使用衰减型探针的核糖核酸扩增和检测的制作方法

使用衰减型探针的核糖核酸扩增和检测
1.相关申请
2.本技术要求享受2020年6月8日提交的美国临时申请no.63/036,076的优先权,该申 请涉及2017年5月17日提交的题为“用于核酸扩增的组合物和方法”的美国专利申请 no.15/597,310，其通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及用于扩增和/或定量相关(of interest)的靶核酸分子的方法，更具体地， 涉及通过含有衰减型(attenuating)位点的新型pcr探针和单管嵌套式(nested)pcr扩 增和检测相关的靶核酸的方法。本公开的实施方案进一步涉及用于检测和/或定量相关的 靶核酸分子的组合物，试剂盒，探针和引物组。


背景技术：

4.聚合酶链反应(pcr)是kary mullis在1980年代开发的一种革命性方法(mullis k etal.，1986)，它是分子生物学中最强大的技术之一。可以使用序列特异性引物，热稳定的 dna聚合酶和热循环，通过pcr将dna或cdna分子或核酸模板中的特定序列从少量 扩增到数千到一百万倍。pcr的优势在于它可以将少量核酸扩增百万至十亿倍(glennon m. 和cormican m.，2001)。pcr的主要应用之一是作为研究或诊断工具，例如，用于检测病 原性病毒或细菌的存在(yamamoto y.2002)。
5.尽管pcr是省时的并且是相对灵敏的诊断工具，但是，在核酸分子的拷贝数非常低 的样品中经常出现假阴性信号(bonne et al.，2008)。当需要在感染的非常早期就检测出 导致疾病(例如covid
‑
19)或感染爆发的病原体以便预防和遏制感染或疾病的传播时， 出现假阴性就变得有问题。传统pcr技术的另一个问题是当引物与dna在错误区域结合 时会产生假阳性产物。随着pcr循环次数的增加，此问题更有可能发生。
6.实时逆转录(rt)
‑
pcr检测已用于病原体的检测(drosten cs et al.，2003)，最近还 用于检测新型冠状病毒肺炎病原体sars
‑
cov
‑
2。“实时”检测使人们能够测量反应过程中 pcr产物的积累，而不是简单地分析连续扩增循环过程中的最终产物量(poon llet al.， 2003年)。
7.当前，qpcr测定法是基于双标记探针与pcr产物的杂交，例如所谓的“taqman探 针”，其中信号的产生是由于探针失去荧光猝灭的效能(ponchel f et al.，2003)。taqman 探针原理是基于taq dna聚合酶的5
’→3’
核酸外切酶活性可在探针与互补靶序列杂交的 过程中切除双标记探针，从而从探针中释放出荧光团而用于荧光检测。但是，taq dna聚 合酶的5
’→3’
核酸外切酶活性非常弱，需要taqman探针与核酸序列牢固的结合才能有效 产生信号(tajadini m et al.，2014)。牢固的结合会减慢引物的延伸，从而降低pcr反应 的速率和产率。此qpcr测定法在临床诊断环境中通常有非常不一致的结果。由于缺乏检 测方法的灵敏度而导致的假阴性结果可能会误导临床医生让早期感染者过早出院。
8.为了在保持高灵敏度和特异性的同时达到减少诊断假阳性或假阴性的目标，我们
已开 发出一种利用新型pcr探针。它是利用许多dna聚合酶具有的3'
→
5'核酸外切酶活性， 而不是taq dna聚合酶中的5
’→3’
核酸外切酶活性。具有3'
→
5'核酸外切酶活性的dna 聚合酶优于taq dna聚合酶，因为它们通常具有更高的热稳定性并具有很高的保真度。 但是，这些酶不能使用与taqman探针相同的探针设计进行可靠的定量pcr反应。其原因 是在核酸外切酶反应后，如果探针(标记的寡聚核苷酸)3'末端核苷酸具有游离羟基，探 针则会被延伸。如果延伸发生在非靶标模板分子上，则会产生非特异性信号。如果非特异 性延伸导致随后的非特异性扩增，则该问题可能会更加严重。我们还开发了一种新的嵌套 式pcr步骤，用于检测低拷贝数的核酸分子。嵌套式pcr是pcr的一种改进，旨在提高 灵敏度和特异性。典型的嵌套式pcr涉及使用两组引物和两个连续的pcr反应(gr
üꢀ
nebachf et al.，1994)。第一组引物被设计为可退火至第二组引物(内部)之外的序列(外 部)，并用于初始pcr反应。第一轮pcr反应产生的扩增子产物用作第二组引物和第二 轮扩增的模板(zeaiter z et al.，2003年)。这项技术显地增强了dna扩增的灵敏度和特 异性(kim dm et al.，2011)。
9.嵌套式pcr通常是通过在一个反应管中进行初始pcr，然后将分部(moiety)扩增 产物转移到第二反应管中，再进行第二轮pcr。该过程有两个缺点。它比单个pcr更为 复杂，更重要的是，它具有让第一个pcr的扩增产物对环境造成污染的风险，这可能会 导致后续实验步骤的污染。与两步嵌套式pcr不同，单管嵌套式pcr的操作复杂度较低， 并且消除了产生扩增物污染的机会。
10.因此，有必要开发用于特异性和定量核酸检测的新型pcr探针方法以及单管嵌套式 qpcr，其易于使用，产生扩增子污染的机会更少，完成时间更短并且成本更低廉。这项 新技术将嵌套式pcr的高灵敏度与新探针的特异性和/或定量相结合，将改善对相关靶核 酸的检测，例如sara
‑
cov
‑
2，它是新型冠状病毒肺炎的致病因子。


技术实现要素：

11.实施方案涉及一种通过单管嵌套式pcr扩增和检测靶核酸序列的方法，以提高灵敏 度和对靶物的特异性，并降低样品交叉污染。此外，一个实施方案涉及用于定量靶核酸序 列的方法。该方法包括对靶核酸序列进行单管嵌套式qpcr。
12.实施方案涉及相关核酸序列的特异性和/或定量检测。一种包括下列步骤的方法：(a) 组装反应混合物，所述反应混合物包括(i)包含相关核酸序列的靶分子,(ii)包含一对扩 增引物的引物组,(iii)包含下列特征的探针:(1)衰减型位点，(2)在非3'位点的第一标 记，和(3)在3'端的第二标记,(iv)具有3'
→
5'核酸外切酶活性的聚合酶；(b)使用反 应混合物对包含相关核酸序列的靶分子进行扩增反应。该探针和具有3'
→
5'核酸外切酶活 性的聚合酶被配置为可实现对相关核酸序列进行特异性和/或定量的检测。在一个实施方 案中，相关核酸序列包含sars
‑
cov
‑
2序列或其衍生物序列。
13.在一个实施方案中，使用聚合酶的3'
→
5'核酸外切酶活性有效地切除探针3'端的第二 标记。
14.在一个实施例中，第一标记和第二标记包括荧光染料
‑
猝灭剂对或其类似物。
15.在一个实施方案中，引物组包含第一引物和第二引物，其中第一引物和第二引物与包 含相关核酸序列的靶分子互补。
16.在一个实施方案中，引物组包含第一引物(正向)和第二引物(反向)，其中第一引 物和第二引物与包含相关核酸序列的靶分子互补。靶分子可以是单链或双链核酸分子。靶 分子可以是rna或dna。在一个实施方案中，相关核酸序列是衍生自sars
‑
cov
‑
2基因 组rna序列。衍生的序列可以是一个片段，或是基因组rna序列的一个区域。衍生的序 列也可以是从基因组rna逆转录而得的cdna序列。逆转录(rt)反应可以在pcr反 应之前在同一试管中进行(所述pcr反应包括，例如，嵌套式pcr，探针pcr，定量pcr 或它们的组合)；因此，可以使用同一反应混合物在同一试管中进行rt
‑
pcr，以检测病原 体，例如sars
‑
cov
‑
2病毒，它是新型冠状病毒肺炎
‑
19的致病因子。
17.在一个实施方案中，所述衰减型位点位于探针的中心与第二标记之间，并且包含至少 1至10个单元，其包含天然核苷酸，非天然核苷酸，脱碱基结构，间隔子(nested)，荧 光标记修饰的核苷酸，其包含脱氧尿苷的非典型核苷酸，化学合成的核苷酸或上述单元的 组合。
18.在一个实施方案中，所述衰减型位点包含至少1至10个单元。衰减型位点中的单元 是多聚核苷酸分子中的核苷酸或核苷酸等效物。所述衰减型位点包括包含天然核苷酸，非 天然核苷酸，脱碱基结构，间隔子，荧光标记修饰的核苷酸，案包含脱氧尿苷的非典型核 苷酸，化学合成的核苷酸或上述单元组合的结构。衰减型位点位于探针的中心和第二个标 记之间。它被配置为可防止探针分子被用作引物或可被复制的模板以免在非特异性反应中 产生假阳性信号。
19.在一个实施方案中，对相关核酸序列的特异性和/或定量检测包括：(a)将扩增引物退 火至包含相关核酸序列的靶分子；(b)在聚合酶存在下，扩增位于第一和第二扩增引物位 点之间的两条靶分子链。(c)使探针与靶分子的链杂交以形成探针
‑
靶双链体；(d)使用 聚合酶的3'
→
5'核酸外切酶活性切割下探针上的标记后检测释放出的荧光信号；(e)以靶 分子为模板延伸两个引物；(f)重复上述步骤以扩增和检测靶核酸序列。
20.在一个实施方案中，引物组的引物的3'末端包含分子分部，其中该分子分部与相关靶 核酸序列不互补。引物组的3'末端包含分子分部，其中该分子分部与相关靶核酸序列不互 补。分子分部彼此不互补。
21.在一个实施方案中，在使用聚合酶延伸引物之前，将分子分部配置为被dna聚合酶 的3'
→
5'核酸外切酶活性切除。
22.在一个实施方案中，所述分子分部包含核苷酸和/或核苷酸类似物，它们选自包含如 下成分的成分组:肌苷，含尿嘧啶的核苷酸，异脱氧胞嘧啶(iso
‑
dc)，异脱氧鸟苷(iso
‑
dg)， 二氨基嘌呤，2,4
‑
二氟甲苯，4
‑
甲基苯并咪唑，尺寸扩展(size
‑
expanded)的腺嘌呤(xa)， 尺寸扩展的鸟嘌呤(xg)，尺寸扩展的胞嘧啶(xc)，尺寸扩展的胸腺嘧啶(xt)，2
‑
(((2r， 4r，5r)
‑
四氢
‑4‑
羟基
‑5‑
(羟甲基)呋喃
‑2‑
基)
‑6‑
甲基异喹啉
‑
1(2h)
‑
硫酮(d5sics)， 1,4
‑
无水
‑2‑
脱氧
‑1‑
c
‑
(3
‑
甲氧基2
‑
萘基)
‑
(1r)
‑
d
‑
赤型戊糖醇(dnam)，脱碱基核苷酸， 无环核苷酸，标记的核苷酸和/或上述的组合。
23.在一个实施方案中，靶分子由逆转录产生。用非分离的核酸样品进行扩增反应。使用 热循环仪或基于热对流的恒温装置进行扩增反应。
24.一个实施方案涉及用于核酸扩增的定量选择性松动(sw，selective wobble)方法。此 方法包括：(a)组装反应混合物，所述反应混合物包括：(i)包含相关核酸序列的靶分
子， 和(ii)一组寡聚核苷酸，其包含：(1)包含第一sw位点的第一选择性松动(sw)引物， (2)包含第二sw位点的第二sw引物，(3)至少一个第三引物，和(4)包含下列的探 针：(i)衰减型位点，(ii)于非3’位点的第一标记，(iii)在3’端的第二标记，和(iv) 具有3
’→5’
核酸外切酶活性的聚合酶；(b)使用反应混合物对包含相关核酸序列的靶分子 进行扩增反应；(c)检测和扩增包含存在于靶分子中的相关核酸序列或其变体序列。sw 位点被配置为能够无间断地对包含相关核酸序列的靶分子进行嵌套式扩增和定量分析。
25.在一个实施方案中，sw位点包含至少1至10个核苷酸的核酸序列,所述序列与包含 相关核酸序列的靶分子不互补。
26.在一个实施方案中，包含第一sw引物和第二sw引物的引物组被配置为正向sw引 物组或反向sw引物组。
27.在一个实施方案中，第三引物被配置为反向引物或正向引物。第三引物任选地包含 sw位点。在进一步的实施方案中，第三引物与sw引物组一起用于核酸扩增。
28.在一个实施方案中，探针的衰减型位点进一步包含一个结构，该结构包含天然核苷酸， 非天然核苷酸，脱碱基结构，间隔子，荧光标记修饰的核苷酸，dna序列中包含脱氧尿 苷的非典型核苷酸，化学合成的核苷酸或上述的组合。衰减型位点位于探针的中心和第二 个标记之间。它被配置为防止探针分子被用作引物或会被复制的模板，以免在非特异性反 应中产生假阳性信号。
29.在一个实施方案中，第一sw引物进一步包含：(i)5'锚定区，(ii)第一5'识别区，(iii) 3'延伸区，(iv)位于5'识别区域和3'延伸区域之间的第一sw位点。
30.在一个实施方案中，第二sw引物进一步包含：(i)第二5'识别区，(ii)3'识别区，(iii) 靠近中心区的第二sw位点。
31.在一个实施方案中，对包含相关核酸序列的靶分子进行嵌套式扩增的反应包括sw方 法，所述方法包括：(i)使用聚合酶延伸第一sw引物以产生靶分子的突变互补链；(ii) 使用第三引物从突变互补链产生突变模板链；(iii)使用第二sw引物和第三引物扩增突 变互补链和突变模板链。第二sw引物被配置为与突变模板链完全匹配。
32.在一个实施方案中，当探针与其靶标分子杂交以形成双链结构时，利用聚合酶的3'
→
5' 核酸外切酶活性可以有效地切除探针3'端处的第二标记。探针的第一标记和第二标记包括 荧光染料
‑
猝灭剂对或类似物。
33.在一个实施方案中，第一sw引物和/或第二引物的3'末端包含分子分部。该分子分部 与相关靶核酸序列不互补。
