1.本发明属于医用材料的技术领域，具体涉及一种创面渗出液响应控释硫化氢的探针及其制备方法与应用。
背景技术：
2.皮肤直接与外部环境接触，是人体最大的器官，也是最大、最活跃的免疫器官，是人体的第一道防卫屏障。皮肤可以保护内部各种组织免受病原体、机械损伤和极端温度的伤害。此外，皮肤在体温调节、感官感知、维生素d合成以及避免外界伤害(包括紫外线、创伤和微生物)方面发挥着至关重要的作用。由于皮肤覆盖于人体最外层，因此，皮肤非常容易受到各种类型的损伤，如创伤、割伤、烧伤、化学损伤、溃疡和癌症等，这对患者和医疗保健经济都有重大影响。皮肤创面修复是一个十分复杂的生理过程，需要多种不同类型的细胞、趋化因子、细胞因子和生长因子按顺序错综复杂地进行调控。创面的愈合包括四个连续的阶段，即止血、炎症、增殖、重塑。
3.硫化氢(h2s)是继一氧化氮(no)和一氧化碳(co)之后发现的第三种内源性气体递质。硫化氢在心血管、神经、生殖和内分泌系统中具有多种生物学功能。此外，硫化氢还可以通过抑制氧化应激，减轻炎症，激活血管内皮因子，促血管生成等机制促进皮肤创面的修复。因此，以硫化氢供体作为前药用于皮肤创面的修复，可以代替口服硫化氢类药物，为创面修复提供有针对性的局部治疗。但是现有的材料难以实现硫化氢释放的实时自我监测，且释放过程可能产生毒副产物。
4.以硫化氢为基础的创面修复要求给药体系具有一定的特性，如可控释、适当的理化性质、良好的储存稳定性、实时自我监测及先进的传送系统。因此，为了实现硫化氢释放的实时自我监测，有必要开发制备简便、生物相容性好的硫化氢供体探针，构建新型硫化氢释放体系。
技术实现要素：
5.为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种创面渗出液响应控释硫化氢的探针及其制备方法。
6.本发明的另一目的在于提供上述探针的应用。所述探针用于制备创面修复材料或制剂，特别是渗出液响应控释硫化氢的创面修复材料。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种创面渗出液响应控释硫化氢的探针，为式i或式ii中一种以上；
[0009][0010]
式i、式ii中r各自为亚苯基、亚噻吩基(噻吩上失去两个氢的基团)、亚呋喃基、亚吡咯基、失去两个氢的磷杂环戊二烯；r1、r2为独立的氢、c1‑6烷基、c1‑6烷基氧基、c1‑6烷基硫基；
[0011]
优选地，其中波浪线表示连接位点；x为o、s、nh、ph，更优选x为s。
[0012]
所述探针优选为式i
‑
1或式ii
‑
1中一种以上；
[0013][0014]
r1、r2优选为独立的氢。
[0015]
此时探针为式i
‑
2或式ii
‑
2中一种以上；
[0016][0017]
所述创面渗出液响应控释硫化氢的探针的制备方法，包括以下步骤：
[0018]
1)将前体化合物溶于有机溶剂中，获得前体化合物溶液；将含s2‑
或hs
‑
的化合物配成溶液，获得含硫溶液；
[0019]
2)将前体化合物溶液与含硫溶液混合，获得探针；
[0020]
所述前体化合物的结构为式iii：
[0021][0022]
式iii中r，r1，r2如上述式i，式ii所定义；具体r为亚苯基、亚噻吩基(噻吩上失去两个氢的基团)、亚呋喃基、亚吡咯基、失去两个氢的磷杂环戊二烯；r1、r2为独立的氢、c1‑6烷基、c1‑6烷基氧基、c1‑6烷基硫基；
[0023]
优选地，其中波浪线表示连接位点；x为o、s、nh、ph；更优选r为x为s。
[0024]
x为s时，所述前体化合物结构为式iii
‑
1：
[0025][0026]
进一步地，r1、r2为独立的氢时，所述前体化合物的结构为式iii
‑
2：
[0027][0028]
所述含s2‑
或hs
‑
的化合物为能够溶于溶剂的含有s2‑
或hs
‑
的盐，优选为溶于水的含有s2‑
或hs
‑
的盐，如：硫化钠、硫氢化钠、硫化钾、硫氢化钾、硫化镁等。
[0029]
所述含硫溶液是将含s2‑
或hs
‑
的化合物溶于溶剂中，获得含硫溶液；所述溶剂为水。
[0030]
所述有机溶剂与含硫溶液的体积比为(60
‑
98)∶(40
‑
2)；优选为(90～98)∶(10～2)。有机溶剂与含硫溶液总体积满足100份。
[0031]
所述前体化合物与含s2‑
的化合物的摩尔比为(1
‑
2.5)∶1；所述前体化合物与含hs
‑
的化合物的摩尔比为(0.5
‑
1.5)∶1。所述含s2‑
或hs
‑
的化合物为含s2‑
