水稻全育期半矮化表型调控基因SD38及其应用

水稻全育期半矮化表型调控基因sd38及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及水稻全育期半矮化表型调控基因sd38及其应用。


背景技术：

2.水稻是我国重要的粮食作物，约一半以上人口以大米为主食，因此，水稻产量直接关乎我国粮食安全性。随着科技的发展，特别是水稻基因组序列被测序，加速了产量性状调控基因的功能解析，增加了对水稻产量的分子机制调控网络的认知。水稻株高是理想株型的重要支撑性状，对水稻产量的提升起着决定性的作用。上个世纪60年代一大批矮杆基因的鉴定和利用，引导了水稻产量的第一次“绿色革命”，同时也加速了对矮杆相关基因的功能机制研究工作。截止目前，已经有超过60个水稻矮化突变体被鉴定了，但被克隆的与矮化相关的基因并不多(li et al.,2010)。由于矮化表型涉及到水稻整个生长发育阶段，与众多生理生化过程均有关联，因此，矮化的遗传机制还亟待进一步被挖掘。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种全新的水稻全育期半矮化表型调控基因sd38及其编码的蛋白。
4.本发明的另一个目的在于提供水稻全育期半矮化表型调控基因sd38及其编码蛋白在水稻育种中的应用。
5.本发明的再一个目的在于提供一种利用上述水稻全育期半矮化表型调控基因sd38及其编码的蛋白调控水稻株型的方法。
6.为了实现上述目的，本发明公开了一种水稻全育期半矮化表型调控基因sd38，其核苷酸序列如seq id no.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明发明人在西南大学水稻研究所籼型水稻恢复系缙恢10的甲磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate,ems)突变体库中筛选出了一个全育期均表现出半矮化表型的突变体 sd38(semi
‑
dwarf 38)，对其表型进行观察发现，sd38突变体的穗长和所有节间均显著短于野生型，有效穗数、粒长、粒宽等性状与野生型无显著差异。对其进行表型鉴定和组织学分析，结果表明细胞变短为sd38突变体半矮化的原因。通过图位克隆策略进行sd38基因鉴定，最终将编码一个定位在内质网上参与极长链脂肪酸(vlcfas)合成的β
‑
酮脂酰
‑
coa合酶 (β
‑
ketoacyl
‑
coa synthase，kcs)的基因loc_os10g33370确认为sd38基因，通过互补实验以及crispr/cas9突变体表型证实了sd38基因的单碱基突变是导致sd38突变体半矮化的原因。对sd38进行系统进化树分析和基因表达模式分析显示sd38基因在幼茎、分蘖芽和叶鞘中的表达量较高；与野生型相比，sd38突变体中脂质组代谢紊乱，内源c24:0 含量极显著降低；酿酒酵母中异源表达sd38基因能够促进c24:0含量的积累，表明sd38 参与c24:0 vlcfa的延伸，并影响体内脂质变化；sd38突变体中乙烯合成相关基因的表达量下调，乙烯合成前体acc的含量也极显著低于野生型；外源添加c24:0、acc和乙烯利均能在一
定程度上促进sd38突变体幼苗的伸长，且c24:0能够诱导诱导osacs3的表达，表明sd38通过介导c24:0 vlcfa的合成，调控osacs3的表达，从而促进乙烯的合成，影响水稻正常的形态发育。
8.本发明还公开了水稻全育期半矮化表型调控基因sd38编码的蛋白，其氨基酸序列如 seq id no.2所述。
9.本发明还开公开了上述水稻全育期半矮化表型调控基因sd38以及其编码蛋白在水稻分子育种中的应用。
10.本发明还公开了一种水稻株型的调控方法，所述方法通过调控水稻中c24:0 vlcfas的含量的方式来调控水稻的株高表型。
11.本发明的有益效果：本发明提供了一种水稻全育期半矮化表型调控基因sd38，该基因通过介导c24:0 vlcfa的合成，调控osacs3的表达，从而促进乙烯的合成，进而影响水稻正常的形态发育，为水稻高产育种提供了新的工具和方法。
附图说明
12.图1为野生型和sd38突变体的表型鉴定；其中，a：1个月的野生型和sd38突变体苗期植株，标尺＝5cm；b：拔节期的野生型和sd38突变体植株，标尺＝25cm；c：成熟期的野生型和sd38突变体植株，标尺＝30cm；d：野生型和sd38突变体的穗长和各节间长度，标尺＝8cm；e
‑
f：野生型(e)和sd38突变体(f)的上三片功能叶的基部，从左至右分别是剑叶，倒二叶和倒三叶，标尺＝3cm；
13.图2为野生型和sd38突变体剑叶基部显微观察；其中，a
‑
b：被叶鞘包裹的野生型(a) 和sd38突变体(b)的剑叶，标尺＝200μm；c：野生型和sd38突变体的全展剑叶，标尺＝5mm；
14.图3为野生型(wt)和sd38突变体地上部分的组织学分析；其中，a：3周龄的野生型(左) 和sd38突变体(右)叶鞘内表皮扫描扫描电镜图，标尺＝200μm；b：叶鞘内表皮薄壁细胞的长度统计，数值为平均值
±
标准差(n＝7)；c：野生型(左)和sd38突变体(右)抽穗期倒二节间中部的石蜡切片纵切图，标尺＝200μm；d：野生型wt和sd38突变体抽穗期倒二节间中部薄壁组织细胞的长度统计，数值为平均值
±
标准差(n＝10)；e：野生型(左)和sd38突变体 (右)拔节期顶端分生组织(sam)石蜡切片纵切图，红色箭头代表sam下面的第一个和第二个节间的区域，标尺＝200μm；f：野生型和sd38突变体sam下方节间面积统计，数值为平均值
±
标准差(n＝10)。student’s t
‑
test(*,p<0.05；**,p<0.01)被用来检测差异的显著性；
15.图4为sd38基因图位克隆；其中，a：sd38基因定位；b：拟南芥中和已报道的水稻 kcs家族成员的系统进化树分析，红色表示水稻中已报道的kcs蛋白；c：成熟期的野生型、sd38突变体和sd38
‑
com转基因植株，标尺＝25cm；d：sd38
‑
com互补植株的突变位点测序峰值图，黑色箭头指示的是sd38突变位点；
16.图5为sd38cas9突变体的表型；其中，a：sd38cas9
‑
1和sd38cas9
‑