34.在一个实施方案中，将分子分部配置为在使用聚合酶延伸第一sw引物和/或第二引 物之前被切除。
35.在一个实施方案中，分子分部包含核苷酸和/或核苷酸类似物，它们选自包含如下成 分的成分组：肌苷，含尿嘧啶的核苷酸，异脱氧胞嘧啶(iso
‑
dc)，异脱氧鸟苷(iso
‑
dg)， 二氨基嘌呤，2,4
‑
二氟甲苯，4
‑
甲基苯并咪唑，尺寸扩展的腺嘌呤(xa)，尺寸扩展的鸟嘌 呤(xg)，尺寸扩展的胞嘧啶(xc)，尺寸扩展的胸腺嘧啶(xt)，2
‑
(((2r，4r，5r)
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四氢
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羟基
‑5‑
(羟甲基)呋喃
‑2‑
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甲基异喹啉
‑
1(2h)
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硫酮(d5sics)，1,4
‑
无水
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脱氧
‑1‑
c
‑
(3
‑
甲氧基2
‑
萘基)
‑
(1r)
‑
d
‑
赤型戊糖醇(dnam)，脱碱基核苷酸，无环核苷 酸，标记的核苷酸或上述的组合。
36.在一个实施方案中，第一sw引物进一步包含具有至少1至10个单元的衰减型位点。 所述衰减型位点包含至少1至10个单元，其中聚合酶在延伸或扩增反应过程中不会越过 第一sw引物的衰减型位点。
37.在一个实施方案中，所述衰减型位点还包括一个包含下列成分的结构：天然核苷酸， 非天然核苷酸，脱碱基结构，间隔子，荧光标记修饰的核苷酸，包含脱氧尿苷的非典型核 苷酸，化学合成的核苷酸结构或上述成分的组合。
38.在一个实施方案中，靶分子由逆转录产生。用非分离的核酸样品进行扩增反应。使用 热循环仪或基于热对流的恒温装置进行扩增反应。
39.一个实施方案涉及一种被配置为检测和定量包含相关核酸序列或其变体或两者组合 体的靶分子的组合物。所述组合物包含扩增包含一对扩增引物的引物组；包含下列特征的 探针：(i)衰减型位点，(ii)在非3'位点的第一标记，和(iii)在3'端的第二标记；具有 3'
→
5'核酸外切酶活性的聚合酶。所述组合物被配置为通过不间断的嵌套式核酸扩增来检 测和定量相关的靶核酸分子或其变体。
40.在一个实施方案中，使用聚合酶的3'
→
5'核酸外切酶活性有效地切除探针3'端的第二 标记。
41.在一个实施例中，第一标记和第二标记包括荧光染料
‑
猝灭剂对或其类似物。
42.在一个实施方案中，引物组的3'末端包含一个分子分部，其中该分子分部与相关靶分 子序列不互补。
43.在一个实施方案中，所述衰减型位点包含至少1至10个单元，所述单元选自天然核 苷酸，非天然核苷酸，脱碱基结构，间隔子，荧光标记修饰的核苷酸，包含脱氧尿苷的非 典型核苷酸，化学合成的核苷酸或上述的组合组成。衰减型位点位于探针的中心和第二个 标记之间。它被配置为防止探针分子被用作引物或会被复制的模板，以免在非特异性反应 中产生假阳性信号。
44.一个实施方案涉及一种组合物，所述组合物被配置为通过不间断的嵌套式核酸扩增来 检测和/或定量包含相关核酸序列或其变体的靶分子。该组合物包含：一组寡聚核苷酸， 其包含：(a)包含第一sw位点的第一sw引物，(b)包含第二sw位点的第二sw引物， (c)至少一个第三个引物；探针，其包含：(i)衰减型位点，(ii)在非3'位点的第一标记， 和(iii)在3'端的第二标记；具有3'
→
5'核酸外切酶活性的聚合酶。所述组合物被配置为 通过不间断的嵌套式核酸扩增来检测和/或定量包含相关核酸序列或其变体的靶分子。
45.在一个实施方案中，第一sw位点和第二sw位点包含由至少1至10个核苷酸组成 的核酸序列，所述序列与包含相关核酸序列的靶分子不互补。第三引物任选地包含sw位 点。
46.在一个实施方案中，第一sw引物进一步包含：(i)5'锚定区，(ii)第一5'识别区，(iii) 3'延伸区，和(iv)第一sw位点在5'识别区域和3'延伸区域之间。
47.在一个实施方案中，第二sw引物进一步包含：(i)第二5'识别区，(ii)3'识别区，(iii) 靠近中心区的第二sw位点。
48.在一个实施方案中，探针的第一标记和第二标记包括荧光染料
‑
猝灭剂对或其类似物。
49.在一个实施方案中，第一sw引物和/或第二引物的3'末端包含分子分部。分子分部与 包含相关核酸序列的靶分子不互补。
50.在一个实施方案中，第一sw引物进一步包含具有至少1至10个单元的衰减型位点， 该单元选自天然核苷酸，非天然核苷酸，脱碱基结构，间隔子，荧光标记
‑
修饰的核苷酸， 包含脱氧尿苷的非典型核苷酸，化学合成的核苷酸或上述的组合。
51.一个实施方案涉及一种试剂盒，所述试剂盒被配置为检测和定量包含相关核酸序列或 其变体的靶分子。试剂盒包括：包含一对扩增引物的引物组；探针，其包含：(i)衰减型 位点，(ii)在非3'位点的第一标记，和(iii)在3'端的第二标记；具有3'
→
5'核酸外切酶 活性的聚合酶。该试剂盒被配置为通过不间断的嵌套式核酸扩增来检测和定量相关靶核酸 分子或其变体。
52.在一个实施方案中，使用聚合酶的3'
→
5'核酸外切酶活性有效地切除探针3'端的第二 标记。
53.在一个实施方案中，第一标记和第二标记包括荧光染料
‑
猝灭剂对或其类似物。
54.在一个实施方案中，引物组的3'末端包含分子分部。分子分部与相关靶分子序列不互 补。
55.在一个实施方案中，所述衰减型位点包含至少1至10个单元，所述单元选自由下列 组成的单元组：天然核苷酸，非天然核苷酸，脱碱基结构，间隔子，荧光标记修饰的核苷 酸，包括脱氧尿苷的非典型核苷酸，化学合成的核苷酸或上述的组合。衰减型位点位于探 针的中心和第二个标记之间。它被配置为防止探针分子被用作引物或会被复制的模板，以 免在非特异性反应中产生假阳性信号。
56.实施方案涉及试剂盒，该试剂盒被配置为通过无间断嵌套式核酸扩增来检测和/或定 量包含相关核酸序列或其变体的靶分子。所述试剂盒包含：一组寡聚核苷酸，其包含：(a) 包含第一sw位点的第一sw引物，(b)包含第二sw位点的第二sw引物，(c)至少一 个第三个引物；探针，其包含：(i)衰减型位点，(ii)在非3'位点的第一标记，和(iii) 在3'端的第二标记；具有3'
→
5'核酸外切酶活性的聚合酶。该试剂盒被配置为通过不间断 的嵌套式核酸扩增来检测和/或定量包含相关核酸序列或其变体的靶分子。
57.在一个实施方案中，第一sw位点和第二sw位点包含由至少1至10个核苷酸组成 的核酸序列,所述序列与包含相关核酸序列的靶分子不互补。第三引物任选地包含sw位 点。
58.在一个实施方案中，第一sw引物进一步包含：(i)5'锚定区，(ii)第一5'识别区，(iii) 3'延伸区，和(iv)第一sw位点在5'识别区域和3'延伸区域之间。
59.在一个实施方案中，第二sw引物进一步包含：(i)第二5'识别区，(ii)3'识别区，(iii) 靠近中心区的第二sw位点。
60.在一个实施方式中，探针的第一标记和第二标记包括荧光染料
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猝灭剂对或其类似物。
61.在一个实施方案中，第一sw引物和/或第二引物的3'末端包含分子分部，其中该分子 分部与包含相关核酸序列的靶分子不互补。
62.在一个实施方案中，第一sw引物进一步包含具有至少1至10个单元的衰减型位点， 所述单元选自天然核苷酸，非天然核苷酸，脱碱基结构，间隔子，荧光标记
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修饰的核苷 酸，包括脱氧尿苷的非典型核苷酸，化学合成的核苷酸或上述的组合。
63.本公开的其它方面和优点对于本领域技术人员将在以下详细描述中变得显而易见，其 中仅对本公开的说明性实施方案作出图示和描述。人们将会认识到，本公开内容能
“
下方”，“向前”，“反向”等描述，如果有的话，仅用于描述目的而未必用于指明永久性 相对位置。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，以使得本文所述的装 置，方法和/或制品的实施例能够以不同于所示或另有说明的其它方位进行操作。
81.除非明确地描述，否则本文中使用的组成，动作或指令均不应被解释为关键或必要的。 另外，如本文所使用的，冠词“一”和“一个”旨在包括单数和复数，并且可以与“一个 或多个”互换使用。此外，如本文所使用的，术语“一组”旨在包括单数和复数物品(例 如，数个相关物品，数个不相关物品，数个相关物品与数个不相关物品的组合等)，并且 可以与“一个或多个(物品)”互换使用。在仅意指一项的情况下，则会使用术语“壹”或 类似语言。而且，如本文所使用的，术语“具有”等旨在是开放式(包括单数和复数)术 语。此外，除非另有明确说明，短语“基于”旨在表示“至少分部地基于”。
82.在不脱离本发明的精神或特征的情况下，本发明可以以其它特定形式实施。所描述的 实施例在所有方面仅应被认为是说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围体现于所附 权利要求书而不是前面的描述。落入权利要求等同含义和范围内的所有改变均应包含在权 利要求范围之内。
83.如本文所定义，在一些实施例中，“大约”可以表示在所述值的正负百分之十之内。 在其它实施例中，“大约”可以表示在所述值的正负百分之五之内。在另外的实施例中，
ꢀ“
大约”可以表示在所述值的正负百分之三之内。在其它实施例中，“大约”可以表示在 所述值的正负百分之一之内。
84.除非本文另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术 人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数 术语应包括单数。通常，与本文所述的健康监测相关的术语和技术是本领域公知的和通常 使用的那些。
85.除非另有说明,本发明的方法和技术的实施通常根据本领域公知的常规方法，和在本 说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述的方法。本文使用的命名 法，实施例中的过程和技术以及本文中所描述的其它相关领域是在本领域中众所周知的和 常用的。
86.术语“突变”是指多聚核苷酸序列中的改变。发生突变的多聚核苷酸序列称为“突变 体”。突变可被引入或发生在双链多聚核苷酸分子的一条或两条链上。其中双链多聚核苷 酸中发生突变的的一链称为“突变链”。通常，当突变链被复制时，互补链也将在相应位 点有突变。
87.术语“选择性松动(sw)引物”是指在延伸或扩增反应中使用的多聚核苷酸引物， 其中选择性地引入突变使得引物与靶序列的杂交位点(例如，靶序列中的引物位点)不完 全匹配。相对于靶序列(例如，靶dna分子的序列)，在选择性松动(sw)引物中包含 错配核苷酸的区域被称为“sw位点”或“sw”。sw引物可被设计或配置为可使其在适 当条件下通过dna聚合酶进行延伸。因此，在延伸或扩增反应期间，sw引物的错配核 苷酸被掺入延伸或扩增的产物中，从而导致突变的模板的互补链的合成。因此，选择性松 动(sw)引物用于引发突变靶序列的合成。当另一引物与突变的互补链杂交后可以复制 或扩增突变互补链，也就是以产生突变模板链。
88.术语模板的“突变互补链”是指使用靶模板链进行延伸或扩增反应所合成的且引
入 sw位点的互补链产物。在扩增反应中通过选择性松动(sw)引物将sw位点优选地引 入双链dna分子中。在扩增反应期间，通过将选择性松动(sw)引物与模板链杂交并使 用靶链作为模板延伸所杂交的引物，来合成模板的互补链的多个拷贝。
89.本文使用术语“互补的”是一广义概念，它指两个多聚核苷酸链上的区域或同一多聚 核苷酸链的两个区域之间的序列互补性。众所周知，第一多聚核苷酸区域的腺嘌呤(a) 残基能够与反之平行的第二多聚核苷酸区域的胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)残基形成特 异性氢键(“碱基配对”)。类似地，已知第一多聚核苷酸链的胞嘧啶(c)残基能够与与第 一链反平行的第二多聚核苷酸链的一个残基进行碱基配对，如果该残基是鸟嘌呤(g)。如 果当两个区域以反平行方式排列时，该第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的 一个核苷酸的残基进行碱基配对，则该多聚核苷酸的第一区域与相同或不同多聚核苷酸的 第二区域互补。当第一多聚核苷酸100％地与第二多聚核苷酸互补，则所有核苷酸位置都 形成碱基对。当一个多聚核苷酸不是100％互补(例如90％或80％或70％互补)，则在一 个或多个核苷酸位置包含错配的核苷酸。