的化合物和/或含hs
‑
的化合物。
[0032]
所述有机溶剂为能够溶解前体化合物的有机溶剂；优选为二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃中一种以上。
[0033]
本发明的探针通过水或含水的溶液触发硫化氢的释放；在触发硫化氢释放时，水在整个体系中体积占比≥70％，优先≥90％。
[0034]
所述探针用于制备创面修复材料或制剂，特别是渗出液响应控释硫化氢的创面修复材料。本发明的探针作为创面修复的药物。
[0035]
本发明的前体化合物用于制备离子响应材料，所述离子为s2‑
和/或hs
‑
。
[0036]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
[0037]
1、本发明的探针在水响应下可以实现快速高效的硫化氢释放及实时自我监测(本发明的探针通过其自身颜色的改变实现自我监测)。
[0038]
2、本发明的探针可以促进创面修复，修复效果好。
附图说明
[0039]
图1中(a)为前体化合物iii
‑
2在溶液中加入不同浓度na2s后的紫外
‑
可见光吸收光谱；(b)为随着na2s浓度增大，iii
‑
2在355nm处与580nm处的吸收相对值点线图；插图为iii
‑
2在溶液中加入0.5当量na2s前后的明场照片；
[0040]
图2中(a)为前体化合物iii
‑
2在溶液中加入不同浓度nahs后的紫外
‑
可见光吸收光谱；(b)为随着nahs浓度增大，iii
‑
2在355nm处与580nm处的吸收相对值点线图；插图为iii
‑
2在溶液中加入1当量nahs前后的明场照片；
[0041]
图3中(a)为前体化合物iii
‑
2及探针i
‑
2或ii
‑
2在dmso或水中的紫外
‑
可见光吸收光谱；(b)为iii
‑
2(1，4)、i
‑
2(2，5)或ii
‑
2(3，6)在dmso或水中的明场照片；
[0042]
图4中(a)为吸光度与硫化氢浓度关系的标准曲线；(b)为探针i
‑
2或ii
‑
2在水触发下释放硫化氢的浓度；
[0043]
图5为不同浓度na2s或前体化合物iii
‑
2处理24小时后l929细胞的细胞存活率；
[0044]
图6为空白组、对照组、探针i
‑
2组(0.5mmol/l组和1mmol/l组)的创面愈合过程图；
[0045]
图7为空白组、对照组、探针i
‑
2组(0.5mmol/l组和1mmol/l组)的创面在各时间点的愈合率柱状图；
[0046]
图8为空白组、对照组、探针i
‑
2组(0.5mmol/l组和1mmol/l组)的创面在各个时间点的h&e染色代表图，(b)为(a)中对应区域的放大图，黄线为正常组织与创面的分界线。
具体实施方式
[0047]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0048]
前体化合物iii
‑
2的制备：
[0049]
将5
‑
(4
‑
(二苯胺)苯基)噻吩
‑2‑
甲醛(354mg，1.0mmol)，2
‑
(3
‑
氰基
‑
4，5，5
‑
三甲基呋喃
‑
2(5h)
‑
亚甲基)丙二腈(301mg，1.5mmol)置于乙醇/四氢呋喃混合溶剂(体积比为6∶4)中，在氮气氛围下回流搅拌反应5h。反应结束后通过硅胶柱层析法进行纯化，即得到iii
‑
2，产率～59％。1h nmr(cdcl3，400mhz)：δ7.81(d，j＝16.0hz，1h)，8.20(dt，j1＝8.8hz，j2＝4.4hz，j3＝2.4hz，2h)，7.44(d，j＝4.4hz，1h)，7.34(d，j＝1.6hz，1h)，7.33
‑
7.28(m，4h)，7.19
‑
7.09(m，6h)，7.06(d，j＝8.8hz，2h)，6.62(d，j＝15.6hz，1h)，1.76(s，6h)；
13
c nmr(cdcl3，101mhz)：δ175.65，173.06，153.94，149.56，146.67，139.61，137.89，137.47，129.57，127.19，125.48，124.26，124.06，121.89，112.08，112.00，111.30，110.87，104.97，97.05，96.71，77.33，77.22，77.01，76.69，29.70，26.54.esi
‑
hrms：m/z[m+h
+
]理论c
34
h
25
n4os
+
，537.1749；实际，537.1735.