2突变体的突变位点，红色字母表示sgrna靶序列；b：3周龄的野生型(zh11)、sd38cas9
‑
1和sd38cas9
‑
2 植株的形态，标尺＝3cm；
17.图6为sd38蛋白亚细胞定位与表达模式分析；其中，a：水稻原生质体中sd38
‑
gfp 融合蛋白的亚细胞定位，标尺＝10μm；b
‑
c：qrt
‑
pcr和rt
‑
pcr分析sd38在不同组织部位的表
达情况，数值为平均值
±
标准差(n＝3)；d
‑
h：茎、叶片、叶鞘、幼穗和成熟穗中gus染色检测，标尺＝1cm；
18.图7为sd38在酵母elo3敲除突变体的互补验证；其中，a：酿酒酵母by4741和分别转化了pyes2空载和pyes2
‑
sd38载体的by4741
‑
elo3酵母细胞在ypg培养基上的生长速率；b：酵母菌株在ypg液体培养基中的生长曲线；c：gc
‑
ms分析分别转化了pyes2 空载和pyes2
‑
sd38载体的by4741
‑
elo3酵母细胞体内的饱和vlcfas(c16
‑
c30)含量，数值为平均值
±
标准差(n＝3)；d：gc
‑
ms分析中的质谱图。student’s t
‑
test(**,p<0.01) 被用来检测差异的显著性；
19.图8为脂质组学鉴定到的脂类及其亚类统计；
20.图9为野生型和sd38突变体的脂质分析；其中，a：野生型和sd38突变体中脂质总含量； b
‑
g：不同种类甘油磷脂(glycerophospholipids,gp)的含量，包括磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine,pe)(b)，溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine, lysope)(c)，溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,lysolpc)(d)和它的亚类lysolpc (18:1)和lysolpc(20:4)(e)，磷脂酸(phosphatidic acid,pa)(f)和它的亚类(g)；h：甘油二脂(diglycerides,dg)含量；i：酰基谷甾醇酯(acylglcsitosterol ester,aglcsie)含量；j：辅酶(coenzymes,co)含量。数值为平均值
±
标准差(n＝3)，student’s t
‑
test(*,p<0.05； **,p<0.01)被用来检测差异的显著性；
21.图10为c24:0 vlcfa促进sd38幼苗伸长；其中，a：一个月龄的野生型、sd38突变体和互补转基因植株(sd38
‑
com)的vlcfas含量，数值为平均值
±
标准差(n＝3)；b：c16:0 和c24:0处理后的sd38突变体幼苗的表型，标尺＝5cm，数值为平均值
±
标准差(n＝10)；c：vlcfas合成抑制剂唑草胺(cafenstrole,cs)处理下野生型和sd38突变体幼苗的表型，标尺＝5cm，数值为平均值
±
标准差(n＝10)。student’s t
‑
test(ns,non
‑
significant；*,p<0.05； **,p<0.01)被用来检测差异的显著性；
22.图11为sd38幼苗乙烯合成缺陷；其中，a：野生型和sd38突变体中乙烯合成相关基因的表达，数值为平均值
±
标准差(n＝3)；b：wt和sd38突变体中1
‑
氨基环丙烷
‑1‑
羧酸 (1
‑
aminocyclopropane
‑1‑
carboxylicacid,acc)的含量，数值为平均值
±
标准差(n＝3)；c：野生型和sd38突变体幼苗的外源acc处理，标尺＝3cm，数值为平均值
±
标准差(n＝10)； d：野生型和sd38突变体幼苗的外源乙烯利(ethephon,eth)处理，标尺＝3cm，数值为平均值
±
标准差(n＝10)。student’s t
‑
test(ns,non
‑
significant；*,p<0.05；**,p<0.01)被用来检测差异的显著性；
23.图12为c24:0 vlcfa诱导osacs3的表达；其中，a：c24:0 vlcfa处理下乙烯合成相关基因的表达，数值为平均值
±
标准差(n＝3)；b：c24:0和唑草胺(cafenstrole,cs)处理下osacs3表达，数值为平均值
±
标准差(n＝3)。student’s t
‑
test(*,p<0.05；**,p<0.01) 被用来检测差异的显著性。
具体实施方式
24.下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。下述实施例仅用于阐明本发明，不应理解为对本发明的限制；下述实施例中的实验方法均为常规方法；下述实施例中所用
的材料、试剂均可从市面购买；下述实施例中所用的仪器设备均为分子生物学实验室常规仪器设备。在不背离本发明精神和实质的情况下，本领域技术人员对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
25.实施例1
26.1.材料与方法
27.1.1材料
28.1.1.1植物材料
29.本研究中半矮化突变体sd38来源于西南大学水稻研究所籼型水稻恢复系缙恢10的甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,ems)突变体库，经过连续多代自交，其半矮化表型稳定遗传。crispr/cas9突变体购置于百格生物公司。本研究中的所有材料，包括野生型、突变体、定位群体以及各种转基因植株正季均种植于重庆市北碚区歇马镇西南大学水稻研究所自然环境条件下，冬季均种植于温室和海南省陵水县南繁基地。
30.1.1.2菌种与载体
31.酿酒酵母菌株by4741和酵母敲除载体pug6购自杭州丰海生物科技有限公司。
32.1.1.3分子生物学试剂
33.乙烯合成前体氨基环丙烷羧酸(1
‑
aminocyclopropane
‑1‑
carboxylic acid，acc)、乙烯利和不同碳链长度的极长链饱和脂肪酸购自美国sigma公司。
34.1.2形态学观察
35.在全生育时期，不间断观察野生型和sd38突变体各形态特征变化并取材拍照。对成熟期的野生型和sd38突变体的株高、各节间长、有效穗、每穗粒数、结实率、粒长粒宽和千粒重等主要农艺性状进行统计，每组共统计10个生物学单株。