90.在本文中用术语“dna”指脱氧核糖核酸(dna)，其是存在于所有原核和真核细 胞以及许多病毒中的具有复杂分子结构的有机化学物质。dna编码遗传信息以传递遗传 特征。原核和真核细胞中的dna由两条相互缠绕形成双螺旋的多聚核苷酸链组成。dna 的核苷酸由一个连接有磷酸基的脱氧核糖分子和以下四个含氮碱基之一组成：两个嘌呤(a 代表腺嘌呤，g代表鸟嘌呤)和两个嘧啶(c代表胞嘧啶，t代表胸腺嘧啶)。
91.术语“rna”在本文中用于指核糖核酸(rna)，它是高分子量的复杂化合物，在细 胞蛋白质合成中起作用并代替dna作为某些病毒的遗传密码载体。rna由通过磷酸二 酯键连接的核糖核苷酸(核糖上附加有含氮碱基)组成，可形成不同长度的链。rna中 的含氮碱基是腺嘌呤(a)，鸟嘌呤(g)，胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u，它取代dna中的 胸腺嘧啶)。
92.术语“聚合酶链反应(pcr)”在本文中用于指扩增核酸靶序列的方法，该方法涉及 dna复制的重复循环，其中1)使dna链变性以形成单链模板(变性步骤)；2)使寡 聚核苷酸引物与模板结合(退火步骤)；3)使用聚合酶延伸引物以产生复制的双链dna 分子(延伸步骤)；4)用复制出的dna分子作为模板用于另外的复制轮次(重复上述3 个步骤)。这些步骤可以通过同步热循环或不同步热对流循环进行。
93.术语“扩增”在本文中用于指用于指数地或线性地增加一个或多个多聚核苷酸序列靶 分子的数目的任何体外方法。核酸扩增导致核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，掺 入由引物引发的延伸链中，以形成与模板核酸分子互补的dna或rna多聚核苷酸。如 本文所用，一个扩增反应可以由多轮引物延伸组成。例如，一个pcr反应可以包括大约5 个至1000个或更多的包含变性，退火和延伸的循环。这种热循环可以在热循环仪中同步 地进行或在热对流装置(恒温装置)中不同步地进行。在热对流装置(恒温装置)中进行 dna扩增时，分子进行不同步的变性，退火和延伸循环。
94.本文使用的术语“扩增子”是指dna或rna片段，其是扩增或复制事件的来源和/ 或产物。它可以由多种方法人工合成，包括聚合酶链反应(pcr)，也可以自然地通过基 因复制来形成。
95.术语“核酸”或“核酸分子”在本文中用于指由单磷酸核苷组成的任何长度的聚物。 在生物化学上，核酸分子由三磷酸脱氧核糖核苷(dntps)，三磷酸核糖核苷(rntps)， 其类
似物和/或上述的组合合成。核酸也可以使用本领域已知的化学方法制备。核酸可以 具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。核酸的非限制性实例包括脱氧 核糖核酸(dna)，核糖核酸(rna)，肽核酸(pna)，锁核酸(lna)，氟化核酸(fna)， 桥连核酸(bna)，基因或基因片段的编码区或非编码区，通过连锁分析定义的基因座(基 因座)，外显子，内含子，信使rna(mrna)，转移rna，核糖体rna，短干扰rna (sirna)，短发夹rna(shrna)，微小rna(mirna)，核酶，互补dna(cdna)， 重组核酸，分支核酸，质粒，载体，具任何序列的经分离的dna，具任何序列的经分离 的rna，核酸探针和引物。核酸可包含一个或多个修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸， 染料修饰的核苷酸，淬灭剂标记的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰的话，对核苷酸 结构进行修饰可以在核酸组装之前或之后进行。核酸的核苷酸序列可以被非核苷酸组分， 例如，连接头，脱碱基结构或间隔子打断。
96.术语“核苷酸”在本文中用于指碱基
‑
糖
‑
磷酸的组合。核苷酸是核酸聚合物，例如dna 或rna，的单体单元,。该术语包括三磷酸核糖核苷，如ratp，rctp，rgtp或rutp，统 称为rntps或ntps；三磷酸脱氧核糖核苷，如datp，dctp，dutp，dgtp或dttp，统 称为dntps。“核苷”是碱
‑
糖组合，例如,缺少磷酸的核苷酸。在本领域中公认，在使用核 苷和核苷酸术语方面存在一定的互换性。例如，三磷酸核苷酸脱氧尿苷，dutp，是一个 三磷酸脱氧核糖核苷。掺入dna后，它作为dna单体，形式上是脱氧尿苷酸，即dump 或单磷酸脱氧尿苷。即使所得的dna中没有dutp分部，可能有人说可以将dutp掺入 到dna中。类似地，尽管脱氧尿苷只是底物分子的一部分,有人可以说将脱氧尿苷掺入到 dna中。
97.术语“核酸序列”在本文中用于指以某些或特定顺序排列的一系列连续的核苷酸或碱 基。核苷酸，碱基或核碱基的术语在本文中用作核酸序列的基本单元，因此可以相互交换。 核酸序列也可以指包含给定核苷酸序列或其互补序列的核酸分子(例如dna，cdna或 rna)。因此，术语“靶分子”或“靶核酸分子”或“靶核酸序列”或“相关核酸序列
”ꢀ
或“靶核酸”是指核酸序列或要检测或扩增的分子。术语“靶核酸序列”，“相关核酸序列”，
ꢀ“
靶核酸分子”，“靶分子”和“靶核酸”可互换使用。一种特定的靶核酸序列是可以与引 物杂交的核酸片段，区域或核酸分子的一个片段。取决于上下文，可以互换地使用核酸， 序列，靶标，分子，模板及其组合的术语，例如核酸序列，靶标序列，靶标核酸序列，核 酸分子。在一个实施方案中，相关核酸序列是衍生自sars
‑
cov
‑
2基因组rna的序列。 衍生的序列可以是片段，即基因组rna序列的区域。衍生的序列也可以是从基因组rna 序列逆转录的cdna序列。逆转录(rt)可以在pcr反应之前在同一试管中进行(例如， 包括嵌套式pcr，探针pcr，定量pcr或它们的组合)；因此，可以使用同一反应混合物 在同一试管中进行rt
‑
pcr，以检测病原体，例如sars
‑
cov
‑
2病毒，它是新型冠状病毒 肺炎(covid
‑
19)的致病因子。
98.本文使用的术语“退火”是指一个核酸分子(例如，引物)通过另一核酸分子(例如， 模板核酸分子)之间的互补性结合。其遵循常规的碱基配对规则，其中a与t或u成对， c与g成对。
99.术语“变性”在本文中用于指双链核酸分子的螺旋结构的全部或部分解旋，在一些实 施方案中指单链核酸的二级结构的解旋。
100.术语“反应混合物”或“扩增反应混合物”是包含完成引物延伸反应，逆转录和/或 核酸扩增所必需的一种或多种试剂的组合物，这些试剂的非限制性实例为：包括对靶核酸 具有特异性的一种或多种引物，例如用于非特异性逆转录的随机引物，dna聚合酶，合 适的
缓冲液，辅因子(例如二价和一价阳离子)，核苷酸(例如三磷酸脱氧核糖核苷 (dntps))，以及任何其它酶，例如逆转录酶。在一些实施方案中，反应混合物还可以 包含一种或多种可检测物质，例如荧光染料和猝灭剂。
101.术语“扩增反应”在本文中用于指用于扩增核酸靶序列分子的任何体外手段。
102.在本文中使用的术语“终止”是指引起工作的停止。该术语包括永久性和临时性或有 条件的停止。例如，如果工作是酶促的，则永久停止可能是一个或多个参与催化酶促反应 分子的热变性。有条件的停止可能是，例如，可在一种或多种分子的活性范围之外的温度 下孵育酶促催化反应，但在该温度下分子不会永久失去活性。这两种类型的终止均旨在落 入该术语的范围内。
103.术语“寡聚核苷酸”在本文中用于指各种长度的单链核酸分子(rna或dna)。该 术语与本领域的其它术语(例如“多聚核苷酸”，“引物”和“探针”)共同使用和互换使 用。注意，尽管寡聚核苷酸，多聚核苷酸，引物和探针是不同的技术术语，但是它们之间 没有确切的分界线。这些术语在本文中可互换使用。
104.术语“引物”或“扩增引物”在本文中用于指能够与模板分子杂交并通过共价键添加 核苷酸单体来起始延伸的单链寡聚核苷酸或单链多聚核苷酸，例如，在扩增反应期间。核 酸扩增通常是基于核酸聚合酶的核酸合成。许多这样的聚合酶需要引物的存在，该引物可 以被延伸以启动这种核酸合成。
105.术语“3'”在本文中用于指相对同一多聚核苷酸或寡聚核苷酸中的另一区域或位置， 处于其3'端(下游)的下游方向，区域或位置。
106.术语“5'”在本文中用于指相对同一多聚核苷酸或寡聚核苷酸中的另一区域或位置， 处于其5”端(上游)的上游方向，区域或位置。
107.短语“寡聚核苷酸依赖性扩增”在本文中用于指使用寡聚核苷酸或多聚核苷酸或探针 或引物扩增核酸分子的扩增反应。寡聚核苷酸依赖性扩增是需要有一个或多个寡聚核苷酸 或多聚核苷酸或探针或引物的任何扩增，所述寡聚核苷酸或多聚核苷酸或探针或引物的长 度为两个或多个单核苷酸亚基，并且最终成为新形成的经扩增的核酸分子的一部分。短语
ꢀ“
模板依赖性扩增”在本文中用于指涉及复制核酸模板分子的核酸扩增。通常，模板依赖 性扩增还涉及到引物。
108.短语“热稳定聚合酶”在本文中用于指对热相对稳定并且能够催化从现有核酸模板形 成dna或rna的酶。热稳定的聚合酶的一个例子是热稳定的dna聚合酶，其对热相对 稳定并且能够催化三磷酸核苷的聚合以形成与靶序列的核酸链之一互补的引物延伸产物。 酶在引物的3'端开始合成反应，并朝着模板的5'端方向进行直至合成终止。根据其结构和 性质，dna聚合酶可分为不同的家族。a族dna聚合酶包括taq dna聚合酶，该酶具 有5'
→
3'核酸外切酶活性，这是pcr中最常用的热稳定dna聚合酶。b族dna聚合酶 包括pfu dna聚合酶。b族聚合酶有高度精确的功能，并能通过3'
→
5'核酸外切酶活性 对新合成的dna进行校对，以纠正dna复制过程中发生的任何错误。这些以及来自各 种商业供应商的其它热稳定dna聚合酶可用于核酸扩增或pcr。dna聚合酶的3'
→
5' 核酸外切酶活性可以从核酸链的3'端开始依次逐一切除核苷酸。优选的底物是双链dna 分子中的错配核苷酸。因此，当相应的引物或探针杂交或退火以形成双链结构时，非互补 核苷酸，核苷酸类似物或分子分部可被有效地切除。
109.术语“引物延伸反应”在本文中用于指引物与核酸链的结合(例如，“退火”)，随后， 使用核酸链作为模板，将核苷酸掺入(例如，“延伸”)到引物3'端上。引物延伸反应可以 借助于酶，例如聚合酶来完成。
110.术语“解链温度(tm)”或解链点在本文中用于指在该温度下，杂交并形成双链分子 的两个单链核酸分子彼此解离。解链温度指的是在相同双链核酸分子群体中约5％，10％， 15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％， 80％，85％，90％，95％，99％或更多相同核酸链从其各自的补体链解离。例如，引物或 分子分部的解链温度可以指一个温度，在此温度下与核酸分子杂交的相同引物或分子分部 的分子群体中的引物或分子分部的约一半(50％)从它们各自的核酸分子互补序列上解离。 核酸分子的解链温度可以基于核酸分子的序列通过任何合适的计算方法来计算。
111.术语“热循环仪”在本文中用于指用于核酸扩增反应的仪器，该仪器包括用于交替加 热或冷却样品的多个热循环。术语“热对流装置”在本文中是指用于温度控制的仪器，其 中装有反应混合物的试管的下部设置为较高的温度(较低的液体密度)，相对而言同一试 管上部的液体温度较底(较高的液体密度)，由于密度梯度而导致液体对流。
112.术语“样品”在本文中用于指任何待测试的含核酸的样品。样品可以是包含适合于实 施本发明方法的核酸分子的任何生物材料。
113.术语“纯化的”在本文中用于指相关的分子已经从在其周围的部分或所有其它分子和 /或材料分离。因此，“纯化的”是相对术语，它是关于所需分子与其它分子的紧密接近情 度的变化，即处于自由状态。例如，与其它生物或非生物材料粘附，附着，结合(共价或 非共价)和/或缔合的核酸就可以被认为是纯化的当在细胞裂解后至少有部分细胞碎片， 蛋白质和糖类通过清选被除去。当使用本发明的方法或组合物将同样的核酸从其它材料中 释放出来时，此核酸则被再次纯化。
114.术语“分离的”在本文中用来表示相关的分子已经基本上从在天然状态下与以之相联 的所有分子和/或材料中分离出来。或者，分离是指该分子与其它分子分开或没有与其它 分子共存(核酸分离步骤)。在确定生物分子是否是分离时，水，盐和缓冲液等物质的浓 度不在考虑之中。因此，非分离的核酸样品是不经过核酸分离步骤的样品。
115.术语“模板”在本文中指分子链，它被dna聚合酶或rna聚合酶分别用于在dna 复制或rna转录期间连接互补碱基；任一分子都沿5'
→
3'方向(或模板的3'
→
5'方向)沿 链向下移动，并且在每个后续碱基处，它将当前dna碱基的互补碱基添加到正在生长的 核酸链中(因此产生5'
→
3'方向性)。
