物。
[0055]
4、凝胶电泳，结果如图2所示。图2中使用的dna样品(从左至右)为临床样品ct/ng/uu混合物(2&10)，ng/uu混合物(3&11)，ct/uu混合物(4&12)，ct/ng混合物(5&13)和uu(6&14)，ng(7&15)和ct(8&16)单拷贝，泳道m为marker,泳道1和9为ntc(non
‑
template control空白对照)。
[0056]
实施例2
[0057]
制备了ng，ct和uu三种病原体质粒dna，并进行浓度梯度稀释，浓度梯度从1个拷贝到10000个拷贝。用三种病原体的混合引物对单一病原体dna进行扩增，pcr反应条件及凝胶电泳体系和实施例1一致。
[0058]
图3(a和b)分别显示了ng，ct和uu三种病原体dna的灵敏度检测电泳。所有三种病原体的dna拷贝数梯度分别为1拷贝，10拷贝和100拷贝(ng1、ng10、ng100代表反应中模板dna的数量分别为1、10、100个拷贝)。结果表明，多重pcr对ng的检测灵敏度为10个拷贝，对ct为1
‑
10个拷贝，对uu为1
‑
10个拷贝。