含有人脐带间充质干细胞冻干粉的抑菌水凝胶的制备方法

一、技术领域：

本发明涉及水凝胶的制备技术领域，具体涉及一种含有人脐带间充质干细胞冻干粉的抑菌水凝胶的制备方法。

二、

背景技术：
：

人体皮肤是具有抵御外部微生物入侵、避免体液流失和维持机体内部环境稳定等功能的第一道天然屏障。然而，皮肤在遭受手术、烧伤、皮肤病等严重损伤后，这层屏障就会失去其保护作用，最终形成伤口，且容易被大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等外界微生物侵入并导致感染，使伤口长时间无法愈合，进而可能会引起很多严重的并发症，如脓毒血症、破伤风以及高烧不退等，严重影响患者的生活质量，甚至威胁患者的生命安全。

伤口敷料通过对伤口进行覆盖，可以起到暂时的保护作用，同时营造利于伤口愈合的环境，避免发生细菌感染。传统的伤口敷料如纱布、绷带和棉花等，可以吸收伤口渗出液以维持干燥环境，是目前在临床上仍然被广泛应用的一种敷料，但这类敷料具有易撕扯伤口、易造成二次损伤、更换时疼痛感强、屏障保护作用差等缺点。为了达到良好的护理伤口的效果，人们着手开发新的伤口敷料。

新型敷料如薄膜、泡沫、纤维和水凝胶等，具有保持伤口湿润、维持细胞增殖所需养分的运输、不与伤口粘连、可加速伤口愈合和基本没有异物感等优势，使其逐渐取代传统敷料，成为目前人们热衷于研究的新型产品。但与此同时，这些新型敷料并不是完美的，例如：

薄膜敷料吸收渗液的能力较差，不适用于高渗出量的伤口；

泡沫敷料不具有粘性，因此需要其它具有粘性的二级敷料来固定，且外观不透明，不利于实时观察伤口愈合情况；

纤维敷料也不具有粘性且无止血功能等。

水凝胶是新型敷料中较为理想的一种，它所具有的三维立体多孔结构与外细胞基质十分类似，可以使其在保持伤口湿润的同时浓缩血小板以及红细胞，起到一定的凝血作用，且不易对伤口进行撕扯，减轻更换时所造成的疼痛和二次损伤；此外，其多孔结构还可以维持氧气渗透，并可以负载药物以及细胞生长因子等物质，促进成纤维细胞的增殖，以加速伤口的愈合；最后，水凝胶具有一定延展性，被任意塑造成各种形状后可与创面形状匹配，并充分地对创面进行粘附、覆盖以及固定，以减少细菌的入侵。

然而目前现有的水凝胶敷料，均存在抑菌效果差以及不能促进伤口快速愈合等缺点，不足以为伤口提供有效的愈合环境，因此理想的水凝胶敷料的开发应用仍是一个巨大的挑战,需要在长期的研究和临床试验中继续探索。

三、

技术实现要素：
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本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种用于促进伤口愈合的含有人脐带间充质干细胞冻干粉的抑菌水凝胶的制备方法，该方法制备的水凝胶具有良好的抑菌性能以及促进伤口愈合的功能，可以为伤口愈合提供较为理想的湿润环境。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：含有人脐带间充质干细胞冻干粉的抑菌水凝胶的制备方法，其特征在于：方法步骤为：

1)将0.01～0.05m盐酸溶液与冻干石莼粉混合加热提取石莼聚糖，然后加入高碘酸钠对其进行氧化得到双醛化石莼聚糖，随后通过壳聚糖与双醛化石莼聚糖发生席夫碱反应，并加入多巴胺盐酸盐，构建得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶基质；

2)配制0.04～0.08m的硝酸银溶液，将步骤1)中得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶浸泡在配置好的硝酸银溶液中，在黑暗环境下反应15～20min，得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米粒子水凝胶；