116.术语“dntp”是指三磷酸脱氧核糖核苷。嘌呤碱(pu)包括腺嘌呤(a)，鸟嘌呤(g) 及其衍生物和类似物。嘧啶碱基(py)包括胞嘧啶(c)，胸腺嘧啶(t)，尿嘧啶(u)及 其衍生物和类似物。此类衍生物或类似物的实例，以举例说明而非限制的方式，是经报告 基团修饰，生物素化，胺基修饰，放射性标记，烷基化等修饰的类衍生物或类似物，且还 包括硫代磷酸酯，亚磷酸酯，核碱基环原子修饰的衍生物等。报告基团可以是荧光基团例 如荧光素，猝灭剂，化学发光基团例如鲁米诺，铽螯合剂例如n
‑
(羟乙基)乙二胺三乙 酸，其能够通过延迟的荧光而被检测。
117.术语“定量pcr(qpcr)”或“实时pcr”在本文中用于指基于pcr的技术，其将 靶dna序列的扩增与定量该dna种类在反应中的输入浓度耦合在一起。qpcr使用dna 扩增的对数
标度来确定样品中已知序列的绝对或相对量。通过在反应中使用荧光报告基团， 可以在qpcr分析中测量dna扩增。在qpcr中，在pcr的每个循环中都监测dna扩 增。当dna处于扩增的指数阶段时，荧光量会增加到背景以上。使荧光达到可测量的循 环数称为循环阈值(ct)或交叉点。通过对已知量的标准dna进行多重稀释，可以生成 对数浓度对ct的标准曲线。然后可以在pcr(对于dna作为输入模板)或rt
‑
pcr反 应(对于rna作为输入模板)中通过其ct值计算出未知样品中dna，cdna或rna 的输入量。当将热对流装置用于核酸扩增时，“荧光定量pcr”或定量是通过荧光信号随 时间变化的拐点进行的。当将热对流装置用于核酸扩增时，“实时pcr”是指实时数据收 集和实时显示。
118.术语“杂交”在本文中用于指rna或dna的互补链的缔合以形成dna
‑
dna， dna
‑
rna或rna
‑
rna的双链分子。
119.术语“探针”在本文中用于指受标记的多聚核苷酸或寡聚核苷酸序列，其与特定分析 物的多聚核苷酸或寡聚核苷酸序列互补并与所述分析物杂交。在本发明中，分析物是相关 靶核酸序列。探针通常包含一个或多个标记。标记是附着于探针分子的标签或可检测分部。 例如，探针可以具有淬灭剂标记或荧光染料标记。
120.术语“扩增曲线”在本文中指将每个样品的荧光信号相对于循环数作图时产生的曲线； 因此，扩增图代表了qpcr实验期间的产物累积。在真实的qpcr分析中，通过荧光信号 的累积检测到阳性反应。ct(循环阈值)定义为荧光信号越过阈值(即超过背景水平) 所需的循环数。用于创建曲线图的样品是靶dna序列的稀释系列。当热对流设备用于不 同步的核酸扩增时，荧光信号可以被实时监控和显示。因此，通过拐点时间而不是ct来 测量输入模板量，该拐点时间与输入核酸模板分子的量成反比。
121.术语“猝灭剂”在本文中用于指当紧邻时(相隔2至50个核苷酸)可吸收报告基团 发射的荧光的分子或分子分部。常用的淬灭剂包括tamra(荧光性)和非荧光性的 dabcyl和黑洞淬灭剂(bhq)染料。淬灭剂通常位于双标记探针的一端。猝灭剂染料 也称为受体。淬灭剂的效率随着其吸收光谱与报告染料的荧光发射光谱重叠度增加以及淬 灭剂吸收光谱变宽(对于bhq最高)而提高。
122.术语“taqman探针”在本文中用于指一种探针结构，其中5'标记可以被taq dna 聚合酶的5'
→
3'核酸外切酶活性切除(水解)。使用探针是以增加定量pcr的特异性。 taqman探针的原理是依靠用taq dna聚合酶的5'
→
3'核酸外切酶活性去切除与互补靶序 列杂交的双标记探针和基于对荧光团的检测。与其它定量pcr方法一样，所产生的荧光 信号允许定量测量在pcr指数阶段的产物累积；但是，taqman探针显著地提高了检测的 特异性。taqman探针的3'末端通常无法被3'
→
5'核酸外切酶切除。当它被核酸内切酶在 3'末端切除后，所得的寡聚核苷酸将用作延伸的引物或延伸后被复制的模板。
123.术语“杂交探针”在本文中用于指可以被放射性或荧光标记的各种长度(通常为 10
‑
1000个碱基长)的dna或rna片段。然后可以将其用于dna或rna样品中，以检 测与探针序列互补的核苷酸物质(rna靶标)的存在。因此，探针与单链核酸(dna或 rna)杂交，由于探针和靶标之间的互补性，其碱基序列允许探针与靶标碱基配对。
124.术语“核酸外切酶活性”在本文中用于指通过从多聚核苷酸链的末端一次一次地切除 (外切)核苷酸而起作用的酶活性。因此外切酶反应是发生在3'或5'末端断裂磷酸二酯键 的水解反应。它的近亲是核酸内切酶活性。但是，常用的pcr酶，即taq dna聚合酶， 具
有5'
→
3'核酸外切酶活性，这是目前已知的qpcr方法的基本特征。
125.术语“荧光染料”或“荧光标记”在本文中用于指分子或分子分部，该分子或分子分 部在一个波长处吸收一定量的电磁辐射并对此作出回应，在不同的，通常更长的波长处发 射一个或多个光子。
126.术语“病毒”在本文中指不能在宿主细胞外生长或繁殖的亚显微感染因子。它不是细 胞，但由dna或rna核心及包裹其的蛋白质外壳组成。病毒是无法自行繁殖的小型寄 生物。但是，一旦感染了易感细胞，病毒就可以指导细胞机制产生更多的病毒颗粒。
127.一个实施方案部分地涉及通过嵌套式扩增定量和检测靶核酸序列的方法。更具体地， 实施方案部分地提供了用于单管定量嵌套式pcr扩增和对靶核酸序列进行实时或定量 pcr的方法。在扩增反应中使用至少三种在大多数情况下具不同核苷酸序列的引物。通常， 至少一种引物将包含至少一个sw位点或错配区域。此外，在许多情况下，这些sw位点 与引物中存在的其它区域结合，将用于在扩增反应期间改变引物与模板核酸分子的杂交。 例如，可以将引物中存在的sw位点的位置与引物的其它区域或条件结合使用，以改变引 物与模板的结合亲和力，从而参与扩增反应。换句话说，更高的结合亲和力增加了引物杂 交的可能性从而使得它们能够以时程方式在扩增反应中起作用。靶分子包含相关核酸序列。 靶分子可以是dna或rna的单链或双链核酸序列。
128.一个实施方案提供了一种方法，组合物和试剂盒，其利用具有不能通过聚合酶活性延 伸和/或防止在pcr过程中被复制的衰减型位点的探针。衰减型位点位于探针的中心和第 二个标记之间。它被配置为防止探针分子被用作引物或会被复制的模板，以免在非特异性 反应中产生假阳性信号。具有衰减型位点的探针在非3'位点还包含第一个标记，在3'端包 含第二个标记。非3'位点是5'末端位置或内部位点，位于探针分子第二个标记5'上游处。 当探针与其靶标杂交以形成双链结构时，可利用聚合酶的3'
→
5'核酸外切酶活性有效切除 在探针3'端的第二个标记。第二个标记位于第一个标记的3'下游，相隔1
‑
50个核苷酸。因 此，位于3'端的第二个标记可以是相对于第一个标记在3'方向上的标记；它可以位于终端 位置，也可以位于包含1
‑
3个单元的3'终端附近的内部站点中。当标记的核苷酸和末端核 苷酸与模板中的相应核苷酸不匹配时，第二个标记可以有效地被切除。插入到寡聚核苷酸 3'末端的c3间隔子可作为有效的封闭剂，抵抗pcr反应中的聚合酶延伸。探针的3'末端 标记是可切除的或可有效地被切除，即指直接从与之缔合的多聚核苷酸上切除或与与之缔 合的核苷酸一起切除。标记可以是淬灭剂或荧光染料。在探针中，标记之一可以是荧光染 料，另一个可以是淬灭剂。猝灭剂和染料形成荧光染料
‑
猝灭剂对，其中猝灭剂能够吸收 染料在被激发时发射的荧光。在一个实施方案中，在具有非3'第一标记的探针分子中，将 c3间隔子置于第二标记的5'旁边。当探针与相关分子杂交时，第二个标记被dna聚合酶 的3'
→
5'核酸外切酶活性切除，形成被c3间隔子封闭的寡聚核苷酸并导致增强的荧光发 射。
129.一个实施方案提供了一种反应混合物，其包括一个或两个正向引物，一个探针，一个 或两个反向引物以及一种靶分子，该靶分子包含包括靶标区域的相关核酸序列，例如源自 sars
‑
cov
‑
2病毒的序列，具有3'
→
5'核酸外切酶活性的dna聚合酶，逆转录酶，随机引 物，一组dntp和缓冲液系统。具有sw位点的引物也称为选择性松动(sw)引物。sw 引物可以是正向或反向引物或两者。正向引物和反向引物可用于扩增包括靶区域的模板多 聚核苷
酸上的区域。第三引物被配置为反向引物或正向引物，这意味着其方向与sw引物 的方向相反，从而可以进行pcr反应。反应混合物可以另外包括外部引物，其中外部引 物被配置为扩增或富集适用于sw引物的模板核酸分子。
130.在一个实施方案中，第一sw引物包含(i)长的5'锚定区，(ii)5'识别区，(iii)3' 延伸区和(iv)sw位点，其中sw该位点位于5'识别区和3'延伸区之间(如图1b所示)。 第二个sw引物包括一个5
′
识别区，(ii)一个长的3
′
识别区，和(iii)一个sw位点， 其中第二个sw位点靠近中心区域(如图1c所示)。两种引物(第一个sw引物和第二个 sw引物)的5'识别区相互重叠，并与靶分子互补。第二个sw引物的3'识别区域比第一 个sw引物的3'延伸区域相对更长(如图1a所示)。包含第一sw引物和第二sw引物的 引物组被配置为正向sw引物组或反向sw引物组。第三引物被配置为反向引物或正向引 物，第三引物任选地包含sw位点。
131.一个实施方案涉及引物的sw(选择性松动)位点。在此，术语“选择性松动”是指 由与靶序列或模板序列不互补的1
‑
10个核苷酸组成的引物区域。在一些实施方案中，用 于反应混合物的正向引物与核酸模板互补，除了至少1
‑
10个核苷酸长的错配区。在一些 实施方案中，除了至少1
‑
10个核苷酸长的错配区域之外，反应混合物中使用的反向引物 与核酸模板互补。至少1
‑
10个核苷酸长的错配区域称为sw位点。sw位点是与模板不 互补的至少1至10个核苷酸的核酸序列。这些sw位点与靶核酸序列不互补。具有这些 sw位点的引物称为选择性松动(sw)引物。
132.在一个实施方案中，第一sw引物的sw位点靠近或接近第一sw引物的3'端。在对 靶标分子进行单管不间断的嵌套式扩增方法中，在嵌套式pcr扩增的开始阶段或在单管 嵌套式pcr的第一个循环中(如图2所示)，正向引物或第一个具有较长5'锚序列的sw 引物在特定位点与相关模板分子退火，从而与相关模板分子形成稳定的杂交体。与靶模板 分子互补的引物3'端在聚合酶的作用下得到延伸，以产生与靶模板分子互补的突变链。在 单管嵌套式pcr扩增的第一个循环中产生的突变互补链包含第一个sw引物的sw位点。 在单管嵌套式pcr扩增的下一个循环中，使用反向引物复制突变互补链。反向引物延伸 并将sw位点复制到新合成的模板分子中，产生与第一sw引物产生的突变互补链互补的 突变模板链(或突变模板)。
133.在一个实施方案中，第一sw引物具有锚定序列(如图1b所示)。设计锚定序列以与 模板形成稳定的交体。在此使用的术语“锚定序列”是指位于与靶模板分子互补的第一 sw引物的5'末端的序列。用另一个引物复制得到的突变互补链(与模板互补)，复制的链 成为第二个sw引物的靶标模板序列。第二sw引物的sw位点与原始输入模板分子不互 补，但与从第一sw引物延伸的突变链衍生出的突变模板互补。本文所述的第一sw引物 (包括引物组的引物)或寡聚核苷酸(包括寡聚核苷酸组的寡聚核苷酸)的锚定序列的长 度可以根据具体的引物或寡聚核苷酸而变化。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡聚 核苷酸的锚定序列的长度可为约2个核苷酸至约20个核苷酸长。
134.在一个实施方案中，第一sw引物具有至少一个引物延伸区，所述引物通过dna聚 合酶使其延伸。在一些实施方案中，引物延伸区位于第一sw引物的3'端，在锚定区，识 别区和sw位点的下游。本文所述的第一sw引物(包括引物组的引物)或寡聚核苷酸(包 括寡聚核苷酸组的寡聚核苷酸)的引物延伸区的长度可以根据具体的引物或寡聚核苷酸而 变化。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡聚核苷酸的引物延伸区的长度可以为约2 个核苷酸
至约20个核苷酸长。在引物延伸反应期间，聚合酶通常可以以模板指导的方式 向退火至单链核酸模板分子的引物的3'端添加核苷酸。
135.在一个实施方案中，第二sw引物包含靠近第二sw引物的中心区域的sw位点。更 优选地，第二个sw引物中的sw位点在5’识别区的下游。由于sw位点靠近或靠近第二sw引物的中心区域，第二sw引物与原始输入模板核酸分子之间的杂交体远不如第一sw 引物与靶模板分子之间的杂交体稳定。因此，第二sw引物几乎没有机会延伸形成靶模板 分子的突变链。
136.在一个实施方案中，第二sw引物复制或扩增由反向引物产生的含sw位点的突变模 板链。突变的模板链包含sw位点。由于第二个sw引物的3'识别区很长，并且与突变区 域的sw位点相匹配，因此第二个sw引物极有可能与突变模板链退火并形成稳定的杂交 体。由于第二sw引物位于第一sw引物的相对下游并产生缩短或截短的产物，因此在单 管嵌套式pcr扩增的后续循环中，第二sw引物对突变模板链的亲和力高于第一sw引 物。