36.1.3组织学分析
37.1.3.1石蜡切片
38.取野生型和sd38突变体的顶端分生组织、倒二节间和剑叶基部样品放入提前装好faa 固定液(45％蒸馏水，45％无水乙醇，5％冰醋酸，5％福尔马林)的50ml离心管中，利用抽真空仪使样品沉到管底，4℃保存。
39.1.3.2扫描电镜
40.参考扫描电镜的常规方法。
41.1.4基因组dna的提取
42.参考基因组dna提取的常规方法。
43.1.5基因定位
44.配制西大1a
×
sd38的杂交组合，田间观察f1代表型并统计f2代群体中各性状分离情况，采用卡方检验正常表型和突变表型的分离比。利用f2代群体中的所有半矮化表型单株进行基因定位。基因定位用到的引物序列如下：
[0045][0046]
1.6候选基因的互补验证
[0047]
1.6.1互补载体构建
[0048]
根据ncbi网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)提供的参考序列，设计3对特异引物，包含sd38基因的起始密码子上游3364bp序列，整个编码框序列和终止密码子下游1683bp序列的片段。引物序列见下表:
[0049][0050]
以野生型缙恢10号的基因组dna为模板，用合成好的互补引物对分别扩增3个对应片段，1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的片段。ecori和hindiii限制性内切酶酶切植物表达载体pcambia1301，分别用ecori/kpni、kpni/bamhi和bamhi/hindiii酶切3个片段， 1％琼脂糖凝胶电泳分别回收酶切后的片段和载体骨架并用t4连接酶16℃过夜连接。转化连接产物至大肠杆菌dh5α的感受态，将筛选出的阳性单斑送测序。按照质粒提取试剂盒提供的操作步骤提取测序正确的单克隆菌株质粒即为sd38互补载体，
‑
20℃保存备用。
[0051]
1.6.2互补转基因植株的获得
[0052]
将sd38互补载体通过农杆菌介导的方式转化至sd38突变体的愈伤组织，经分化、筛选、生根等一系列组织培养操作技术获得sd38互补转基因植株。遗传转化操作过程由武汉伯远生物有限公司完成。阳性转基因植株种植于西南大学水稻研究所歇马基地，对其进行突变位点测序检测和目的性状的观察。
[0053]
1.7系统进化树分析
[0054]
从ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载sd38基因以及已被报道的水稻 kcs基因的全长氨基酸序列，从phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov)下载sd38基因在拟南芥中的同源基因蛋白序列。用mega 5中的最大似然法(1000次重复)构建系统发育树。
[0055]
1.8基因表达分析
[0056]
rna提取、cdna合成和实时定量检测(qrt
‑
pcr)操作流程参照1.3.8。使用到的定量
引物序列如下表。
[0057][0058]
1.8.1半定量(rt
‑
pcr)
[0059]
利用不同组织部位的rna样品反转录得到的cdna进行半定量分析。先利用action引物对各组织部位的cdna量进行确定，保证电泳条带亮度的一致性。在此基础上，用sd38
‑
rt 引物对确定好cdna量的不同组织部位进行pcr扩增。1％琼脂糖凝胶电泳分离出符合预期大小的条带并用凝胶成像分析系统进行拍照。
[0060]
1.8.2启动子+gus分析
[0061]
(1)启动子+gus检测载体引物设计
[0062]
参考ncbi网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)提供的序列，选取sd38基因起始密码子上游3502bp的片段为假定的启动子片段，设计的引物序列如下表：
[0063][0064]
(2)启动子+gus检测载体构建
[0065]
以野生型缙恢10号的基因组dna为模板，用合成好的启动子+gus载体引物扩增片段。用bamhi和ncoi限制性内切酶分别双酶切目的片段和植物表达载体pcambia1301，1％琼脂糖凝胶电泳分别回收酶切后的片段和载体骨架并用t4连接酶16℃过夜连接。转化连接产物至大肠杆菌dh5α的感受态，将筛选出的包含pcambia1301
‑
psd38
‑
gus的阳性克隆送测序验证，对测序正确的阳性克隆菌液保存并提取质粒
‑
20℃保存备用。
[0066]
(3)启动子+gus转基因植株的获得
[0067]
将构建好的pcambia1301
‑
psd38
‑
gus表达载体质粒送至武汉伯远生物公司完成遗传转化至野生型缙恢10号，对获得的阳性植株进行验证并种植于西南大学水稻研究所歇马基地。
[0068]
(4)组织部位的gus染色
[0069]
取阳性转基因植株的各组织部位，浸于gus染色液中，抽真空后37℃避光静置2h。
倒掉染色液，用75％乙醇脱色多次，直至脱色液颜色不再变化。对脱色完成的组织样品进行观察拍照。
[0070]
1.9亚细胞定位
[0071]
参考ncbi网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)提供的序列，选取sd38基因的编码序列设计引物(去掉终止密码子)，引物两端分别加上spei和ncoi酶切位点，以及保护碱基cgc，引物序列见下表。以野生型缙恢10号的cdna为模板，pcr扩增特异的目的片段并回收。用spei和ncoi限制性内切酶分别双酶切目的片段和表达载体pan580， 1％琼脂糖凝胶电泳后分别回收酶切后的片段和载体骨架并用t4连接酶16℃过夜连接。转化连接产物至大肠杆菌dh5α的感受态，将筛选出的包含pan580
‑
sd38的阳性克隆送测序验证，对测序正确的阳性克隆菌液保存并提取质粒
‑
20℃保存备用。
[0072][0073]
1.10激素和脂肪酸处理
[0074]
(1)材料处理
[0075]
将野生型和sd38突变体的种子对半剪开，去掉颖壳，保留含有胚乳的一半。在超净台上依次用灭菌的双蒸馏水，次氯酸钠溶液和75％的酒精清洗，最后浸泡在双蒸馏水中。将清洗干净的种子分别种植于提前配置好的ms固体培养基平板上，胚乳朝上。