[0050]
iii
‑
2：
[0051]
实施例1
[0052]
探针i
‑
2的制备：
[0053]
称取10mg前体化合物iii
‑
2，用dmso溶解并配置成10.5mmol/l的溶液；称取5mg na2s，用超纯水溶解并配置成100mmol/l的溶液；取iii
‑
2的10.5mmol/l溶液950μl，加入50μl na2s的100mmol/l溶液并混合均匀即可获得探针i
‑
2。
[0054]
i
‑
2的结构为：
[0055][0056]
实施例2
[0057]
探针ii
‑
2的制备：
[0058]
称取10mg前体化合物iii
‑
2，用dmso溶解并配置成10.5mmol/l的溶液；称取5mg nahs，用超纯水溶解并配置成200mmol/l的溶液；取iii
‑
2的10.5mmol/l溶液950μl，加入50μl nahs的200mmol/l溶液并混合均匀即可获得探针ii
‑
2。
[0059]
ii
‑
2的结构为：
[0060][0061]
实施例3
[0062]
前体化合物iii
‑
2对s2‑
的响应：
[0063]
用超纯水将na2s配置成1.0mmol/l的母液，取该母液不同体积加入到含有前体化合物iii
‑
2的dmso/水混合溶液中。将溶液混合均匀并在室温下孵育0.5小时后，在紫外分光光度计上测试混合溶液的紫外
‑
可见光吸收光谱以研究前体化合物iii
‑
2对s2‑
的响应活性。前体化合物iii
‑
2的终浓度为10.0μmol/l，s2‑
的终浓度从0.0μmol/l逐渐增加为5.0μmol/l。
[0064]
图1中(a)为前体化合物iii
‑
2在溶液中加入不同浓度na2s后的紫外
‑
可见光吸收光谱；(b)为随着na2s浓度增大，iii
‑
2在355nm处与580nm处的吸收相对值点线图；插图为iii
‑
2在溶液中加入0.5当量na2s前后的明场照片。
[0065]
从图1可以看出，随着s2‑
浓度的逐渐增大，前体化合物iii
‑
2在580nm左右的特征吸收峰逐渐下降，与此同时在355nm左右的吸收值逐渐增大并形成新的吸收峰，355nm处与580nm处的吸收相对值呈现出增大的趋势。当加入0.5当量s2‑
后，前体化合物iii
‑
2在580nm
左右的吸收峰几乎完全消失。此外，随着s2‑
的加入，溶液的颜色由原来的蓝色逐渐变浅，最终变为无色，溶液颜色的变化也指示了前体化合物iii
‑
2与s2‑
的加成过程。结果表明，前体化合物iii
‑
2可与s2‑
高效加成。
[0066]
实施例4
[0067]
前体化合物iii
‑
2对hs
‑
的响应：
[0068]
用超纯水将nahs溶解并配置成1.0mmol/l的母液，取该母液不同体积加入到含有前体化合物iii
‑
2的dmso/水混合溶液中。将溶液混合均匀并在室温下孵育0.5小时后，在紫外分光光度计上测试混合溶液的紫外
‑
可见光吸收光谱以研究前体化合物iii
‑
2对hs
‑
的响应活性。前体化合物iii
‑
2的终浓度为10.0μmol/l，nahs的终浓度从0.0μmol/l逐渐增加为10.0μmol/l。
[0069]
图2中(a)为前体化合物iii
‑
2在溶液中加入不同浓度nahs后的紫外
‑
可见光吸收光谱；(b)为随着nahs浓度增大，iii
‑
2在355nm处与580nm处的吸收相对值点线图；插图为iii
‑
2在溶液中加入1当量nahs前后的明场照片。
[0070]
从图2可以看出，随着hs
‑
浓度的逐渐增大，前体化合物iii
‑
2的特征吸收峰逐渐下降，并在355nm左右逐渐形成新的吸收峰。当加入1当量hs
‑
后，前体化合物iii
‑
2在580nm左右的吸收峰几乎完全消失。此外，随着hs
‑
的加入，溶液的颜色由原来的蓝色逐渐变浅，最终变为无色，溶液颜色的变化也指示了前体化合物iii
‑
2与hs
‑
的加成过程。结果表明，前体化合物iii
‑
2可与hs
‑
高效加成。
[0071]
实施例5
[0072]