137.在一个实施方案中，与第一sw引物相比，第二sw引物较长的3'识别区和具有与突 变序列匹配的sw位点使得第二sw引物能够与突变模板链稳定地杂交。第二sw引物与 突变模板链完全互补。用第二sw引物扩增突变模板链变得更有效。因此，通过第二个 sw引物与突变模板链进行退火的高度可能性，第二个sw引物可以在单管pcr的后续循 环中“插入”，而第一个sw引物与突变且截短的模板链结合亲和力较低，因此“第一个
”ꢀ
sw引物在扩增中“退出”。因此，在单管嵌套式pcr的后续循环中发生“引物转换”，即 在靶分子的嵌套扩增扩增中，第一个sw引物转换到第二个sw引物。
138.在一个实施方案中，探针包含：(i)衰减型位点，(ii)在非3'位点的第一标记，和(iii) 在3'端的第二标记。衰减型位点位于探针的中心和第二个标记之间。它被配置为防止探针 分子被用作引物或会被复制的模板，以免在非特异性反应中产生假阳性信号。非3'位点是 5'末端位置或内部位点，位于探针分子第二个标记5'上游处。第二个标记位于第一个标记 的3'下游，相隔1
‑
50个核苷酸。因此，位于3'端的第二个标记可以是相对于第一个标记在 其3'方向的标记；它可以位于终端位置，也可以位于包含1
‑
3个单元的3'终端附近的内部 站点中。
139.在一个实施方案中，单管嵌套式pcr的方法包括(如图2所示)：将第一sw引物退 火至靶模板分子以形成稳定的杂交体。通过聚合酶的作用使与模板互补的引物3'端在引物 延伸反应中延伸，以产生靶模板分子的突变互补链。在单管巢式pcr的第一个循环中产 生的突变互补链包含第一个sw引物的sw位点的。在单管嵌套式pcr的下一个循环中， 使用反向引物复制靶标模板分子的突变互补链。用反向引物延伸导致突变模板链(具有 sw位点的模板分子)的产生。第二sw引物以高亲和力复制或扩增突变模板链。
140.在一个实施方案中，正向引物可包括外部引物和用sw引物作为内部引物。因此，当 外部引物参与初始扩增而产生更多模板分子时，该方法使得利用第一sw引物的初始扩增 反应在起始时就有效地成为主要的扩增反应。然而，要试图结束该扩增(外部引物扩增) 以便利用第二sw引物进行扩增。随着条件的变化，因此将外部引物正在进行的不希望有 的扩增减至最少，此时内部引物的扩增可以在促进其有效扩增的条件下进行。外部引物用 于通过为正向引物提供更多模板分子而提高检测灵敏度(如图7所示)。
141.在一个实施方案中，适合用于本发明的引物设计和合成对于本领域技术人员而言
是熟 知的。引物和寡聚核苷酸的tm值很大程度上取决于pcr各个阶段所需的退火温度。本 发明的引物可以具有达到功能目的的任何合适的长度。
142.一个实施方案涉及本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡聚核苷酸(包括寡聚核 苷酸组的寡聚核苷酸)，其3'端可包含与靶核酸分子非互补和/或非粘合性的分子分部(3' 非互补分部，如图3a至3b所示)。3'端的分子分部具有三个功能特征：(i)由于不互补 而不能延伸或不能有效地延伸，(ii)可被酶切除以使寡聚核苷酸可延伸，(iii)如果延伸， 则因非互补或与聚合酶的强结合性而不会被复制。与核酸单元强结合的聚合酶的实例是与 含有尿嘧啶的核苷酸结合的古细菌聚合酶。因此，必须去除此引物3'分子分部，以有效地 扩增核酸。
143.在一个实施方案中，本文所述的引物或寡聚核苷酸的分子分部可适于防止形成包含引 物(例如，正向引物)的引物二聚体副产物或包含寡聚核苷酸的寡聚核苷酸二聚体副产物。 例如，本文所述的引物或寡聚核苷酸中分子分部的存在可降低引物或寡聚核苷酸与另外的 引物或寡聚核苷酸的结合亲和力(或防止其结合)。例如，分子分部的存在还可以减少或 消除使用另一种引物或寡聚核苷酸作为模板在扩增反应中延伸引物或寡聚核苷酸的可能 性。通过dna聚合酶的3'
→
5'核酸外切酶活性除去分子分部后，即可延伸引物或寡聚核 苷酸。这可能发生在pcr反应中，其中带有3'非互补分部的引物与模板分子杂交，然后 与dna聚合酶结合。dna聚合酶遇到3'非互补分部，并在延伸引物之前利用其3'
→
5' 核酸外切酶活性对其进行切除。对正向引物和反向引物两者或两者之一来说，这种程况可 能同时发生在同一扩增循环中，也可能发生在热对流循环中的不同时间中。就包含各自包 含分子分部的第一sw引物和第二sw引物的引物组来说，两个分子分部中的一个或两个 可以用于防止形成包含正向引物和/或反向引物的引物二聚体分子复合物。
144.在一个实施方案中，分子分部可以是任何合适的物质。分子分部可包含一个或多个磷 酸二酯键。分子分部的非限制性实例包括核苷酸，核酸和非核苷酸种类(例如氨基酸，肽， 蛋白质，碳水化合物，烃链(例如聚乙二醇(peg)))，n
‑
磷酸分部(其中“n(大于或 等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，磷酸二酯键连接的杂共轭物，染料和有机金属 络合物。而且，分子分部还可包含通过共价键连接在一起的单个亚基或分子种类(连续或 不连续)。这样的单个种类或亚基可以是，例如，核酸的一个或多个单个核苷酸，肽或蛋 白质的一个或多个氨基酸，或碳水化合物的一种或多种糖。例如，分子分部的长度可以是 约1至20、1至15、1至10或1至5个单独的分子种类或亚基。在一些实施方案中，分 子分部的长度可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个 单独的分子种类或亚基。在一些实施方案中，分子分部的长度可用于调节分子分部参与的 核酸扩增反应的速率。
145.在一个实施方案中，本文所述的引物或寡聚核苷酸的分子分部可包含核酸。本文所述 的引物或寡聚核苷酸的分子分部可降低(或防止)该引物或寡聚核苷酸与另一引物或寡聚 核苷酸杂交和/或在扩增反应中延伸的能力。
146.在一个实施方案中，引物组中的第一sw引物和第二sw引物的分子分部可以彼此不 互补，分子分部之间缺乏序列互补性降低了(或阻止了)正向和反向引物在扩增反应期间 彼此杂交的能力。分子分部可通过一个或多个可被核糖或脱氧核糖分开的磷酸二酯键连接 至引物或寡聚核苷酸，和/或该分子分部可被羟基封端。
147.在一个实施方案中，本文所述的引物或寡聚核苷酸的分子分部可以被适配为使得
其解 链温度低于引物或寡聚核苷酸的核苷酸序列的一部分的解链温度。分子分部的较低解链温 度可以降低(或防止)在高于分子分部的解链温度的引物或寡聚核苷酸的退火温度下分子 分部与靶核酸分子结合的可能性。
148.在一个实施方案中，分子分部可包含至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七 个，八个，九个，十个或更多个核苷酸或核苷酸类似物。分子分部可包含一种或多种具有 非天然碱基的核苷酸类似物。具有非天然碱基的核苷酸类似物的非限制性实例包括肌苷 (包括次黄嘌呤的碱基)，含尿嘧啶的核苷酸(在核酸为dna的情况下)，iso
‑
dc，iso
‑
dg， 二氨基嘌呤，2,4
‑
二氟丁二烯，4
‑
甲基苯并咪唑，尺寸扩展的xa，尺寸扩展的xg，尺寸 扩展的xc，尺寸扩展的xt，d5sics和dnam。分子分部可以包含一种或多种不具有碱基 的核苷酸类似物(例如，脱碱基核苷酸，无环核苷酸)。在一些实施方案中，分子分部可 以包含不能被聚合酶延伸的终止子核苷酸，除非其被去除(例如，通过具有校对活性的酶， 例如核酸外切酶或核酸内切酶)。
149.在一个实施方案中，分子分部包含至少一个用羟基终止的单元，并且包含选自肌苷， 含尿嘧啶的核苷酸，异脱氧胞嘧啶(异
‑
dc)，异脱氧鸟嘌呤(iso
‑
dg)，二氨基嘌呤，2,4
‑ꢀ
二氟甲苯，4
‑
甲基苯并咪唑，尺寸扩展的腺嘌呤(xa)，尺寸扩展的鸟嘌呤(xg)，尺寸 扩展的胞嘧啶(xc)，胸腺嘧啶(xt)，2
‑
(((2r，4r，5r)
‑
四氢
‑4‑
羟基
‑5‑
(羟甲基) 呋喃
‑2‑
基)
‑6‑
甲基异喹啉
‑
1(2h)
‑
硫酮(d5sics)，1,4
‑
脱水
‑2‑
脱氧
‑1‑
c
‑
(3
‑
甲氧基2
‑ꢀ
萘基)
‑
(1r)
‑
d
‑
赤型戊糖醇(dnam)，脱碱基核苷酸，无环核苷酸和/或上述的组合。
150.在一个实施方案中，包含核酸的分子分部的长度可以变化。例如，包含核酸的分子分 部的长度可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个核苷 酸或核苷酸类似物。在实施方式中本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡聚核苷酸(包 括寡聚核苷酸组的寡聚核苷酸)包含与靶核酸互补或基本互补的核苷酸序列a(包括核苷 酸序列a表现出自身和/或分子分部的序列互补性的情况)，引物或寡聚核苷酸的分子分部 可包含具有1
‑
15、1
‑
10、1
‑
8、1
‑
6或1
‑
4个连续核苷酸的核苷酸序列b,它们与相对应的 靶核酸分子的1
‑
15、1
‑
10、1
‑
8、1
‑
6或1
‑
4个核苷酸是非互补的。
151.在一个实施方案中，引物或寡聚核苷酸的分子分部可以是核酸外切酶，核酸内切酶或 两种类型的酶的底物。核酸外切酶和核酸内切酶的实例在本文其它地方描述。在这些情况 下，可以使用适当的核酸外切酶和/或核酸内切酶切除分子分部。
152.一个实施方案涉及分子分部的去除或切除可以通过具有3'
→
5'核酸外切酶活性的酶(例如聚合酶)的作用完成。这种酶可以“校对”分子分部，使得该分子分部的各个种类 或亚基(例如，非互补核苷酸)被具有3'
→
5'核酸外切酶活性的酶从已结合的引物的3'端 上依次一一除去。具有3'
→
5'核酸外切酶活性的任何合适的酶均可用于从第一个sw引物 或第二个sw引物中去除或切除分子分部。具有3'
→
5'核酸外切酶活性的酶的非限制性实 例包括天然存在的核酸外切酶，工程改造的核酸外切酶，phusion聚合酶，pfu聚合酶， deepvent聚合酶，核酸外切酶i，核酸外切酶iii，核酸外切酶iv，核酸外切酶v，kod 聚合酶，q5 dna聚合酶，advantage hd聚合酶，primest ar gxl dna聚合酶，bst 聚合酶和phi29 dna聚合酶。通常，当3'部分存在于双链核酸分子中时，其会更有效地被 3'
→
5'核酸外切酶活性切除。
153.在一个实施方案中，可以通过具有内切核酸酶活性的酶的作用完成从第一sw引物
或 第二sw中去除分子分部。这种酶可以“校对”分子分部，使得整个分子分部作为单个分 子种类通过，例如，将分子分部连接至引物的磷酸二酯键的裂解而被切除。具有核酸内切 酶活性的任何合适的酶可以用于从正向和/或反向引物中去除或切除分子分部。具有核酸 内切酶活性的酶的非限制性实例包括天然存在的核酸内切酶，工程改造的核酸内切酶，脱 氧核糖核酸酶i，i
‑
型限制性内切核酸酶，ii
‑
型限制性内切核酸酶，iii
‑
型限制性内切核酸 酶，热稳定的rnase hii，热稳定的rnase h1和热稳定的尿嘧啶dna
‑
糖基化酶(udg)。
154.在一个实施方案中，单管嵌套式pcr的方法包括(如图4所示)：将第一sw引物退 火至靶模板分子以形成稳定的杂交体；通过具有3'
→
5'核酸外切酶活性的酶(例如聚合酶) 的作用去除或切除引物的分子分部；通过聚合酶的作用使与靶模板分子互补的3'末端延伸， 以产生靶模板分子的突变互补链。在单管嵌套式pcr中第一个循环中产生的突变链包含 第一个sw引物的sw位点。在单管嵌套式pcr的下一个循环中，使用反向引物复制靶 标模板分子的突变互补链。用反向引物延伸导致突变的模板链的产生。第二sw引物以高 亲和力复制或扩增突变的模板链。
155.一个实施方案涉及本文所述的第一sw引物，其可以包含衰减型(或衰减)位点(如 图5a所示)。衰减型位点在第一sw引物的5’区域，正好在锚定序列的下游，优选地， 该衰减型位点位于锚定序列和第一sw引物的5’识别序列之间。衰减型位点极大地影响 dna的延伸，因为衰减型位点阻断了通过聚合酶的延伸。衰减型位点中断反向引物通过 聚合酶的延伸。因此，通过反向引物延伸产生了截短的突变模板链，其缺少第一sw引物 的5’锚定区。在一些实施方案中，由于截短的突变模板链缺少5’锚定区，所以衰减型位点 降低了将第一sw引物退火至截短的突变模板链的可能性。因此，第一sw引物不能与截 短的突变模板链形成稳定的杂交体，从而增加了第二sw引物与截短的突变模板链退火的 可能性。
156.在一个实施方案中，衰减型位点增加了识别或检测靶核苷酸序列的特异性和灵敏度。 衰减型位点降低了第一sw引物对突变模板链的结合效率，从而阻止了第一sw引物对突 变模板链的扩增。与sw位点和衰减型位点一起，使正在进行的不希望有的第一sw引物 的扩增最小化，并且让内部引物(第二sw引物)进行扩增，以促进了靶序列的有效扩增。 在一些实施方案中，本文所述的第一sw引物(包括引物组的引物)或寡聚核苷酸(包括 寡聚核苷酸组的寡聚核苷酸)的衰减型位点的长度可以根据特定的引物或寡聚核苷酸而变 化。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡聚核苷酸的衰减型位点的长度可以为约1个 核苷酸至约10个核苷酸长。