[0076]
(2)1
‑
氨基环丙烷
‑1‑
羧酸(acc)和乙烯利处理
[0077]
配制ms固体培养基，在凝固之前分装到灭菌后的培养瓶中，并加入10μm acc (sigma
‑
aldrich,usa)或120μm乙烯利(sigma
‑
aldrich)，混匀。待培养基凝固后挑选胚芽长势一致的种子移栽至含有acc和乙烯利的ms固体培养基中，于无菌组织培养间生长10 天左右。每个处理重复3次。
[0078]
(3)脂肪酸和唑草胺(cafenstrole，cs)处理
[0079]
将脂肪酸(c16:0和c24:0,sigma
‑
aldrich)溶解于mtbe(solarbio)中，最后用灭菌的双蒸馏水配制成所需的浓度。唑草胺(sigma
‑
aldrich)溶解于氰化甲烷。挑选胚芽长势一致的种子移栽至含有50μm脂肪酸(c16:0和c24:0)和0.05μm唑草胺的ms固体培养基中，于无菌组织培养间生长10天左右。每个处理重复3次。
[0080]
1.11 1
‑
氨基环丙烷
‑1‑
羧酸(acc)含量测定
[0081]
取野生型和sd38突变体的苗期地上部分进行acc含量测定。测定工作由上海中科新生命生物科技有限公司进行。具体流程如下：
[0082]
(1)将样品液氮研磨，取100
±
5mg样品于2ml离心管中，加入30μl内标溶液，加入1ml乙腈水溶液(1％fa)，震荡混匀2min；4℃避光抽提12h，14000g离心20min，取上清液800μl，氮气吹干，用100μl乙腈水(1:1，v/v)复溶，14000g离心20min，取上清进样分析。
[0083]
(2)取标准品，用甲醇水溶液稀释为系列浓度的标准工作溶液，制备标准曲线溶液，用同位素内标法建立标准曲线。
[0084]
(3)样品采用waters i
‑
class lc超高效液相色谱系统进行分离。流动相：a液为0.05％ fa水溶液，b液为0.05％fa乙腈。样品置于4℃自动进样器中，柱温45℃，流速为400 μl/min，进样量2μl。相关液相梯度如下：0
‑
10min，b液从2％线性变化到98％；10
‑
10.1 min，
b液从98％线性变化至2％；11.1
‑
13min，b液维持在2％。样本队列中每间隔一定数量的实验样本设置一个混合样本(质控样本)，用于检测和评价系统的稳定性及重复性。
[0085]
(4)用5500qtrap质谱仪(ab sciex)在正/负离子模式下进行质谱分析。5500 qtrapesi源条件如下：source temperature 500℃，ion source gas1(gas1)：45，ionsource gas2(gas2)：45，curtain gas(cur)：30，ionsapary voltage floating(isvf)
‑
4500 v；采用mrm模式检测待测离子。
[0086]
(5)采用multiquant软件提取色谱峰面积及保留时间。根据标准曲线，计算样品中测得acc的含量。
[0087]
1.12脂质组分析
[0088]
取野生型和sd38突变体的苗期地上部分各5个生物学重复样品，由上海中科新生命生物科技有限公司进行脂质组分析。具体流程如下：
[0089]
(1)将样本于液氮研磨，在4℃环境缓慢解冻后，分别称量样本约50mg，依次加入 100μl水、200μl预冷甲醇、400μl二氯甲烷、120μl水，涡旋混合，室温放置20min， 8000g 10℃离心15min，取下层有机相，氮气吹干，质谱分析时加入100μl异丙醇溶液复溶，涡旋，8000g 10℃离心15min，取上清进样分析。
[0090]
(2)样品采用uhplc nexera lc
‑
30a超高效液相色谱系统进行分离。柱温45℃；流速300μl/min；进样量5μl。流动相组成a：10mm甲酸铵乙腈水溶液(乙腈：水＝6:4,v/v)，b：10mm甲酸铵乙腈异丙醇溶液(乙腈:异丙醇＝1:9,v/v)。梯度洗脱程序如下：0
‑
7min，b维持在30％；2
‑
25min，b从30％线性变化至100％；25.1
‑
30分钟，b 维持在30％。整个分析过程中样品置于10℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序，进行样本的连续分析。
[0091]
(3)分别采用电喷雾电离(esi)正离子和负离子模式进行检测。样品经uhplc 分离后采用q exactive plus质谱仪(thermo scientific
tm
)进行质谱分析。脂质分子和脂质碎片的质量电荷比，按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(ms2 scan，hcd)。ms1在m/z 200时分辨率为70000，ms2在m/z 200时分辨率为17500。
[0092]
(4)采用lipidsearch software version 4.1(thermo scientific
tm
)进行峰识别、脂质鉴定(二级鉴定)、峰提取、峰对齐，定量等处理。主要参数为：precursor tolerance: 5ppm，product tolerance:5ppm，product ion threshold：5％。提取得到的数据，删除rsd>30％的脂质分子。对lipidsearch提取得到的数据，删除组内缺失值>50％的脂质分子，对数据进行总峰面积归一化。应用软件simca
‑
p 14.1(umetrics,umea,sweden) 进行模式识别，数据经pareto
‑
scaling预处理后，进行多维统计分析。
[0093]
1.13饱和脂肪酸测定
[0094]
(1)取80
‑
100mg水稻样品加入到15ml离心管中，继续加入2ml 5％盐酸甲醇溶液， 3ml氯仿甲醇溶液(体积比1:1)，100微升十九烷酸甲酯内标。于85℃水浴锅中水浴1小时。水浴完成后，等温度降到室温，在离心管中加入1ml正己烷，震荡萃取2min之后，静置一小时，等待分层。取上层清液100微升，用正己烷定容到1ml。用0.45微米滤膜过膜后上机测试。
[0095]
(2)按以下的色谱和质谱程序对样品进行成分测定。