水响应h2s释放：
[0073]
取实施例1和2的探针i
‑
2或ii
‑
2，用dmso稀释成1.0mmol/l的母液(1mmol/l是指探针i
‑
2或ii
‑
2的浓度均为1mmol/l)分别取30μl该两种母液加到2970μl的dmso或超纯水中并混合均匀，在室温下孵育0.5小时后，用紫外分光光度计测试混合溶液的紫外
‑
可见光吸收光谱以研究它们解离并释放h2s的活性。i
‑
2或ii
‑
2的终浓度均为10.0μmol/l。
[0074]
参考上述方法，取相应体积实施例1或2中含有i
‑
2或ii
‑
2的产物(探针i
‑
2或ii
‑
2储存于实施例1或2中混合溶剂中)加入超纯水中，使它们的终浓度均为25μmol/l，用h2s检测试剂盒检测它们释放h2s的效率。
[0075]
图3中(a)为前体化合物iii
‑
2及探针i
‑
2或ii
‑
2在dmso或水中的紫外
‑
可见光吸收光谱；(b)为iii
‑
2(1，4)、i
‑
2(2，5)或ii
‑
2(3，6)在dmso或水中的明场照片；
[0076]
图4中(a)为吸光度与硫化氢浓度关系的标准曲线；(b)为探针i
‑
2或ii
‑
2在水触发下释放硫化氢的浓度。
[0077]
从图3可以看出，将i
‑
2或ii
‑
2加入到dmso中发现吸收峰仍在355nm左右，而580nm左右处对应于iii
‑
2自身的特征吸收几乎没有出现明显的吸收峰，这与实施例3的结果相吻合，表明i
‑
2或ii
‑
2在dmso中能稳定地存在。随后，将i
‑
2或ii
‑
2加入到水中后，发现355nm左右的吸收峰几乎完全消失，相应地在580nm出现新的吸收峰，且吸收光谱几乎与iii
‑
2在水中的吸收光谱重合，这表明水触发了i
‑
2或ii
‑
2解离转变成iii
‑
2并恢复了iii
‑
2的特征吸收峰。此外，由图3中(b)可以看出i
‑
2或ii
‑
2在dmso中均为无色，而将它们加入到水中后溶液的颜色变成了蓝色。因此，溶液颜色的改变也指示了i
‑
2或ii
‑
2的解离。
[0078]
从图4可以看出，在水触发下，25μmol/l的i
‑
2或ii
‑
2分别释放出16.4μmol/l和
16.0μmol/l的h2s，表明i
‑
2或ii
‑
2作为智能探针可以通过水响应高效地释放生理活性分子h2s。
[0079]
实施例6
[0080]
na2s及iii
‑
2的细胞增殖实验：
[0081]
将成纤维细胞l929接种到96孔板中，每个孔接种1万个细胞，在培养箱中培养12小时，然后在相应孔中加入含不同浓度na2s或iii
‑
2的培养基100μl并继续培养24小时。24小时后将上述培养基吸出并用pbs进行洗涤以去除细胞外的na2s或iii
‑
2，然后在每个孔中加入100μl的cck
‑
8工作液并进一步在培养箱中培养2小时。随后用多功能酶标仪测试450nm处的吸光度，并根据吸光度的比率计算细胞存活率。
[0082]
图5为不同浓度na2s或前体化合物iii
‑
2处理24小时后l929细胞的细胞存活率。
[0083]
从图5可以看出，na2s在0
‑
200μmol/l的浓度范围内对成纤维细胞l929有促增殖作用，且随着na2s浓度的增大，其促增殖效果呈增大趋势。iii
‑
2在0
‑
100μmol/l的浓度范围内对l929的存活率没有明显影响，表明iii
‑
2具有很好的生物相容性。
[0084]
实施例7
[0085]
硫化氢供体i
‑
2促大鼠创面修复实验：
[0086]
用海藻盐敷料膜在无菌条件下吸附浓度为0.5mmol/l及1mmol/l的硫化氢供体i
‑
2作为对照，用海藻盐敷料膜吸附相应体积的dmso。
[0087]
选用重150
‑
200g的6周龄sd大鼠，并随机分为4组：空白组，创面不做处理；对照组，用吸附dmso的海藻盐敷料膜处理创面；0.5mmol/l组，用吸附0.5mmol/l i
‑
2的海藻盐敷料膜处理创面；1mmol/l组，用吸附1mmol/l i
‑