157.在一个实施方案中，衰减型位点包含修饰的核苷酸，其包含天然核苷酸，非天然核苷 酸，脱碱基结构，间隔子，荧光染料修饰的核苷酸，dna序列中包含脱氧尿苷的非典型 核苷酸，化学合成的核苷酸或上述的组合。衰减型位点可以是内部站点，也可以是3'端。 因此，引物或寡聚核苷酸或探针的衰减型位点具有以下功能特征：(i)不能被核酸外切酶 切除，(ii)无法直接延伸或不能有效地被延伸，(iii)如果延伸，由于非互补或与聚合酶 强结合的原因而不能被复制。与核酸单元强结合的聚合酶的实例是与含有尿嘧啶的核苷酸 结合的古细菌聚合酶。
158.在一个实施方案中，衰减型位点可包含至少一个，两个，三个，四个，五个，六个， 七个，八个或更多个修饰的和非天然的核苷酸。在一些实施方案中，衰减型位点可包含一 个或多个修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的非限制性实例包括：n6
‑
medamp，6
‑
c1
‑
pmp， 6
‑
c1
‑
2apmp，o6
‑
medgmp，n2
‑
medgmp，2
‑6‑
damp，dimp和8
‑
氧代
‑
dgmp或上述的 组合。在一些实施方案中，衰减型位点可包含一个或多个非天然核苷酸。非天然核苷酸的 非限制性实例包括：indtp，5
‑
meimp，5
‑
et
‑
imp，5
‑
eyimp，5
‑
nimp，4
‑
nimp和6
‑
nimp 或上述的组合。
159.在一个实施方案中，衰减型位点可包含至少一个，两个，三个，四个，五个，六个， 七个，八个或更多个修饰的碱基，它们是锁定的核酸。锁定核酸的修饰碱基的非限制性实 例包括：2'
‑
o
‑
甲氧基
‑
乙基碱基，2
‑
甲氧基乙氧基a，2
‑
甲氧基乙氧基mec，2
‑
甲氧基乙氧 基g，2
‑
甲氧基乙氧基t，2'
‑
o
‑
甲基rna碱基，氟代碱基，氟代c，氟代u，氟代a和 氟代g，8
‑
氮杂7
‑
脱氮鸟苷，2,6
‑
二氨基嘌呤(2
‑
氨基
‑
da)，双脱氧
‑
c，羟甲基dc，倒置 dt，iso
‑
dg，iso
‑
dc，倒置的二脱氧
‑
t，super t(5
‑
羟基丁炔
‑
2'
‑
脱氧尿苷)和5
‑
硝基吲 哚或上述的组合。在一个实施方案中，该衰减型位点可包含至少一个，两个，三个，四个， 五个，六个，七个，八个或八个以上在核苷酸序列中取代嘌呤和嘧啶的非典型核苷酸。非 典型核苷酸的非限制性实例包括：5
‑
甲基dc，脱氧尿苷(du)，5
‑
溴
‑
脱氧尿苷(5
‑
溴du) 和2
‑
氨基嘌呤或上述的组合。
160.在一个实施方案中，单管嵌套式pcr的方法包括(如图5b所示)：使包括衰减型位 点的第一sw引物退火至模板核酸分子以形成稳定的杂交体。通过聚合酶的作用使与模板 互补的引物3'端在引物延伸反应中延伸，以产生模板的突变互补链。在单管嵌套式pcr 的第一个循环中产生的突变互补位点，包含第一个sw引物的sw位点。在单管嵌套式 pcr的下一个循环中，使用反向引物复制模板的突变互补链。用反向引物延伸或扩增导致 突变模板链产生。生成的截短的突变模板链缺少第一个sw引物的5'锚定区域。第二个sw 引物极有可能与截短的突变模板链退火并进行扩增。
161.实施方案涉及特异性和/或定量检测相关核酸序列的方法，该方法包括(如图8a至 8b所示)：将扩增正向引物退火至包含相关核酸序列的靶分子链上；使探针与靶分子链杂 交以形成探针
‑
靶双链体(如图9所示)；使用聚合酶的3'
→
5'核酸外切酶活性将标记从探 针上切除后检测信号发射的实时增加(如图8a至8b所示)；以靶分子为模板延伸两个引 物；重复上述步骤以扩增和检测靶核酸序列。
162.在一个实施方案中，探针包含：(i)衰减型位点，(ii)在非3'位点的第一标记，和(iii) 在3'端的第二标记。当探针与其靶标杂交以形成双链结构时，可利用聚合酶的3'
→
5'核酸 外切酶活性有效切除在探针3'端的第二个标记。非3'位点是5'末端位置或内部位点，位于 探针分子第二个标记5'上游处。第二个标记位于第一个标记的3'下游，相隔1
‑
50个核苷酸。 因此，位于3'端的第二个标记可以是相对于第一个标记在3'方向上的标记；它可以位于终 端位置，也可以位于包含1
‑
3个单元的3'终端附近的内部位点中。第一标记和第二标记包 括荧光染料
‑
猝灭剂对或其类似物。衰减型位点位于探针的中心和第二个标记之间。它被 配置为防止探针分子被用作引物或会被复制的模板，以免在非特异性反应中产生假阳性信 号。在一个实施方案中，将第二标记置于衰减型位点之后(衰减型位点的3'端)。因此， 在3'末端切除第二个标记将暴露出衰减型位点。但是，衰减型位点将无法有效地被延伸， 如果被延伸，则将不会被复制。使用聚合酶的3'
→
5'核酸外切酶活性将标记从探针上切割 下来后，可以检测到信号发射的实时增加。标记的切除，即切除荧光染料
‑
淬灭剂对中的 荧光染料或淬灭剂，增加了荧光染料分部和淬灭剂分部之间的分子距离，导致较少的淬灭 或较高的荧光发射。在3'末端切除第二个标记会暴露未延伸的衰减型位点。结果，探针的 剩余部分将在正常退火条件下在各自的tm附近从其模板解离，从而允许引物延
伸继续至 模板链的末端。在一个实施方案中，pcr引物浓度不显著地小于但是可以高于pcr反应 中的探针浓度，例如引物与探针的比例在1∶2至10∶1的范围内。当使用较低的探针浓 度时，探针有较小机会与引物竞争模板分子，从而使pcr呈指数级进行。在另一个实施 方案中，暴露的衰减型位点可以被延伸，但是，当复制延伸的链时，进行延长的链将不能 通过衰减型位点，因此源自探针的任何产物将不被扩增，因此产生假阳性信号的机会被最 小化。综合上述，荧光强度的增加与产生的扩增子的量成正比，并且pcr反应中探针所 呈现的量可被配置为能确保正常的pcr反应速率或效率。单管定量嵌套式pcr具有更高 的扩增灵敏度，产生更强的信号，花费更短的时间完成反应并避免产生非特异性pcr产 物。
163.一个实施方案涉及通过定量pcr对存在于模板核酸分子中的靶核酸序列进行定量和 检测。更具体地，实施方案部分地提供了用于靶核酸序列的单管嵌套式qpcr的方法，聚 合酶可以切除探针以从探针或引物中释放出标记或染料以产生信号。
164.在一个实施方案中，用于单管嵌套式qpcr的反应混合物包括正向引物，探针，反向 引物和包括靶标区域的模板核酸分子，具有3'
→
5'核酸外切酶活性的聚合酶，一套dntp 和一个缓冲系统。正向引物可以是第一sw引物和第二sw引物。正向引物，探针和反向 引物可用于模板的扩增和信号产生。该反应混合物可以另外包括外部引物，其中该外部引 物被配置为扩增适于第一sw引物的模板核酸分子。外引物通过为正向引物(第一个sw 引物和第二个sw引物)提供更多模板分子来提高检测灵敏度。
165.在一个实施方案中，单管定量嵌套式pcr的方法(如图10所示)包括：将第一sw 引物退火至靶分子以形成稳定的杂交体。通过聚合酶的作用使与模板互补的引物3'端在引 物延伸反应中延伸，以产生靶模板分子的突变互补链。在单管定量嵌套式pcr的第一个 循环中产生的突变链包含第一个sw引物的sw位点。在单管定量嵌套式pcr的下一个 循环中，使用反向引物复制模板的突变互补链。用反向引物延伸或扩增导致突变模板链成 生成。第二sw引物复制或扩增突变模板链。具有衰减型位点的探针可以与靶分子的链杂 交形成探针
‑
靶双链体。衰减型位点位于探针的中心和第二个标记之间。它被配置为防止 探针分子被用作引物或会被复制的模板，以免在非特异性反应中产生假阳性信号。使用聚 合酶的3'
→
5'核酸外切酶活性将标记从探针上切割下来后，可以检测到信号发射的实时增 加。标记的切除，即切除荧光染料
‑
淬灭剂对中的荧光染料或淬灭剂，增加了荧光染料分 部和淬灭剂分部之间的分子距离，导致较少的荧光淬灭或较高的荧光发射。在3'末端切除 第二个标记会暴露未延伸的衰减型位点。结果，探针的剩余部分将与其模板解离，从而允 许引物延伸继续至模板链的末端。
166.在一个实施方案中，pcr引物浓度不显著地小于但可以高于pcr反应中的探针浓度， 例如引物与探针的比例在1：2至10：1的范围内。当使用较低的探针浓度时，探针有较 小的机会与引物竞争模板，从而使pcr能呈指数级进行。
167.在另一个实施方案中，暴露的衰减型位点可以被延伸，但是，当复制延伸的链时，进 行延长的链将不能通过衰减型位点，因此源自探针的任何产物将不被扩增，因此产生假阳 性信号的机会降到最低。综上所述，荧光强度的增加与产生的扩增子的量成正比，并且 pcr反应中探针所呈现的量可被配置为确保正常的pcr反应速率或效率。单管定量嵌套 式pcr具有更高灵敏度，产生更强的信号，花费更短的时间完成反应并避免产生非特异 性pcr产物。
针，taqman mgb探针，lion探针，分子信标。
176.在一个实施方案中，可用于检测本文所述的核酸分子的另一种检测方法是解链曲线分 析。特别地，如本文其它地方所述，解链曲线分析可用于检测引物二聚体分子复合物或副 产物和/或单核苷酸多态性。在解链曲线分析中，可以对包含双链核酸分子的混合物(例 如，扩增反应混合物)加热，然后针对温度去测量混合物中双链核酸分子的解离(例如， 变性)。可以使用可嵌入或结合双链的可检测物质(例如，荧光团，例如sybr green或 evagreen，用可检测物质标记的核酸探针)来测量双链核酸分子链的温度依赖性解离。例 如，在嵌入剂(例如，sybr绿)在与双链核酸分子结合时发荧光的情况下，加热期间双 链核酸分子的解离可以通过导致的荧光减少来确定。由于解离的双链核酸分子释放出嵌入 染料，导致荧光减少。游离染料不会发荧光(或可能不会在与之结合的物质以相同的波长 发荧光)，因此，荧光的降低可用于指示双链核酸分子的解离。可以用荧光量的一阶导数 或负的一阶导数(例如，荧光的负的一阶导数)对温度作图，以通过图中的峰确定解链的 温度(例如，发生50％解链的温度)。可以通过获得的解链曲线和/或解离温度来鉴定核酸 分子。
177.在一个实施方案中，可以在扩增过程之后对扩增的靶核酸进行解链曲线分析。核酸序 列的tm取决于序列的长度及其g/c含量。因此，对核酸序列的tm的鉴定可用于鉴定 扩增的核酸，例如，通过使用双链dna结合染料化学，其通过使用非序列特异性荧光插 入剂(例如或溴化乙锭)来定量扩增子的产生。是一种发荧 光的小沟结合染料，在溶液中显示很少的荧光，但与双链dna结合后发出强荧光信号。 通常，用于单重反应，但与解链点分析结合使用时，可用于多重反应。
178.在一个实施方案中，pcr系统通常依赖于荧光染料或报告基团的实现检测和定量，其 信号与反应中pcr产物的量成正比增加。例如，在最简单，最经济的方式中，该报告基 团是对双链dna有特异性的染料(分子探针)。sybr green是一种结合 双链dna小沟的染料。当sybr green染料与双链dna结合时，荧光强度增加。随着产 生更多的双链扩增子，sybr green染料信号将增加。
179.在一个实施方案中，dna特异性染料的非限制性实例包括sybr绿，sybr蓝，dapi， 碘化丙啶，hoeste，sybr金，evagreen，溴化乙锭，啶类，原黄烷，啶橙，啶黄，氟香 豆素，玫瑰树碱，道诺霉素，氯喹，双霉素d，铬霉素、光神霉素，钌吡啶，蒽霉素，菲 啶，溴化乙锭，碘化丙啶，碘化己啶，二氢乙锭，甲homo和二乙啶，二乙啶和二乙啶， hoechst 33342，hoechst 34580，dapi，7
‑
aad，放线菌素d，lds751，羟基stilbamidine， sytox blue，sytox green，sytox orange，popo
‑
1，popo
‑
3，yoyo
‑
1，yoyo
‑
3， toto
‑
1，toto
‑
3，jojo
‑
1，lolo
‑
1，bobo
‑
1，bobo
‑
3，po
‑
pro
‑
1，po
‑
pro
‑
3，bo
‑
pro
‑
1， bo
‑
pro
‑
3，to
‑
pro
‑
1，to
‑
pro
‑
3，to
‑
pro
‑
5，jopro
‑
1，lo
‑
pro
‑
1，yo
‑
pro
‑
1， yo
‑
pro
‑
3，picogreen，oligreen，ribogreen，sybr green i，sybr绿色ii，sybr dx， syto
‑
40，
‑
41，
‑
42，
‑
43，
‑
44，
‑
45(蓝色)，syto
‑
1 3，
‑
16，
‑
24，
‑
21，
‑
23，
‑
12，
‑
11，
ꢀ‑
20，
‑
22，
‑
15，
‑
14，
‑
25(绿色)，syto
‑
81，
‑
80，
‑
82，
‑
83，
‑
84，
‑
85(橙色)，syto
‑
64，
ꢀ‑
17，
‑
59，