3)对人脐带间充质干细胞在含5％的ultragro-advanced细胞营养添加剂的mem培养基中进行培养孵育，当其细胞密度达到80％左右时，用0.9wt％的nacl溶液洗涤3次，再继续在α-mem培养基中培养24h，收集其上清液，进行冻干处理，得到人脐带间充质干细胞冻干粉；

4)称取2～3g在步骤3)中得到的人脐带间充质干细胞冻干粉，溶于100ml的磷酸盐缓冲液中得到干细胞冻干粉溶液，并对步骤2)中得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米颗粒复合水凝胶进行24h的浸泡处理，得到含有人脐带间充质干细胞冻干粉的抑菌天然多糖水凝胶复合体系。

在步骤1)中，所述双醛化石莼聚糖和壳聚糖的质量比为1:0.5～1。

在步骤1)中，所述双醛化石莼聚糖和多巴胺盐酸盐的质量比为1:0.5～1。

在步骤2)中，所述硝酸银溶液浓度为0.04～0.08mol/l。

在步骤4)中，所述干细胞冻干粉溶液浓度为20～30mg/ml。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、本发明制备水凝胶基质的原材料较易获取：壳聚糖是对甲壳素进行n-脱乙酰化处理后得到的产物，而甲壳素存在于虾蟹等海洋节肢动物的甲壳、昆虫的甲壳、软体动物的壳和骨骼以及菌类和藻类的细胞膜等自然界物质中，来源十分广泛，因此壳聚糖较易获取；石莼聚糖主要存在于褐藻等藻类植物中，分布广泛，获取成本也较低；

2、本发明的复合水凝胶体系可以抑制细菌，防止伤口发生感染，同时在伤口愈合过程中释放细胞生长因子，以促进伤口加速愈合；且水凝胶内部具有均匀且稳定的三维立体网络结构，具有良好的吸水溶胀性能以及保湿性，能较好地维持伤口周围的湿润环境，在治疗慢性伤口等创面具有潜在的应用价值；

3、本发明制备所制得的水凝胶，具有良好的生物相容性以及抑菌性，对伤口基本无刺激，溶胀保湿性能很好，可以为伤口提供湿润环境，减轻更换敷料时产生的疼痛，具有一定的促进伤口愈合的能力。

四、附图说明

图1为水凝胶的抑菌效果图；其中(a)为测试例1中水凝胶的抑菌圈图片；(b)测试例1中水凝胶的抑菌圈直径；(c)测试例1中水凝胶的平板涂布抑菌图片；

图2为测试例2中小鼠成纤维细胞在水凝胶浸出液中培养后的存活率；

图3为水凝胶对促进大鼠伤口愈合的效果图；其中(a)测试例3中大鼠背部全层皮肤伤口图像；(b)测试例3中大鼠背部全层皮肤伤口比值曲线；

五、具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明一种含有人脐带间充质干细胞冻干粉的抑菌水凝胶的制备方法包括以下步骤：

步骤一：人脐带间充质干细胞(人类脐带由中国上海东方医院分娩的妇女提供。所有受试者均知情并同意。人脐带间充质干细胞经国家干细胞转化资源中心伦理委员会进行分离、培养以及认证)在含5％的ultragro-advanced细胞营养添加剂(heliosbioscience,hpcfdcgl50，美国)的mem(gibco,c12571500bt，中国)中培养，并置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行孵育。当人脐带间充质干细胞密度达到80％左右时，用0.9％wt％的nacl溶液洗涤3次，在无血小板裂解的mem培养基中培养24h，收集其上清液，在0.02mbar真空以及-90℃条件下冷冻48h，得到人脐带间充质干细胞冻干粉。

步骤二：将50g冻干石莼粉悬浮在1l的0.01m的盐酸(ph＝2)中，在连续搅拌下，将混合物加热至90℃，持续4h，待混合物冷却至室温后，将其进行离心(转速4000r/min，时间5min)，收集上清液，加入无水乙醇(体积比为1:3)以沉淀石莼聚糖，将混合物进行离心(转速4000r/min，时间10min)，弃去上清液；用无水乙醇洗涤沉淀并室温风干过夜，得到石莼聚糖，称取2g石莼聚糖溶解在200ml纯水中得到溶液，将1.072g高碘酸钠溶在2.5ml纯水中，得到0.5m的高碘酸钠溶液，将其加入到石莼聚糖溶液中，在室温黑暗环境下进行搅拌，反应持续10h，随后加入5ml乙二醇终止反应，得到石莼聚糖二醛溶液，并在纯水中透析48h(透析袋的分子截留量为10000)后冻干，得到双醛化石莼聚糖。