2的海藻盐敷料膜处理创面。在大鼠背部左右两侧造出直径为10mm的创面后，将材料随机组合敷于创面并用敷贴对创面进行包扎。在术后0、3、7及14天观察记录创面愈合情况，并利用image j软件计算创面面积。分别在手术后3天、7天及14天将大鼠颈椎脱臼处死，将创面及周围部分正常组织取下置于4％多聚甲醛中固定，随后进行石蜡切片及苏木精
‑
伊红(h&e)染色以评估硫化氢供体i
‑
2促大鼠创面修复的效果。
[0088]
图6为空白组、对照组、探针i
‑
2组(0.5mmol/l组和1mmol/l组)的创面愈合过程图；
[0089]
图7为空白组、对照组、探针i
‑
2组(0.5mmol/l组和1mmol/l组)的创面在各时间点的愈合率柱状图；
[0090]
图8为空白组、对照组、探针i
‑
2组(0.5mmol/l组和1mmol/l组)的创面在各个时间点的h&e染色代表图，(b)为(a)中对应区域的放大图，黄线为正常组织与创面的分界线。
[0091]
从图6可以看出，在术后第3天0.5mmol/l组和1mmol/l组由于海藻盐敷料膜吸收创面组织渗出液触发h2s的释放并生成iii
‑
2，使海藻盐敷料膜变为紫黑色，指示了硫化氢的释放，实现自我监测。手术后7天，0.5mmol/l组和1mmol/l组的创面小于空白组和对照组，表现出明显的差异。
[0092]
从图7可知，手术后3天，0.5mmol/l组和1mmol/l组的愈合率分别为35.9％
±
1.5％和34.9％
±
1.5％，大于空白组和对照组。7天后，0.5mmol/l组和1mmol/l组的愈合率达到69.7％
±
6.4％和76.1％
±
5.2％，大于空白组和对照组的59.5％
±
2.0％和59.1％
±
4.4％；其中1mmol/l组的愈合率明显大于空白组和对照组。
[0093]
从图8可以看出，在术后第3天时，各组创面都被纤维蛋白凝块覆盖。其中，
0.5mmol/l组和1mmol/l组炎症细胞相对较少，而空白组和对照组创面处均有大量炎症细胞的存在，表明创面正处于严重的炎症反应中。此外，如图8(b)中红色箭头所示，0.5mmol/l组和1mmol/l组均观察到较多新生血管，创面正在通过血管运输大量的营养物质以加速其愈合；而空白组和对照组中几乎观察不到新生血管。这表明在创面修复的前期，智能探针i
‑
2能有效地抑制炎症反应并促进新生血管的生成。在术后第7天，0.5mmol/l组和1mmol/l组观察到了大量呈梭形的成纤维细胞的有序排列并产生大量的细胞外基质(ecm)，以及由创面底部发芽并向上呈襻状生长的血管，肉芽组织取代了最初的纤维蛋白凝块，表明创面进入了增殖期。此外，1mmol/l组血管数量较0.5mmol/l组减少且已有少量的胶原沉积(如图8(b)中绿色箭头所示)，表明创面正在从增殖期进一步发展进入重塑期。相比之下，空白组和对照组创面仍有炎症细胞的存在，其中形成了少量新生血管，表明创面愈合缓慢。对照组中观察到了排列较为规则的成纤维细胞，表明海藻盐敷料膜的强吸湿性有助于保持创面湿润的保护性环境，一定程度上加速了创面的愈合。在术后第14天，各组均已形成新的表皮组织，其中0.5mmol/l组和1mmol/l组的表皮已较为完整。如图8(b)中蓝色箭头所示，0.5mmol/l组和1mmol/l组创面中已形成新的腺体及毛囊组织，并有大量胶原沉积，尤其是1mmol/l组。0.5mmol/l组和1mmol/l组创面与周围正常组织已几乎没有明显差别。而空白组和对照组仅观察到成熟的肉芽组织，几乎看不到明显的胶原沉积，且该两组创面与正常组织之间的分界线仍清晰可见(如图8(a)中黄线所示)。
[0094]
本发明中有机溶剂的含量越高探针越稳定；水的含量在40％以下均可使硫化钠与前体化合物反应，但水含量越少加成效率越高；有机溶剂含量在90％以上(剩余为水)可低温保存。本发明的探针以混合溶液的形式低温储存和使用。
[0095]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。