[0096]
色谱条件：色谱柱：tg
‑
5ms(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；升温程序：80℃保持1min，以10℃/min的速率升温至200℃，继续以5℃/min的速率升温至250℃，最后以2℃/min 的速率
升到270℃，保持3min；进样口温度：290℃；载气流速：1.2ml/min不分流进样，开阀时间1min。
[0097]
质谱条件：离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟时间：5.00min；扫描范围：30～400amu；离子源：ei源70ev。
[0098]
1.14酿酒酵母互补实验
[0099]
1.14.1酿酒酵母突变菌株by4741
‑
elo3的构建
[0100]
利用酵母敲除技术构建by4741
‑
elo3单倍体突变菌株。设计引物扩增酵母基因elo3 上下游各2000bp的两个片段，分别插入酵母敲除载体pug6的kanmx两端的loxp位点作为同源臂。将含有两个同源臂和kanmx的片段进行扩增，然后转化至野生型酿酒酵母 by4741菌株，在添加200mg/ml g418的ypd培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％d
‑ꢀ
葡萄糖)上进行筛选。引物序列如下表：
[0101][0102][0103]
1.14.2表达载体sd38
‑
pyes2的构建
[0104]
根据ncbi网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)提供的参考序列，设计一对特异引物，包含sd38基因的编码框。引物序列见下表:
[0105][0106]
以野生型缙恢10号的cdna为模板，用合成好的引物对扩增片段，ecori和bamhi 限制性内切酶酶切酵母表达载体pyes2，1％琼脂糖凝胶电泳分别回收扩增片段和酶切后的载体骨架并用重组酶50℃连接30min。转化连接产物至大肠杆菌dh5α的感受态，将筛选出的阳性单斑送测序。按照质粒提取试剂盒提供的操作步骤提取测序正确的单克隆菌株质粒即为sd38
‑
pyes2，
‑
20℃保存备用。
[0107]
1.14.3酿酒酵母互补验证
[0108]
将构建好的酵母表达载体sd38
‑
pyes2和空载pyes2分别转化至构建好的酿酒酵母突变菌株by4741
‑
elo3。转化方法参照1.3.10。转化后的酵母菌株在含有2％半乳糖和200 mg/ml g418的sc
‑
ura板上筛选。将野生型菌株by4741和分别含有sd38
‑
pyes2和空载pyes2的by4741
‑
elo3菌株涂布于ypg板(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％半乳糖)， 30℃培养2天，观察各菌株的生长速率。将不同酵母菌株于ypg液体培养基中30℃摇床连续振荡培养，不同时间点测量各菌液在600nm吸光值，测定细胞密度，绘制生长曲线。
[0109]
1.14.4酿酒酵母体内饱和脂肪酸含量测定
[0110]
(1)样品制备
[0111]
a)收集ypg液体培养基中30℃摇床连续振荡培养2天后的分别含有sd38
‑
pyes2 和空载pyes2的by4741
‑
elo3菌株各5个生物学重复。将沉菌于液氮中速冻。
[0112]
b)取200μl样本加入2ml10％乙酰氯甲醇和1ml正己烷，95℃反应2h，期间隔 5min
震荡1次。
[0113]
c)加入6ml的6％的碳酸钾溶液，涡旋2min。离心取正己烷层，旋转蒸发除去正己烷。
[0114]
d)加入100μl正己烷和5μl内标(c19:0,5mg/ml)，涡旋1min。2000rpm/min 离心5min，取上清于进样小瓶中待检。
[0115]
(2)gc
‑
ms分析
[0116]
利用thermo trace1300气相色谱
‑
isq7000质谱联用仪(gc
‑
ms)对样品以全扫描的方式进行脂肪酸含量分析，具体参数如下：色谱柱：db
‑
5(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)；进样量：1μl；进样温度：260℃；载气：氦气(99.999％)；流量：1.5ml/min；柱温：140℃保持2min，以10℃/min升至180℃，以4℃/min升至210℃，以10℃/min升至300℃，保持20min；分流比：20:1；接口温度：260℃；离子源温度：230℃；电离方式：ei+，70 ev；质量范围：33～550；
[0117]
(3)数据分析
[0118]
在thermo数据软件chromeleon7.0下对gc/ms数据进行特征峰提取，并根据nist 17 数据库对数据进行整理，在excel 2016软件中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包含retention time(保留时间)、观察量(样本)和峰强等信息。
[0119]
2.实验结果与分析
[0120]
2.1sd38突变体形态学观察
[0121]
2.1.1sd38突变体的表型鉴定
[0122]
在大田生长环境中，sd38突变体从苗期至成熟期各发育阶段均表现为半矮化表型(图 1a
‑
c)。抽穗期统计发现sd38突变体的穗长和所有节间均显著短于野生型(图1d，表1)。与野生型相比，有效穗数、粒长、粒宽等性状与野生型无显著差异(表1)。此外，sd38 突变体的剑叶呈现异常卷曲形态，而倒二叶和倒三上部叶片发育正常，与野生型相似(图 1e
‑
f)。具体来说，sd38剑叶的基部展开受阻，一半的叶片向内卷曲，中部和上部没有卷曲表型。石蜡切片观察发现，在剑叶被叶鞘包裹时，野生型剑叶基部两侧呈整齐的卷曲排列， sd38突变体剑叶两侧卷曲排列不规则(图2a
‑
b)，当剑叶完全展开时，野生型的基部两侧均能正常向外展开，而sd38突变体的叶片向内卷曲(图2c)。
[0123]
表1野生型和突变体sd38主要农艺性状
[0124][0125]
2.1.2野生型和sd38组织学分析
[0126]
