小麦TaHAL3-7A基因及其在调控作物抗旱性中的应用

小麦tahal3
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7a基因及其在调控作物抗旱性中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种小麦tahal3
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7a基因及其在调控作物抗旱性中的应用。


背景技术：

2.小麦(triticum aestivum l.)是世界上重要的粮食作物，适应性强、分布范围广，为人类提供了约20％的食物热量(kulkarni et al.,2017；mao et al.,2020)。由于全球气候变暖及水资源短缺问题日益加重，干旱已成为影响作物生长和产量的主要因素之一(sallam et al.,2019)。因此，挖掘优异抗旱基因并用于育种，将对未来粮食安全及可持续发展具有重要意义(kulkarni et al.,2017)。目前，利用基因工程技术开展植物抗旱方面的研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于抗旱机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与抗旱相关的基因转入植物中，其转录和翻译产物可以使转基因植物的抗旱能力得到提高。
3.hal3是一种存在于真菌、植物和动物中高度保守的黄素蛋白，在细胞周期转换和耐盐性中发挥着重要作用(sun et al.,2009)。在酵母、拟南芥、烟草、水稻、大豆、苹果等均有hal3蛋白提高耐盐性的报道(ana et al.,1999；ikuko etal.,2004；guo et al.,2009；sun et al.,2009；yang et al.,2020)。然而，目前尚未发现小麦tahal3基因的研究报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的之一是提供一种小麦tahal3
‑ꢀ
7a基因。
5.为实现以上目的，本发明提供的小麦tahal3
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7a基因，采用如下技术方案：
6.一种小麦tahal3
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7a基因，其cds序列如seq id no.1所示，具体如下：atggctacatcagaaccggtacaggaaagctgggagctggaacccagtag gcctcgggtcctccttgctgcttcagggagtgtagctgctataaaattcga gagcctctgtcgtgtcttctccgagtgggcggaagtccgagctgtggcga ccaagtcatcattgcactttattgagagatcatctctgcctagcgacgtcat tctttacactgatgatgatgagtggtctacctggacgaagataggagacga ggttctgcacatagagctgcggaagtgggcagacatcatggtgatcgcccc cttatcagcaaacactctggccaagatcgctggtgggttatgcgacaacct cctgacatgcatagtgcgggcgtgggactacaagaagccgatcttcgccgc tccagccatgaacaccttcatgtggaacaacccgttcacggcgcgccacat cgagacgatcaaccaactcgggatttccttggtcccacccaccacgaaga ggctggcctgcggcgactacgggaacggcgcgatggctgagccttcacag atccatacgaccgtgaggctcgcgtgcaagtcacatacgttcggcacgggc aattcacccgcgatcccttccagcagccaccctgtctag
7.所述小麦tahal3
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7a基因，其蛋白序列如seq id no.2所示，具体如下：
8.matsepvqeswelepsrprvllaasgsvaaikfeslcrvfsewaevrava tksslhfiersslpsdvilytdddewstwtkigdevlhielrkwadimviap lsantlakiagglcdnlltcivrawdykkpifaapamntfmwnnpftarh ietinqlgislvppttkrlacgdygngamaepsqihttvrlackshtfgtg nspaipssshpv
9.本发明的另一目的在于提供上述方案所述小麦tahal3
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7a在调控作物抗旱性中的应用。
10.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明利用现有的植物基因工程技术，首次从小麦中克隆了tahal3
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7a基因，并构建了tahal3
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7a基因的植物过表达载体，通过农杆菌介导的方法将过表达载体分别转化到水稻和小麦中，从而显著提高水稻和小麦的抗旱性。本发明小麦tahal3
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7a基因应用于调控作物抗旱性，可以为抗逆新品种创制提供基因资源和方法。
附图说明
11.图1为本发明实施例2中转基因株系中tahal3基因的表达量分析。其中：
12.图1a为利用荧光定量pcr检测转基因水稻中tahal3基因的相对表达量，其中转基因受体材料为水稻粳稻品种中花17(简称zh17)，zh17
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oer#1、 #2、#3为三个独立的转基因株系；
13.图1b为利用荧光定量pcr检测转基因小麦中tahal3基因的相对表达量，其中转基因受体材料为小麦品种fielder，fielder
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oew#1、#2、#3为三个独立的转基因株系。
14.图2为本发明实施例3中转基因水稻的抗旱性鉴定。其中：
15.图2a为zh17和zh17
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oer在20％peg处理前和恢复后的表型比较；
16.图2b和2c分别为胁迫处理恢复后，zh17和zh17
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oer的存活率和株高。
17.图3为本发明实施例3中转基因小麦的抗旱性鉴定。其中：
18.图3a为fielder和fielder
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oew在干旱处理前和恢复后的表型比较；
19.图3b