‑
61，
‑
62，
‑
60，
‑
63(红色)，荧光素，异硫氰酸荧光素(fitc)，四甲基若丹明 异硫氰酸酯(tritc)，罗丹明，四甲基罗丹明，r
‑
藻红蛋白，cy
‑
2，cy
‑
3，cy
‑
3.5，cy
‑
5， cy5.5，cy
‑
7，德克萨斯红，phar
‑
red，别藻蓝蛋白(apc)，，celltracker green，7
‑
aad， 乙乙二聚体i，乙乙二聚体ii，乙乙二聚体iii，溴化乙锭，伞形酮，曙红，绿色荧光蛋白， 赤藓红，香豆素，甲基香豆素，芘类，孔雀石绿色，二苯乙烯，荧光素黄，级联蓝，二氯 三嗪胺荧光素，丹酰氯，荧
光镧系元素络合物(包括铕和铽)，羧基四氯荧光素，5和/或 6
‑
羧基荧光素(fam)，5
‑
(或6
‑
)碘乙酰胺基荧光素，5
‑
{[2(和3)
‑5‑
(乙酰巯基)琥 珀酰]氨基}荧光素(samsa
‑
荧光素)，赖氨酸罗丹明b磺酰氯，5和/或6羧基罗丹明(rox)， 7
‑
氨基甲基香豆素，7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素
‑3‑
乙酸(amca)，bodipy荧光，8
‑
甲氧基 py
‑
1,3,6
‑
三磺酸三钠盐，3,6
‑
二磺酸
‑4‑
氨基
‑
萘二甲酰亚胺，藻胆蛋白，alexafluor 350、405、 430、488、532、546、555、568、594、610，633、635、647、660、680、700、750和 790染料，dylight 350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料或其它荧 光团。
[0180]
在一个实施方案中，本文所述的扩增核酸分子(例如，包括靶核酸分子的扩增产物， 核酸样品的扩增产物和本文其它各处所述的扩增的双链靶核酸分子)可能会以不同的特异 性被检测到。例如，特异性可取决于用于扩增的特定引物，待扩增的核酸分子和/或扩增 反应混合物中的其它组份。扩增特异性的示例性度量，如本文其它地方所述，是扩增反应 期间扩增产物的循环阈值(ct)。在一些实施方案中，ct值可以在给定扩增反应的总循环 数与高于背景水平的任何数之间。在一些实施方案中，ct值可以与要扩增的核酸分子的初 始量成反比。例如，用本文所述的核酸扩增方法对核酸进行扩增的ct值可以小于80、75、 70、65、60、55、50、45、40，35、30、25、20、15、10、5或更小。
[0181]
在另一个实施方案中，任何类型的热循环仪设备可用于扩增或确定杂交。合适的设备 的示例包括热循环仪(mj research，inc.；加利福尼亚州旧金山)， 温度循环仪(agilent/stratagene；加利福尼亚州圣克拉拉)或 system 9700(applied biosystems；加利福尼亚州福斯特城)。对于qpcr， 可以使用任何类型的定量热循环仪设备。例如，icycler iqtm或cfx96
tm
实时检测系统(加 利福尼亚州赫拉克勒斯市的bio
‑
rad)，系统(德国曼海姆市的罗氏)，7700 序列检测器(perkin elmer/applied biosystems；加利福尼亚州福斯特市))，abi
tm
系统， 例如7000、7300、7500、7700或7900系统(applied biosystems；加利福尼亚州福斯特城)， 或mx4000tm，mx3000tm或mx3005tm qpcr系统(agilent/stratagene；加利福尼亚 州圣克拉拉)，dna连续荧光检测系统(bio
‑
rad，hercules，ca)， 实时循环仪(qiagen，valencia，ca)或系统(cepheid，sunnyvale， ca.))可用于实时扩增核酸序列。在一些实施方案中，使用taqman阵列格式，例如微流 体卡，进行qpcr，其中每个孔中预装有用于特定靶标的引物和探针。通过添加包含核酸 和测定试剂的样品(例如pcr主混合物)来启动反应，此反应在定量热循环仪设备中运 行。
[0182]
在一些实施方案中，使用热对流装置进行pcr。在这种设备中，温度控制是通过由密 度梯度导致的液体对流而实现。在热对流装置中，将装有反应混合物的试管或容器的下部 的温度设置为高(更低的液体密度)于同一试管或容器的上部的温度(更高的液体密度)。 光学系统可以被配置为检测来自热对流装置中的反应管或容器的荧光信号。
[0183]
在一些实施方案中，探针是可检测地标记着，所用标记为同位素标记或非同位素标记； 在替代实施方案中，靶核酸被标记。非同位素标记可以例如包含荧光或发光分子，或酶， 辅因子，酶底物或半抗原。当将探针与单链或双链的rna，dna或两者的混合物制剂一 起孵育，分子杂交就可得到确定。在一些实例中，杂交导致可检测信号的变化，例如来自 标记探针的信号的增加或减少。因此，检测杂交包括相对于杂交之前来自标记的信号，检 测
第二选选择性松动位点，其中第二选择性松动位点靠近中央区域，(iv)非3'位点的第一标 记,和(v)3'端的第二标记(如图6所示)。
[0191]
在一个实施方案中，单管嵌套式qpcr的方法(如图6所示)包括：将第一sw引物 退火至模板核酸分子以形成稳定的杂交体。通过聚合酶的作用使与模板互补的引物3'端在 引物延伸反应中延伸，以产生模板的突变互补链。在单管定量嵌套式pcr的第一个循环 中产生的突变互补位点包含第一个sw引物的选择性松动位点。在单管定量嵌套式pcr 的下一个循环中，使用反向引物复制模板的突变互补链。第二sw探针引物扩增由反向引 物产生的模板的突变链。聚合酶可以切除探针引物以将染料从引物中释放出来以产生信号。
[0192]
实施方案涉及可以在反应混合物中发生的核酸扩增，其中要扩增的核酸分子与任何其 它试剂(例如一种或多种正向引物，反向引物，聚合酶，核酸外切酶，核酸内切酶,)，dntp， 辅因子，合适的缓冲液等合在一起，这些都是核酸分子扩增所必需的。反应混合物中还可 以包括其它试剂(可检测组份，例如探针或染料)，其可用于检测扩增产物。然后可以使 反应混合物经受适合于扩增核酸分子的条件(例如，合适的温度，热量的添加或去除，缓 冲液浓度等)。例如，可以在反应混合物中提供单链或双链靶核酸分子，该反应混合物还 包含任何其它试剂(例如，一种或多种本文其它各处所述的正向引物和反向引物，聚合酶， 核酸外切酶，核酸内切酶，随机引物，dntp，辅因子，缓冲液，其它扩增单链或双链靶 核酸分子所需的酶(例如，从rna产生cdna的逆转录酶，连接酶等)。
[0193]
在一个实施方案中，盐和缓冲液包括本领域技术人员熟悉的盐和缓冲液，包括包含 mgcl2，mgso4，tris
‑
hcl，nacl，kcl和k
4 so4的盐和缓冲剂，以及pcr反应所需的其 它成分。通常，对于dna聚合酶而言，镁离子的最佳浓度为1.5
‑
3.0mm，但是，最佳镁 离子浓度可能取决于模板，缓冲液，dna和dntp，因为每种都有可能螯合镁离子。如果 镁离子的浓度[mg
2+
]太低，则可能无法形成pcr产物。如果镁离子的浓度[mg
2+
]太高，可 能会出现不希望有的pcr产物。在一些实施方案中，可以通过以0.1mm或0.5mm的增量 补充镁离子浓度直至约5mm来优化镁离子浓度。
[0194]
在一个实施方案中，根据本发明使用的缓冲液可包含添加剂，例如表面活性剂，二甲 基亚砜(dmso)，甘油，牛血清白蛋白(bsa)和聚乙二醇(peg)，以及本领域技术人 员熟悉的其它添加剂。核苷酸通常是三磷酸脱氧核糖核苷，例如三磷酸脱氧腺苷(datp)， 三磷酸脱氧胞苷(dctp)，三磷酸脱氧鸟苷(dgtp)和三磷酸脱氧胸苷(dttp)，它们也 被添加到反应中以用于扩增靶核酸。在一些实施方案中，一种或多种dntp(例如，datp， dctp，dgtp，dttp)的浓度为约10μm至约500μm，其可以取决于pcr反应中产生 的pcr产物的长度和数量。
[0195]
在一个实施方案中，反应混合物的温度是如下温度的反复循环，变性温度(例如，以 将双链核酸分子变性，分离或解链成组分核酸链)，退火温度(例如，以使引物与每个组 成核酸链退火或杂交)和延伸温度(例如，通过聚合酶的作用在引物延伸反应中延伸或添 加核苷酸至退火的引物)以扩增单链或双链靶核酸分子。对于在热对流装置中进行的pcr， 变性温度，退火温度和延伸温度固定于反应容器的不同区域。可是，水相反应混合物能通 过对流经历温度循环。
[0196]
在一个实施方案中，反应混合物的温度的循环可以例如借助于任何合适的热循环仪器 或能够循环加热的其它类型的装置来实现。如本文其它地方所描述的，这样的仪器可以包 括或可以耦合至适于检测反应混合物中的扩增产物的装置。在一些实施方案中，这种
装置 可能是能够检测反应混合物中的光学响应物质的装置，其中这种光学检测可用于扩增产物 定量，ct值的测量和/或解链点检测。在一些实施方案中，扩增产物的检测可以实时进行 (例如，随着扩增反应的进行)。在一些实施方案中，双链核酸分子的变性可以通过变性 剂，例如碱性试剂(例如氢氧化钠(naoh))来实现。
[0197]
在一个实施方案中，可以使用恒温，例如在不改变装置的温度设置的情况下，使用本 文其它各处所述的引物和探针进行核酸的扩增和检测。恒温扩增方法包括例如lamp(环 介导的恒温扩增)，rpa(重组酶聚合酶扩增)的扩增方法。在一些实施方案中，无需循 环扩增反应混合物的温度即可完成本文所述的核酸扩增方法。例如，可以在不循环反应混 合物的温度的情况下进行多个扩增循环。
[0198]
在一个实施方案中，探针包含：(i)衰减型位点，(ii)在非3'位点的第一标记，和(iii) 在3'端的第二标记。非3'位点是5'末端位置或内部位点，位于探针分子第二个标记5'上游 处。第二个标记位于第一个标记的3'下游，相隔1
‑
50个核苷酸。因此，位于3'端的第二个 标记可以是相对于第一个标记在3'方向上的标记；它可以位于终端位置，也可以位于包含 1
‑
3个单元的3'终端附近的内部站点中。当探针与其靶标杂交以形成双链结构时，可使用 3'
→
5'核酸外切酶有效切除探针3'末端标记上的第二个标记。第一标记和第二标记包括荧 光染料
‑
猝灭剂对或其类似物。在一个实施例中，第二标记被放置在紧邻衰减型位点的3' 处。衰减型位点位于探针的中心和第二个标记之间。衰减型位点被配置为防止探针分子被 用作引物或会被复制的模板，以免在非特异性反应中产生假阳性信号。使用3'
→
5'核酸外 切酶将标记从探针上切割下来后，可以检测到信号发射的实时增加。标记的切除，即切割 荧光染料
‑
淬灭剂对中的荧光染料或淬灭剂，增加了荧光染料分部和淬灭剂分部之间的分 子距离，导致较少的淬灭或较高的荧光发射。
[0199]
在一个实施方案中，可借助于热梯度将反应混合物加热至一个或多个反应温度。热梯 度可以例如由一个或多个恒温加热源或一个或多个固定的加热源产生，在本文中统称为热 对流装置。例如，可以在基于对流的热梯度仪器中加热反应混合物，例如经由瑞利
‑
伯纳 德对流。如本文其它地方所描述的，这样的仪器可以包括或可以耦合至适于检测反应混合 物中的扩增产物的装置。在一些实施方案中，这种装置可能是能够检测反应混合物中的光 学响应物质的装置，其中这种光学检测可用于扩增产物定量和/或解链点检测。在一些实 施方案中，经由基于对流的策略和/或仪器的扩增产物的信号的检测和显示可以实时进行 (例如，随着扩增反应的进行)，包括经由解链点的检测。
[0200]
在一个实施例中，基于对流的策略和系统包括在pockit系统中使用的iipcr方法。 这种系统可以在一个或多个容器(例如毛细管)的底部包括单个加热源，该容器通过瑞利
ꢀ‑
伯纳德对流驱动扩增反应。当使用瑞利
‑
伯纳德对流来驱动扩增反应时，反应混合物的不 同“部分”的温度变化通常不同步。在这种情况下，反应容器中反应混合物的不同部分可 以具有不同的温度。这种温度差在最高点和最低点之间可能会高达1℃，2℃，3℃，4℃， 5℃，6℃，7℃，8℃，9℃，10℃，11℃，12℃，13℃，14℃，15℃，16℃，17℃，18℃， 19℃，20℃，21℃，22℃，23℃，24℃，25℃，26℃，27℃，28℃，29℃，30℃，31℃， 32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃或最高60℃或更高。此外， 由于不同区域之间与温度相关的密度差异，一区域的反应混合物可以移动到反应容器的不 同区域。基于瑞利
‑
伯纳德对流的扩增的另一个特点是，反应混合物的每个特定部分都可 以沿着一个或多个恒温加热源产生的
温度梯度经历连续的温度变化。这样的温度变化可以 允许使用恒温加热装置快速扩增核酸分子。
[0201]
一个实施方案涉及核酸扩增反应，其可包括聚合酶的用途和作用。在引物延伸反应期 间，聚合酶通常可以以模板指导的方式将核苷酸添加至已退火至单链核酸分子的引物的 3'端。任何合适的聚合酶均可用于引物延伸反应，包括可商购获得的聚合酶。聚合酶的非 限制性实例包括taq dna聚合酶，tth聚合酶，tli聚合酶，pfu聚合酶，vent聚合酶， deepvent聚合酶，ex