步骤三：称取0.3g壳聚糖，溶于ph＝4的3ml醋酸溶液中，得到壳聚糖溶液；称取0.3g双醛化石莼聚糖，溶于6ml纯水中，得到双醛化石莼聚糖溶液；称取0.15g多巴胺盐酸盐，溶于3ml纯水中，得到多巴胺盐酸盐溶液，将上述三种溶液在室温下混合搅拌过夜，得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶，称取0.3997g(2mm)的硝酸银固体，溶于50ml纯水中，得到0.04m的硝酸银溶液，将上述得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶浸泡在配置好的硝酸银溶液中，在黑暗环境下反应20min，得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米粒子水凝胶。

步骤四：称取2.5g步骤一中得到的人脐带间充质干细胞冻干粉，溶于100ml的磷酸盐缓冲液中得到干细胞冻干粉溶液，并对步骤三中得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米颗粒复合水凝胶进行24h的浸泡处理，得到人脐带间充质干细胞冻干粉/抑菌天然多糖水凝胶复合体系。

上述步骤二中所述的石莼聚糖与高碘酸钠的质量比为1:0.4～0.8，考虑到具有合适氧化度的氧化石莼聚糖会更利于发生希夫碱反应，使成胶更快速，因此该比值进一步优选为1:0.5～0.6。

上述步骤三中所述双醛化石莼聚糖和壳聚糖的质量比为1:0.5～2，实验结果表明，该质量比不宜过小，否则两者无法成胶；该质量比也不宜过大，否则两者反应所形成的水凝胶机械强度过大，质地较硬，可塑性较弱，因此该比值进一步优选为1:0.5～1。

考虑到水凝胶应具有合适的粘附性，本发明的步骤三中所述的双醛化石莼聚糖和多巴胺盐酸盐的质量比优选为1:0.5～1。

上述步骤三中所述的硝酸银溶液浓度为0.02～0.1m，实验结果表明，该浓度过小会导致水凝胶的抑菌性能较弱，而该浓度过大则会导致水凝胶具有一定的细胞毒性，因此硝酸银溶液浓度进一步优选为0.04～0.08m。

上述步骤四中所述干细胞冻干粉溶液浓度优选为20～30mg/ml。

实施例1

本实施例的抑菌水凝胶的制备方法采用以下数值制备：

(1)称取0.3g壳聚糖，溶于ph＝4的3ml醋酸溶液中，得到壳聚糖溶液；

(2)称取0.3g双醛化石莼聚糖，溶于6ml纯水中，得到双醛化石莼聚糖溶液；

(3)称取0.15g多巴胺盐酸盐，溶于3ml纯水中，得到多巴胺盐酸盐溶液；

(4)将上述三种溶液在室温下混合搅拌过夜，得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶；

(5)称取0.3997g(2mm)的硝酸银固体，溶于50ml纯水中，得到0.04m的硝酸银溶液，将上述得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶浸泡在配置好的硝酸银溶液中，在黑暗环境下反应20min，得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米粒子水凝胶；

(6)称取2.5g步骤一中得到的人脐带间充质干细胞冻干粉，溶于100ml的磷酸盐缓冲液中得到干细胞冻干粉溶液，并对步骤三中得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米颗粒复合水凝胶进行24h的浸泡处理，得到人脐带间充质干细胞冻干粉/抑菌天然多糖水凝胶复合体系。