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e分别为干旱处理恢复后，fielder和fielder
‑
oew的株高、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的比较；
20.图3f为干旱处理恢复后，fielder和fielder
‑
oew穗部表型比较；
21.图3g
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h分别为干旱处理恢复后，fielder和fielder
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oew的穗长和小穗数调查分析。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
23.下列实例中所采用的实验方法若无具体说明，均为本领域技术人员所使用的常规实验方法。
24.实施例1
25.小麦tahal3
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7a基因克隆、载体构建和遗传转化
26.本发明所述的小麦tahal3
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7a基因，是以水稻oshal3蛋白序列为参考，通过生物信息学分析，结合pcr扩增测序验证，从小麦测序品种中国春中克隆tahal3
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7a基因。以中国春的cdna为模板进行扩增，回收目的片段分别与载体进行同源重组连接反应，通过菌落pcr和测序验证最终获得阳性克隆载体，pubi::tahal3(简称oer，转化水稻)和pubi::tahal3(简
称oew，转化小麦)。利用农杆菌介导法，分别转化水稻受体材料中花17(简称zh17)和小麦受体材料fielder。
27.实施例2
28.转基因株系中tahal3
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7a基因的表达量分析
29.利用tahal3基因特异引物，通过常规pcr技术对水稻和小麦转基因植株进行鉴定，筛选获得阳性转基因株系。取阳性转基因植株的叶片，利用takaratotal rna试剂盒提取rna，以oligo(dt)为引物反转录合成cdna。利用荧光定量pcr检测转基因水稻和小麦中tahal3基因的相对表达量，每个株系设置三个生物学重复。其中，水稻和小麦中的内参基因分别为osubiquitin和 tagapdh基因。
30.参见图1a为利用荧光定量pcr检测转基因水稻中tahal3基因的相对表达量，其中转基因受体材料为水稻粳稻品种中花17(简称zh17)，zh17
‑ꢀ
oer#1、#2、#3为三个独立的转基因株系；nd，表示未检测到；参见图1b 为利用荧光定量pcr检测转基因小麦中tahal3基因的相对表达量，其中转基因受体材料为小麦品种fielder，fielder
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oew#1、#2、#3为三个独立的转基因株系。
31.结果表明，相对于受体材料，转基因阳性株系中tahal3基因的表达量均显著提高。其中在转基因水稻中，tahal3基因的表达量相对于水稻oshal3基因提高了约200倍以上；在转基因小麦中，tahal3基因的表达量相对于对照材料fielder，提高了约30倍以上。
32.实施例3
33.转基因水稻的抗旱性鉴定
34.将水稻受体材料zh17和三个转基因纯系(zh17
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oer#1、#2、#3)的种子，在37℃黑暗浸种48h，露白后将其转移到去离子水中，在温度28℃，16h光照/8h 黑暗、湿度50％的人工气候培养箱中培养。7天后更换营养液，三叶期时在含有20％peg(聚乙二醇)的水稻营养液下处理7天，更换正常营养液恢复7天后，统计存活率，存活率(％)＝(复水后存活植株数/peg胁迫前总植株数)
×
100％，同测量株高。
35.参见图2a为zh17和zh17
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oer在20％peg处理前和恢复后的表型比较；图2b和2c分别为胁迫处理恢复后，zh17和zh17
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oer的存活率和株高。显著性分析按照双尾t检验(**p<0.01)。
36.结果表明，与对照受体材料zh17相比，三个转基因株系zh17
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oer#1、#2、 #3的存活率和株高均显著增加。
37.实施例4
38.转基因小麦的抗旱性鉴定
39.选取小麦受体材料fielder和三个转基因纯系(fielder
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oew#1、#2、#3)的种子，在温度为23℃、光周期为16h光照/8h黑暗、湿度为50％的人工气候培养箱中萌发，种子露白后将其转移到花盆(含有普通营养土)中培养。三叶期时停止供水，干旱胁迫处理7天，加水恢复10天后，测量株高和叶绿素相关指标。抽穗期后，调查穗长和小穗数性状。
40.参见图3a为fielder和fielder
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oew在干旱处理前和恢复后的表型比较；图3b
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e分别为干旱处理恢复后，fielder和fielder
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oew的株高、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的比较；图3f为干旱处理恢复后，fielder和 fielder
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oew穗部表型比较；图3g
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h分别为干旱处理恢复后，fielder和 fielder
‑
oew的穗长和小穗数调查分析。显著性分析按照双尾t
检验(**p< 0.01)。
41.实验结果表明，与对照材料fielder相比，三个小麦转基因株系株高显著增加，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量更高(图3a
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e)，同时转基因植株的穗长和小穗数也显著增加(图3f
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h)。上述结果说明在干旱条件下，tahal3 基因的转基因小麦具有更强的恢复力，最终产量性状也显著提高。
42.以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。