为了探究sd38突变体半矮化表型的潜在原因，发明人对野生型和sd38突变体的地上部分进行了解剖学观察。苗期的sd38突变体叶鞘内表皮薄壁细胞长度比野生型短20％(图 3a
‑
b)。利用石蜡切片对野生型和sd38突变体抽穗期的倒二节间进行纵切比较。也野生型相比，sd38突变体倒二节间中部的薄壁细胞长度极显著减少(图3c
‑
d)。此外，sd38突变体sam区域下方的第一和第二节间面积比野生型显著减少(图3e
‑
f)。这些结果表明，细胞长度的减少可能是sd38突变体半矮化的根本原因。
[0127]
2.2sd38基因的图位克隆
[0128]
2.2.1遗传分析与基因定位
[0129]
采用图位克隆策略对sd38基因进行鉴定。定位群体由籼型雄性不育系“西农1a”与sd38 突变体杂交而成。所有的f1代个体植株均表现与野生型相似的正常表型。遗传分析表明，f2 代野生型表型与突变体表型个体的分离比符合3:1(3706个群体中共有886个单株出现突变表型；χ2＝0.86<χ20.05＝3.84)。这表明，sd38突变体的半矮化突变表型受一对隐性核基因控制。利用f2群体中886个半矮化表型单株对sd38基因进行基因定位，最终将sd38基因定位在10号染色体长臂上的ssr标记rm25546和rm25553之间，物理间隔为99kb(图4a)。
[0130]
2.2.2候选基因预测
[0131]
根据gramene网站(http://www.gramene.org/)和rice genome annotation project (http://rice.plantbiology.msu.edu/)提供的基因注释信息，在sd38基因定位区间共包含11 个注释基因，其中5个编码假定蛋白，2个编码转座子蛋白，4个编码有注释功能蛋白，分别编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白、endo
‑
β
‑
n
‑
乙酰葡糖胺糖苷酶、β
‑
酮脂酰
‑
乙酰辅酶 a合酶、非溶酶体
‑
葡糖神经酰胺酶(表2)。通过对11个注释基因测序发现，sd38突变体中的loc_os10g33370基因外显子位点上有个g到a的单核苷酸突变，导致编码的氨基酸从丝氨酸突变为天冬酰胺，初步将loc_os10g33370确定为sd38的候选基因(图4a)。
[0132]
表2 sd38定位区间内基因功能注释
[0133][0134]
2.2.3互补验证
[0135]
为了确定loc_os10g33370是sd38的基因，发明人进行了互补实验。将野生型中 loc_os10g33370的9525bp基因组片段，包括起始密码子上游3364bp序列和终止密码子下游的1683bp序列，通过农杆菌介导的方式转化至sd38突变体中。在sd38互补 (sd38
‑
com)转基因株系中，突变体的半矮化表型完全恢复(图4c)，且测序发现互补转基因株系中突变位点为杂合状(图4d)。为了进一步确认sd38基因的准确性，发明人利用 crispr/cas9技术，获得了粳稻品种“中花11”背景下的sd38基因敲除突变体sd38cas9
‑
1 和sd38cas9
‑
2，分别在sd38基因的编码框中缺失和插入单碱基t(图5a)。与野生型“中花11”相比，两个sd38cas9突变体均表现出与sd38突变体相似的半矮化表型(图5b)。这些结果证实了loc_os10g33370是sd38基因。
[0136]
2.2.4sd38系统进化树分析
[0137]
sd38/loc_os10g33370编码β
‑
酮酰基辅酶a合成酶(β
‑
ketoacyl
‑
coa synthase,kcs)，参与极长链脂肪酸(very
‑
long
‑
chain fatty acids,vlcfas)的生物合成(haslam&kunst, 2013)。系统进化树分析发现，sd38与两个未知功能的拟南芥kcs家族成员atkcs3和 atkcs12的同源性最高(图4b)。目前为止，水稻中有4个kcs基因功能被鉴定了，分别是 oni1、oni2、wsl1和wsl4/hms1(ito et al.,2011；tsuda et al.,2013；yu et al.,2008； wang et al.,2017；chen et al.,2020)。然而，sd38与这4个已知功能水稻kcs蛋白的同源性较低(图4b)。这些结果暗示sd38可能在水稻的生长发育过程中起着新的未知功能作用。
[0138]
2.3sd38基因基因表达模式分析
[0139]
2.3.1sd38亚细胞定位
[0140]
为了确定sd38的亚细胞定位，发明人构建了含有sd38编码序列的绿色荧光蛋白(gfp) 融合载体，并在水稻原生质体中瞬时表达。sd38
‑
gfp融合蛋白的绿色信号能够与内质网 marker上的红色信号重合(图6a)，表明sd38定位于内质网上。这一结果与kcs家族蛋白定位在内质网上，与其它几个合成酶形成脂肪酸延伸酶复合体一起参与vlcfas的延伸这一认知是一致的(haslam&kunst,2013)。
[0141]
2.3.2sd38时空表达模式
[0142]
采用qrt
‑
pcr和rt
‑
pcr方法分析sd38在不同组织部位中表达进行检测。sd38在幼茎、分蘖芽和叶鞘中的表达量较高，在叶、穗茎和穗中有表达，在根和叶柄中的表达量较低 (图6b
‑
c)。进一步利用sd38启动子
‑
gus报告基因对sd38的表达模式进行分析。在启动子+gus阳性转基因植株的茎、叶、叶鞘和穗部均检测到gus信号，这与qrt
‑
pcr和rt
‑
pcr 分析结果一致(图6d
‑
h)。
[0143]
2.4sd38基因在酿酒酵母中的功能验证
[0144]
酿酒酵母的细胞中三个蛋白，elo1、elo2和elo3是合成vlcfas所必需的，也是维持酵母正常生长活力所必需的(pual et al.,2006)。单倍体的elo3酵母细胞缺乏elo3p活性，导致其生长速率比野生型细胞慢，是植物kcs基因功能鉴定的理想材料(qin et al.,2007b)。为了验证sd38基因编码kcs蛋白，发明人在酿酒酵母中进行了功能互补试验。采用同源重组敲除策略，获得了酿酒酵母单倍体by4741菌株的elo3敲除突变体by4741
‑
elo3。在ypg 培养基上，携带pyes2
‑
sd38表达载体的by4741