实施例2

本实施例的抑菌水凝胶的制备方法采用以下数值制备：

(1)称取0.2g壳聚糖，溶于ph＝5的3ml醋酸溶液中，得到壳聚糖溶液；

(2)称取0.3g双醛化石莼聚糖，溶于6ml纯水中，得到双醛化石莼聚糖溶液；

(3)称取0.15g多巴胺盐酸盐，溶于3ml纯水中，得到多巴胺盐酸盐溶液；

(4)将上述三种溶液在室温下混合搅拌过夜，得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶；

(5)称取0.7994g(4mm)的硝酸银固体，溶于50ml纯水中，得到0.08m的硝酸银溶液。将上述得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶浸泡在配置好的硝酸银溶液中，在黑暗环境下反应20min，得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米粒子水凝胶；

(6)称取2g步骤一中得到的人脐带间充质干细胞冻干粉，溶于100ml的磷酸盐缓冲液中得到干细胞冻干粉溶液，并对步骤三中得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米颗粒复合水凝胶进行24h的浸泡处理，得到人脐带间充质干细胞冻干粉/抑菌天然多糖水凝胶复合体系。

实施例3

本实施例的抑菌水凝胶的制备方法采用以下数值制备：

(1)称取0.3g壳聚糖，溶于ph＝5的3ml醋酸溶液中，得到壳聚糖溶液；

(2)称取0.3g双醛化石莼聚糖，溶于6ml纯水中，得到双醛化石莼聚糖溶液；

(3)称取0.2g多巴胺盐酸盐，溶于3ml纯水中，得到多巴胺盐酸盐溶液；

(4)将上述三种溶液在室温下混合搅拌过夜，得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶；

(5)称取0.3997g(2mm)的硝酸银固体，溶于50ml纯水中，得到0.04m的硝酸银溶液。将上述得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺水凝胶浸泡在配置好的硝酸银溶液中，在黑暗环境下反应20min，得到双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米粒子水凝胶；

(6)称取3g步骤一中得到的人脐带间充质干细胞冻干粉，溶于100ml的磷酸盐缓冲液中得到干细胞冻干粉溶液，并对步骤三中得到的双醛化石莼聚糖/壳聚糖/多巴胺/银纳米颗粒复合水凝胶进行24h的浸泡处理，得到人脐带间充质干细胞冻干粉/抑菌天然多糖水凝胶复合体系。

测试例1

本测试例用于说明本发明中制备的水凝胶的抑菌性能。

样品制备：取实施例1制备的水凝胶敷料作为实验组，实施例1的方法制备不含银的水凝胶敷料作为对照组。

菌种选择：选择金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和大肠杆菌(escherichiacoli)这两种常见的致病细菌作为模型菌种进行测试。

测试方法：采用琼脂平板涂布法以及抑菌圈实验来表征水凝胶敷料的抗菌性能。

琼脂平板涂布法：将两种细菌悬液(1×10⁶cfu/ml)放入10ml离心管中，每管6ml细菌悬液，将体积约为1cm³的样品水凝胶放入离心管中。将两组含有水凝胶的细菌悬液置于摇床中进行培养，培养条件是温度37℃，转速200rpm，时间为20min。用移液枪吸取各组培养后的细菌悬液100μl，将其置于固体琼脂培养基上，用三角玻璃棒(三角玻璃棒在使用前后均需利用酒精灯进行灼烧处理，以杀灭其表面附着的细菌)将细菌悬液涂抹均匀。最后将处理好的固体琼脂培养皿用封口膜进行密封，倒置放在恒温培养箱中，37℃下培养12h。培养结束后，观察各组细菌繁殖情况并与空白组进行对照以评估各组样品水凝胶的抗菌性能。结果表明，实验组的水凝胶组菌落数量减少，说明其对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用，对大肠杆菌的抑制作用则更明显。

抑菌圈法：取各组培养后的细菌悬液100μl，置于固体琼脂培养基上，用三角玻璃棒将细菌悬液涂抹均匀，三角玻璃棒在使用前后均需在酒精灯上进行杀菌处理。用镊子将牛津杯置于固体琼脂培养基中间(牛津杯规格为：内径8mm，外径10mm，高10mm)，轻按牛津杯使其没入固体琼脂培养基约1mm，将样品水凝胶填满牛津杯剩余空间。最后将处理好的固体琼脂培养皿用封口膜进行密封，放在恒温培养箱中，37℃下培养12h。培养结束后，测量抑菌圈的直径以评估各组样品水凝胶的抗菌性能。