‑
taq聚合酶，la
‑
taq聚合酶，expand聚合酶，sso聚合酶，poe 聚合酶，pab聚合酶，mth聚合酶，pho聚合酶，phusion聚合酶，es4聚合酶，tru聚合 酶，tac聚合酶，tne聚合酶，tma聚合酶，tih聚合酶，tfi聚合酶，platinum taq聚合酶， hi
‑
fi聚合酶，tbr聚合酶，tfl聚合酶，pfutubo聚合酶，pyrobest聚合酶，pwo聚合酶， kod聚合酶，bst聚合酶，sac聚合酶，klenow片段，q5 dna聚合酶，advantage hd 聚合酶，primestar gxl dna聚合酶，具有3'
→
5'核酸外切酶活性的聚合酶及其变体， 修饰或重组产物及其衍生物。
[0202]
在一个实施方式中，合适的变性温度可以是例如约60℃，61℃，62℃，63℃，64℃， 65℃，66℃，67℃，68℃，69℃，70℃，71℃，72℃，73℃，74℃，75℃，76℃，77℃，78℃，79℃，80℃，81℃，82℃，83℃，84℃，85℃，86℃，87℃，88℃，89℃，90℃， 91℃，93℃，94℃，95℃，96℃，97℃，98℃，99℃，100℃，101℃，102℃，103℃， 104℃，105℃或更高。在一些实施方案中，单个扩增循环的合适的变性时间可以是例如 约0.1s，0.5s，1s，2s，3s，4s，5s，6s，7s，8s，9s，10s，11s，12s，13s，14s，15s， 16s，17s，18s，19s，20s，21s，22s，23s，24s，25s，26s，27s，28s，29s，30s，31s， 32s，33s，34s，35s，36s，37s，38s，39s，40s，41s，42s，43s，44s，45s，46s，4 7s， 48s，49s，50s，51s，52s，53s，54s，55s，56s，57s，58s，59s，1分钟，2分钟，3分 钟，4分钟，5分钟或更长时间。
[0203]
在一个实施例中，合适的退火温度可以是例如大约45℃，46℃，47℃，48℃，49℃， 50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃， 63℃，64℃，65℃，66℃，67℃，68℃，69℃，70℃，71℃，72℃，73℃，74℃，75℃， 76℃，77℃，78℃，79℃，80℃或更高。在一些实施方案中，单个扩增循环的合适退火 时间可以是例如约0.1s，0.5s，1s，2s，3s，4s，5s，6s，7s，8s，9s，10s，11s，12s，13s， 14s，15s，16s，17s，18s，19s，20s，21s，22s，23s，24s，25s，26s，27s，28s，29s， 30s，31s，32s，33s，34s，35s，36s，37s，38s，39s，40s，41s，42s，43s，44s，45s，46s， 47s，48s，49s，50s，51s，52s，53s，54s，55s，56s，57s，58s，59s，1分钟，2分钟， 3分钟，4分钟，5分钟或更长时间。
[0204]
在一个实施例中，合适的延伸温度可以是，例如，大约45℃，46℃，47℃，48℃， 49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃， 61℃，62℃，63℃，64℃，65℃，66℃，67℃，68℃，69℃，70℃，71℃，72℃，73℃， 74℃，75℃，76℃，77℃，78℃，79℃，80℃或更高。在一些实施例中，合适的延伸温 度可以是与合适的退火温度相同的温度。在一些实施方案中，单个扩增循环的合适延长时 间可以是例如约0.1s，0.5s，1s，2s，3s，4s，5s，6s，7s，8s，9s，10s，11s，12s，13s， 14s，15s，16s，17s，18s，19s，20s，21s，22s，23s，24s，25s，26s，27s，28s，29s， 30s，31s，32s，33s，34s，35s，36s，37s，38s，39s，40s，41s，42s，43s，44s，45s，46s， 47s，48s，49s，50s，51s，52s，53s，54s，55s，56s，57s，58s，59s，1分钟，2分钟， 3分钟，4分钟，5分钟或更长时间。
[0205]
一个实施方案涉及可以用于扩增核酸分子的核酸扩增反应。核酸扩增反应的一个
例子 是聚合酶链反应(pcr)，其依赖于如上所述的核酸分子的变性,引物退火，引物延伸和扩 增的重复循环。核酸扩增反应类型的其它非限制性实例包括逆转录，体外转录，连接酶链 反应，嵌套式扩增，多重扩增，解旋酶依赖性扩增，不对称扩增，滚环扩增，多置换扩增 (mda)，等等。pcr的变体，包括qpcr，热启动pcr，反向pcr，甲基化特异性pcr， 等位基因特异性pcr，组装pcr，不对称pcr，微型引物pcr，多重pcr，嵌套式pcr， 重叠延伸pcr，数字pcr，乳液pcr，拨出pcr，依赖解旋酶的pcr，嵌套式pcr， 不对称热交错pcr，单管pcr，定量pcr，多重pcr，直接pcr和着陆pcr。
[0206]
一个实施方案涉及本文描述的用于核酸扩增的方法，其可以包括逆转录聚合酶链反应 (rt
‑
pcr)。rt
‑
pcr核酸扩增反应可包括使用逆转录酶和逆转录引物或可从rna模板 生成互补dna(cdna)的随机引物。然后在pcr核酸扩增反应中可以使用适当的正向 和反向引物以及聚合酶的作用来扩增cdna。因此，rt
‑
pcr核酸扩增反应的反应混合物 可以包括逆转录酶。任何合适的逆转录酶可以用于逆转录酶的rt
‑
pcr核酸扩增反应，所 述逆转录酶的非限制性实例包括hiv
‑
1逆转录酶，m
‑
mlv逆转录酶，amv逆转录酶，端 粒酶逆转录酶以及修饰的变体。产品及其衍生物。如本文其它地方所述,在正向和/或反向 引物包括分子分部的情况下，rt
‑
pcr反应混合物也可以包含能够切除分子分部的酶，例 如具有3'
→
5'核酸外切酶活性的酶。rt
‑
pcr扩增反应的第一sw引物和第二sw引物或 第二sw引物中的分子分部的存在可以通过抑制由逆转录酶产生的启动错误来提高 rt
‑
pcr扩增反应的灵敏度。
[0207]
在一个实施方案中，rt
‑
pcr核酸扩增反应可以在单个反应混合物(例如，在单个容 器中的反应混合物)中进行，其中所有试剂(例如，rna模板，dntp，聚合酶，反应混 合物中提供了逆转录酶，具有3'
→
5'核酸外切酶活性的酶，逆转录引物，探针，正向引物 和逆向引物等)，以从rna模板生成cdna并进一步扩增生成的cdna。可以将反应混 合物置于合适的条件(例如温度等)下，以完成rt
‑
pcr扩增反应的各个阶段(例如rna 模板的逆转录以生成cdna，cdna的扩增等)。整个rt
‑
pcr扩增反应可以持续进行而无 需除去或向反应混合物中添加其它试剂。
[0208]
实施例涉及一种方法，该方法可以包括检测本文所述的一个或多个核酸分子，例如， 扩增的双链靶核酸分子，核酸样品的扩增产物，靶核酸的扩增产物分子，双链核酸分子， 单链核酸分子，靶核酸分子，正向引物，反向引物和/或引物二聚体分子复合物或副产物。 本文所述的方法可以包括检测扩增的双链靶核酸分子的至少一个子集，核酸样品的扩增产 物或靶核酸分子的扩增产物。本文所述的任何类型的核酸分子的检测可以通过任何合适的 检测方法或方式来实现。所使用的特定类型的检测方法或方式可能取决于，例如，要检测 的特定分子种类，在检测过程中存在的其它分子种类，是否存在可检测的分子种类，要使 用的特定类型的可检测分子种类和/或特定的应用步骤。
[0209]
在一个实施例中，检测方法包括光学检测，光谱检测，静电检测和电化学检测。因此， 本文所述的核酸分子检测可以通过检测显示核酸分子的存在与否的信号来实现(例如，显 示核酸分子或相缔合的可检测种类的光学性质，光谱性质，静电性质或电化学性质的信号)。 光学检测方法包括但不限于荧光发射检测，目视检查(例如，通过眼睛进行检测，在没有 光学检测器的辅助下观察光学性质或光学事件)，荧光测定法，化学发光成像，荧光共振 能量转移(fret)和紫外线可见光吸收率。图谱检测方法包括但不限于质谱，核磁共振 谱(nmr)，拉曼光谱和红外光谱。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如凝 胶电
泳(例如，琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳)。凝胶电泳方法可以基于核酸分子的 大小在反应混合物中分离不同的核酸分子。分离特征(例如，反应混合物中各种核酸的大 小)可用于识别根据分子大小进行凝胶电泳的核酸分子。电化学检测方法包括但不限于电 流分析法。
[0210]
提供以下实施例仅用于说明性目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上， 除了本文中图示和描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术 人员而言将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
[0211]
例子1
[0212]
单管嵌套式pcr检测乙型肝炎病毒(hbv)dna。本实施例描述了用于检测病原体 拷贝数非常低的样品中病毒核酸的实验数据。先收集乙型肝炎患者的唾液。乙型肝炎患者 的唾液中可能含有乙型肝炎病毒，但与血液相比浓度较低。为了扩增hbv dna的155个 核苷酸区域，可采用单管嵌套式pcr，其使用第一sw引物(seq id no：1)，第二sw 引物(probe
‑
primer，seq id no：2)和反向引物(进行seq id no：3)(如图11a所示)。
[0213]
第一sw引物(seq id no：1)包含：(i)具有13个核苷酸(nt)长度的5'锚定区， (ii)具有7个核苷酸(nt)长度的5'识别区，(iii)第一个sw位点包含5个核苷酸(nt)， 和(iv)具有3个核苷酸(nt)的3'延伸位点。第二sw引物(探针引物，seq id no：2) 包含：(i)具有7个核苷酸(nt)的5'识别区，(iii)包含5个核苷酸(nt)的第二sw位 点，和(iii)具有8个核苷酸(nt)的3'延伸位点。反向引物是未经修饰的标准寡聚核苷 酸。
[0214]
在自制试管中进行单管嵌套式dna扩增反应，每个试管具有50ul的反应液，其中包 括：20mm tris
‑
hcl，ph 8.8，2mm mgso4，40mm k2so4，0.1％tween
‑
20，1m甜菜 碱，200nm dntp，0.06u/μl dna pfu dna聚合酶，dna模板分子，0.3μm反向引物 和0.3μm第二sw引物。反应(试管)中含有不同数量的第一sw引物，其结果如图11b 所示。以对第二sw引物的比例添加第一sw引物：0(反应
‑
1)，0.5(反应
‑
2)，1(反应
ꢀ‑
3)和2(反应
‑
4)。反应在自制的热对流装置(恒温装置)中进行，该装置的温度梯度为 55℃至95℃。
[0215]
反应40分钟后，从4个试管中各取10μl反应产物，并在4％琼脂糖凝胶中进行电泳 (如图11b所示)。泳道1显示比率(第一sw引物与第二sw引物)为0的结果，泳道 2显示比率为0.5的结果，泳道3显示比率为1的结果，泳道4显示结果以2的比率获得 的产物。在泳道1中没有检测到反应产物，该泳道没有第一sw引物。泳道2
‑
4均具有预 期大小为142个核苷酸(nt)的单条带。结果表明，单管嵌套式pcr既需要第一sw引 物，也需要第二sw引物。而且，本公开的单管嵌套式pcr也可以检测低拷贝数的靶核 酸分子。
[0216]
例子2
[0217]
单管嵌套式pcr检测衍生自sars
‑
cov
‑
2rna的dna。为了检测源自sars
‑
cov
‑
2 rna的dna，使用第一sw引物(seq id no：4)，第二sw引物(probe
‑
primer，seqid no：5)和反向引物进行单管嵌套式pcr反应进行引物(seq id no：6)(如图12a 所示)。
[0218]
第一sw引物(seq id no：4)包含核碱基u(尿嘧啶)作为衰减型位点，使得dna 聚合酶(pfu聚合酶)可以停滞在该位点。sw位点具有4个核苷酸的长度。3'末端分子 分部在延伸前被dna聚合酶(pfu型)的3'
‑
5'核酸外切酶活性切除。分子分部减少非特 异性扩增。第二个sw探针引物(seq id no：5)包含：一种称为荧光素dt的3'末端标 记的荧光染料，由于dna聚合酶(pfu型)的3'
→
5'核酸外切酶活性，其在延伸前被切除， 5'端标记为淬灭剂，sw位点
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