‑
elo3细胞生长速度明显高于携带pyes2空载的by4741
‑
elo3细胞(图7a)。在ypg液体培养基中连续培养后也检测到携带 pyes2
‑
sd38表达载体的by4741
‑
elo3细胞生长速率明显高于携带pyes2空载的 by4741
‑
elo3细胞(图7b)。这些结果表明sd38能够部分恢复by4741
‑
elo3酵母突变体中 elo3的活性，证明sd38基因编码kcs蛋白。
[0145]
为确定sd38基因编码的kcs蛋白在vlcfas合成过程中的具体功能，利用气相色谱
‑
质谱联用技术(gc
‑
ms)检测携带pyes2
‑
sd38表达载体和pyes2空载的by4741
‑
elo3细胞体内vlcfas的含量。结果发现，sd38基因的在酿酒酵母中的异源表达可产生大量的c24:0和 c26:0，而其他碳链长度的vlcfas含量与含有pyes2空载的by4741
‑
elo3细胞相同(图7 c
‑
d)，这些结果表明sd38参与了c24:0 vlcfas的合成。
[0146]
2.5野生型和sd38突变体的脂质组学分析
[0147]
sd38编码的kcs蛋白作为vlcfas合成途径的限速酶，其突变可能引起体内脂质含量的变化。为了验证这一假设，发明人对野生型和sd38突变体幼苗进行了脂质组学分析。在
脂质组数据中总鉴定出26种脂类和694种脂类亚类(图8)。与野生型相比，sd38突变体的脂质总含量略有降低，但未到达显著差异水平(图9a)。作为细胞膜的关键组成成分，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,pe)、溶血磷脂酰乙醇胺 (lysophosphatidylethanolamine,lysope)和溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, lysolpc)在sd38突变体中显著减少，还包括溶血磷脂酰胆碱亚类lysolpc(18:1)和 lysolpc(20:4)(图9b
‑
e)。总的磷脂酸(phosphatidic acid,pa)含量在野生型和sd38突变体之间并没有显著性差异，但磷脂酸亚类pa(34:2)和pa(37:1)含量在sd38突变体中显著降低(图9f
‑
g)。其他脂质成分，如甘油二脂(diglycerides,dg)、酰基谷甾醇酯 (acylglcsitosterol ester,aglcsie和辅酶(coenzymes,co)的含量，在野生型和sd38突变体之间呈现轻微的差异(图9h
‑
j)。这些结果表明sd38基因的突变影响了水稻体内脂质含量变化。
[0148]
2.6c24:0 vlcfa促进sd38幼苗伸长
[0149]
为了进一步研究vlcfas与水稻株高的关系，发明人检测了幼苗期野生型和sd38突变体的vlcfas含量。与酿酒酵母功能互补试验结果一致，跟野生型相比，sd38突变体中c24:0 vlcfa含量极显著降低，在sd38
‑
com转基因植株中恢复，而其他碳链长度的vlcfas含量并无明显变化(图10a)。在添加50μm c24:0或c16:0的ms固体培养基中培养野生型和sd38 突变体幼苗。10天后统计幼苗长度，发现在添加c24:0的培养基中sd38突变体的幼苗长度显著升高，而c16:0处理下sd38突变体幼苗的长度无明显变化(图10b)。此外，在vlcfas 生物合成抑制剂唑草胺(cafenstrole,cs)处理下，野生型和和sd38突变体幼苗长度均减少，但野生型幼苗长度变化达到显著性差异(图10c)。这些结果表明，c24:0 vlcfa的缺陷是 sd38突变体半矮化表型的原因。
[0150]
2.7sd38幼苗乙烯合成缺陷
[0151]
现有技术表面，作为一种气态植物激素，乙烯除了参与果实成熟、脱落以及衰老外，还作为vlcfas的下游调控因子，参与棉花纤维细胞和多种类型拟南芥细胞的伸长(shi et al., 2006；qin et al.,2007a)，以及水稻节间伸长(iwamoto et al.,2010；iwamoto et al.,2011)。为了探究sd38突变体半矮化与乙烯合成的关系，发明人检测了乙烯合成基因(3个ossmas 基因、6个osacs基因和6个osaco基因)在野生型和sd38突变体幼苗中的表达情况。与野生型相比，除了ossams1、ossams3、osacs5和osaco1的表达量在sd38突变体幼苗中上调外，其余的基因的表达量均下调，尤其是osacs2、osacs3、osacs4和osaco7 的表达量在sd38突变体幼苗中呈极显著和显著性下调(图11a)。与乙烯合成基因表达情况一致的是，sd38突变体幼苗中的乙烯合成前体1
‑
氨基环丙烷
‑1‑
羧酸 (1
‑
aminocyclopropane
‑1‑
carboxylicacid,acc)的含量比野生型极显著降低了(图11b)。外源acc处理对野生型的幼苗生长无明显作用，但能极显著促进sd38突变体幼苗的伸长(图 11c)。在外源乙烯处理下，野生型和sd38突变体幼苗均能伸长，但sd38突变体幼苗伸长的更明显(图11d)。这些结果表明sd38突变体内的乙烯合成受阻。
[0152]
2.8c24:0 vlcfa诱导osacs3的表达
[0153]
c24:0 vlfca以及acc和乙烯利均能促进sd38突变体幼苗的伸长，为进一步探究 vlfca与乙烯合成的关系，发明人通过qrt
‑
pcr分析了c24:0 vlfca处理下乙烯合成相关基因的表达情况。结果发现，大多数乙烯生物合成基因的表达量在c24:0 vlfca处理下均上
调，尤其是osacs3的表达量呈现极显著的上调(图12a)。发明人进一步观察到，在c24:0 vlfca处理后12小时，osacs3的表达量达到最高值，相反，vlcfas生物合成抑制剂唑草胺(cafenstrole,cs)抑制osacs3的表达(图12b)。这些结果表明，vlcfas可能通过调控 osacs3的表达来促进乙烯的合成，从而影响水稻的形态发育。
[0154]
3结果讨论
[0155]
3.1sd38参与c24:0 vlcfa的合成
[0156]