测试结果：在实验组和对照组的水凝胶周围均存在抑菌圈，但是相对于对照组水凝胶(金黄色葡萄球菌抑制直径为14mm，大肠杆菌的抑制直径为24mm)，实验组水凝胶周围的抑菌圈直径更大(金黄色葡萄球菌抑制直径为20mm，大肠杆菌的抑制直径为31mm)，说明其抑菌能力更好，结果如图1所示。

测试例2

本测试例用于说明本发明中制备的水凝胶的细胞相容性。

样品制备：取实施例2制备的水凝胶敷料作为实验组，实施例2的方法制备但不含人脐带间充质干细胞冻干粉的水凝胶敷料作为对照组。

细胞选择：本实验利用nih/3t3细胞对水凝胶的细胞相容性进行评估。

测试方法：本实验通过mtt法对水凝胶的细胞相容性进行评价。首先各取100mg的实验组和对照组水凝胶在紫外光下照射24h进行灭菌，然后浸入2ml的dmem培养基中，在37℃下浸泡24h，得到50mg/ml的浸出液，然后用培养基将部分浸出液分别稀释至浓度为5、10、20、30、40mg/ml，获得不同浓度梯度的浸出液。使用96孔板进行培养，每孔接种3×10⁴个nih/3t3细胞，贴壁12小时后分别依次加入不同浓度梯度的各组水凝胶浸出液100μl，并设置不添加浸出液的细胞作为对照组，放置在co2浓度为5％，温度为37℃的恒温培养箱中继续孵育24h。孵育完成后，向各孔中加入20μl的mtt(5mg/ml)，避光反应4h后吸去各孔中的培养液，再向每孔中加入150μl的dmso，处理完毕后将其置于摇床中震荡15min。最后用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸光度值(ods)，空白组吸光度值(odb)用培养基、mtt和dmso来代替以进行测定，对照组的吸光度值则记作odc。每个样品设置3个平行实验。各组的相对细胞存活率(relativecellviability,rcv)用下式进行计算。

测试结果：经过24h的孵育后，各组细胞存活率均在80％以上，说明水凝胶具有良好的生物相容性，对正常成纤维细胞无毒副作用，结果如图2所示。

测试例3

本测试例用于说明本发明中制备的水凝胶的促进伤口愈合的能力。

样品制备：取实施例3制备的水凝胶敷料作为实验组，实施例3的方法制备但不含人脐带间充质干细胞冻干粉的水凝胶敷料作为对照组。

测试对象选择：6周大的sd大鼠(体重为200-230g，雌性)。

测试方法：本实验使用大鼠背部全层皮肤破损模型以评估水凝胶促进伤口愈合的能力。将6周大的sd大鼠(体重为200-230g，雌性)随机分为实验组和对照组，每组使用5只。向大鼠腹膜内注射水合氯醛(0.3mg/kg)对其进行麻醉后，在其背部区域剃毛，用酒精消毒后使用解剖剪刀在每只鼠背部剃毛的区域制造一个直径约为10mm的全层皮肤破损伤口，并分别用两种水凝胶进行覆盖。处理完毕后将各组小鼠单独放入笼子中进行饲养，并在恒温下提供等量的食物和水。用普通相机记录第0、3、6、9、12天的伤口图像，使用imagej软件测量伤口面积，计算相应的伤口面积比值并作图以分析伤口愈合情况。伤口面积比值(woundarearatio,war)的定义为治疗后伤口面积与原始伤口面积的比值。

测试结果：第6天后，两组创面均有明显结痂并开始逐渐愈合，该过程中的实验组伤口面积比值始终小于对照组。在第12天，用水凝胶治疗的伤口完全闭合，较对照组提前3天，结果如图3所示。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。