超长链脂肪酸vlcfas是细胞膜的重要组成部分。植物中与vlcfas合成相关的基因突变表现出严重的发育缺陷，包括异常的细胞分裂和细胞分化、细胞周期缺陷、激素反应缺陷和异常的胚胎发育(bellec et al.,2002；baud et al.,2003；harrar et al.,2003；baud et al., 2004；da costa et al.,2006；bach et al.,2008；roudier et al.,2010；bach et al.,2011)。 vlcfas是由定位在内质网上的延伸酶复合物催化合成的，其中kcs被认为是决定底物的碳链长度。不同植物中均有许多kcs基因被注释，这意味着植物中的kcs成员存在功能性冗余，然而，根据其在vlcfas生物合成中的作用，每个kcs蛋白都表现出一种独特的底物特异性(haslam&kunst,2013)。拟南芥中第一个克隆的kcs基因fae1(fatty acidelongation 1)负责c20:0和c22:0的延伸，参与种子三酰基甘油(triacylglycerol，tag) 合成(rossak et al.,2001)。kcs1参与c26:0的生物合成和表皮蜡的形成(todd et al.,1999)。 kcs2/daisy和kcs20参与c22:0 vlcfa的延伸，是表皮蜡质和渗透压胁迫下根的软木脂生物合成所必需的(franke et al.,2009；lee et al.,2009)。kcs5/cer60和 kcs6/cer6/cut1参与c24:0和超过28碳链长度的vlcfa合成，是表皮蜡质和花粉脂质的前体(millar et al.,1999；fiebig et al.,2000；hooker et al.,2002)。kcs9参与c22:0到 c24:0的延伸，是各种vlcfas衍生物的前体(kim et al.,2013)。本研究利用图位克隆策略鉴定了一个新的水稻kcs基因sd38。sd38的互补转基因植株和crispr/cas9突变体表型证实了sd38基因的单碱基突变是导致sd38突变体表现出半矮化表型的原因(图4c；图5)。sd38突变体c24:0含量降低(图10a)，sd38在酿酒酵母by4741
‑
elo3菌株中的外源表达能够促进c24:0和c26:0的含量增加(图9c
‑
d)，表明sd38是水稻中c24:0 vlcfa合成过程中的关键酶。
[0157]
3.2c24:0 vlcfa促进乙烯的生物合成
[0158]
越来越多的研究表明，vlcfas或其衍生物作为信号介导植物的各种生物过程。vlcfas 能够抑制细胞分裂素生物合成基因异戊烯基转移酶(isopentenyl transferase 3, ipt3)的表达，减少维管组织中的细胞分裂素合成，从而参与调解拟南芥器官的生长 (nobusawa et al.,2013)。在拟南芥中，vlcfas及其衍生物通过抑制alf4转录水平来限制中柱鞘中愈伤组织形成的能力，影响侧根的发育(shang et al.,2016)。花生四烯酸(arachidonic acid)是一种vlcfa衍生物，通过诱导胁迫相关基因的表达激活拟南芥胁迫响应和防御信号网络(savchenko et al.,2010)。饱和的vlcfas，或者更确切地说c24:0vlcfa，可以激活1
‑
氨基环丙烷
‑1‑
羧酸氧化酶(1
‑
aminocyclopropane
‑1‑
carboxylic acidoxidase,aco)的转录，从而导致大量乙烯的产生，促进棉花纤维和拟南芥干细胞的伸长(qinet al.,2007a)。在水稻缺氧条件下，vlcfas通过诱导osacs1的表达水平，增加乙烯的生物合成，促进根通气组织的形成(yamauchi et al.,2015)。在水稻kcs基因的突变体中，与生长素相关基因表达异常，在顶端分生组织特异表达的knox家族基因在叶片中出现了异位表达情况(ito et al.,2011；takasugi&ito,2011；tsuda et al.,2013)。这些研究结果
表明， vlcfas作为一种信号因子，通过调控某些关键基因的表达，参与多种生物过程，以维持植物的正常生长。sd38突变体中某些乙烯合成基因表达下调，acc含量降低(图11a
‑
b)，因此，发明人推测vlcfas也可能诱导乙烯合成途径关键基因的表达。进一步研究发现， c24:0能显著提高osacs3的表达量(图12)。外源的vlcfa(c24:0)、acc和乙烯利对 sd38突变体幼苗伸长的类似作用也表明，vlcfas和乙烯生物合成之间是存在关联性的。
[0159]
3.3乙烯的生物合成在水稻发育中的作用
[0160]
乙烯是在acc合成酶(acs)和acc氧化酶(aco)的催化下，由s
‑
腺苷
‑
l
‑
蛋氨酸 (s
‑
adenosyl
‑
l
‑
methionine)经acc合成的(chen et al.,2013)。有研究表明，在拟南芥中，乙烯与其他激素(生长素、油菜素类固醇和赤霉素)协同作用，通过影响细胞伸长，参与不同组织部位的生长发育，包括根毛、顶端钩和下胚轴(raz&ecker,1999；achard et al.,2003； seifert et al.,2004；de grauwe et al.,2005；stepanova et al.,2005)。在胚胎发育后期，乙烯还可以调节拟南芥根尖干细胞静止中心的细胞分裂(ortega
‑
martinez et al.,2007)。另外，乙烯对棉纤维细胞伸长也起着重要促进作用(shi et al.,2006；qin et al.,2007a)。在水稻中，乙烯合成基因osaco1在伸长的节间有较高的表达，表明乙烯与抽穗期节间伸长的发育有关(iwamoto et al.,2010)。进一步的研究表明，乙烯能够与光敏色素和具有生物活性的赤霉素共同诱导水稻节间伸长(iwamoto et al.,2011；iwamoto&takano,2011)。这些研究结果表明乙烯在调节植物细胞伸长和分裂的信号通路中起着重要作用。本发明中外源添加acc和乙烯利都可以部分恢复sd38突变体幼苗半矮化表型(图11c
‑
d)，这也证实了表明乙烯会促进水稻的伸长。
[0161]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。