一个野生大豆Bet_v_1家族基因GsMLP328的应用

一个野生大豆bet_v_1家族基因gsmlp328的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域,涉及一个野生大豆bet_v_1家族的mlp亚家族基因gsmlp328的应用，具体涉及来源于野生大豆的在荚中高表达并与果荚发育相关的bet_v_1家族基因gsmlp328在调控植物株型以及荚果数、千粒重等产量性状相关方面的应用。


背景技术：

2.荚果发育是高等植物生长发育过程中的重要环节，荚果数和粒重性状与作物的产量和农产品质量关系紧密，进而影响经济效益。荚果数的增多会提高大豆的产量，对于大豆育种有着重要的意义。黑龙江省野生大豆资源丰富，为大豆研究提供了宝贵的基因源。本实验室李炜(2019)通过对黑龙江省249份野生大豆自然群体的百粒重性状数据进行全基因组关联分析，在20号染色体上显著关联的snp位点挖掘出一个bet_v_1家族的mlp亚家族基因glysoja.20g052861，含有bet_v_1结构域，可能参与调节荚果发育以及产量调控机制。mlp成员可能参与植物的生长发育、激素调控以及氧化应激，生物碱生物合成，生物和非生物的胁迫响应。glysoja.20g052861在本论文中命名为gsmlp328，gsmlp328在荚组织中的表达量最高，表明gsmlp328有可能参与荚果发育以及产量调控，因此初步研究gsmlp328的生物学功能。
3.gsmlp328属于bet_v_1家族的mlp亚家族，mlp(major latex protein)属于一类特殊的编码乳胶蛋白，首先在罂粟中被发现(nessler et al.,1985)，mlp编码的同源蛋白在植物中特有，该家族在许多作物中都有被发现，例如拟南芥、苹果、棉花、大豆、烟草等(aggelis et al.,1997；wu et al.,2008)。mlp蛋白属于bet_v_1家族成员，该家族基因序列相似度不高，但相关研究发现，它们在蛋白的结构上却很相似(丛茹,2017)，均存在一个疏水结合位点为植物激素、次级代谢物的结合创造了便利条件(heimo et al.,2008)，并且含有保守的gly
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rich loop。bet_v_1作为植物中一类重要的家族，其成员有11个亚家族，主要包括mlp亚家族，pr10亚家族等。研究表明，bet_v_1家族的成员大多数是和一些配体互作从而行使其生物学功能(koistinen et al.,2005)。就目前的研究结果来看，mlp成员可能参与植物的生长发育、激素调控以及氧化应激，生物碱生物合成，生物和非生物的胁迫响应。据现有研究结果表明，bet_v_1家族成员在生物胁迫和非生物胁迫中起到很重要的角色，mlp家族蛋白作为其重要成员之一，在胁迫响应方面确实有很多关键角色，主要与病原体的防御反应相关(李荣,2018)。mlp家族基因参与调节植物的生长发育过程，有研究发现通过mirna来降低mlp28基因表达的转基因拟南芥株系表现出严重的发育缺陷，例如叶片形态的改变，茎尖缺陷，植株过早死亡。这些表型特征类似于拟南芥中过表达lcr的植物。综上所述，这些结果表明mlp基因家族被lcr驱动降解，表明mlp基因家族是mir394lcr调控节点的靶点，代表了lcr f
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box介导的直接翻译后调控的潜在靶点(litholdo et al.,2016)。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供公开一个野生大豆bet_v_1家族基因gsmlp328。
5.本发明的另一目的是提供该基因在荚果发育及调控荚果数、千粒重等基因工程应用。
6.本发明的目的可通过如下技术方案实现:
7.野生大豆bet_v_1家族基因gsmlp328,核苷酸序列为seq id no.1。
8.本发明所述的野生大豆bet_v_1家族基因gsmlp328编码的蛋白质，其氨基酸序列为seq id no.2。
9.含有本发明所述的野生大豆bet_v_1家族基因gsmlp328的表达载体。
10.本发明所述的野生大豆gsmlp328蛋白编码基因在增加拟南芥的角果数、提高拟南芥株高、分枝数以及千粒重中的应用。
11.本发明所述的重组表达载体在增加拟南芥的角果数，提高拟南芥株高、分枝数以及千粒重中的应用。
12.使用gsmlp328构建植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的选择性标记基因(gus基因、gfp基因等)或者抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。
13.携带有本发明gsmlp328的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物,也可以是烟草、拟南芥、大豆、油菜、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。
14.有益效果:
15.本发明中gsmlp328属于bet_v_1家族的mlp亚家族，含有bet_v_1结构域。通过组织表达分析发现gsmlp328主要在荚中表达，亚细胞定位显示gsmlp328蛋白于细胞质、细胞核、细胞膜中都有被定位到。拟南芥中过表达gsmlp328，发现与对照相比，转基因拟南芥的长角果数明显增多，并且株型性状有所改变。转基因拟南芥千粒重统计分析表明gsmlp328转基因株系与对照相比能够显著提高种子的千粒重。本发明公开了该基因在调控植株荚果发育的效用，以及在产量性状中的变化。可以通过定向地改造作物的荚果数,为农作物提高产量。
16.利用植物过表达载体pmdc83
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gsmlp328,将本发明的gsmlp328导入植物体内,可以调控植株结荚情况，获得转基因植株。
附图说明
17.下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
18.图1gsmlp328基因的克隆
19.根据w05网站预测的gsmlp328序列信息设计引物，以野生大豆材料haas_187的荚cdna为模板pcr扩增，得到一条长462bp的dna片段。经过测序结果分析，该片段的序列信息与w05网站预测的序列一致，即该462bp片段即为gsmlp328基因。其中marker为2k，从下往上依次为100，250，500，750，1000，2000bp。
20.图2gsmlp328基因的组织表达分析。
21.采用实时荧光定量pcr技术对gsmlp328在野生大豆haas_187的不同组织表达进行研究，野生大豆不同组织分别为根、茎、叶、花、35d荚、35d种子。
22.图3gsmlp328的亚细胞定位(a)d35s::gfp；(b)d35s::gsmlp328
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gfp；
23.图4转基因拟南芥的pcr鉴定。
[0024]1‑
13为不同的转基因株系；wt为野生型拟南芥(阴性对照)；p：为pmdc83
‑
gsmlp328重组质粒(阳性对照)。
[0025]
图5gsmlp328在不同转基因拟南芥株系中的相对表达量
[0026]
2,3,4,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21为不同的转基因株系，wt为野生型拟南芥。
[0027]
图6转基因拟南芥和野生型拟南芥长角果数比较
[0028]
12,15,16,17,20,21,35为不同的转基因株系，wt为野生型拟南芥。*表示0.01<p<0.05水平下显著差异；**表示p<0.01水平下极显著差异；
[0029]
图7转基因拟南芥和野生型拟南芥千粒重统计分析
[0030]
3,7,12,15,16,17,20,21,35为不同的转基因株系，wt为野生型拟南芥。*表示0.01<p<0.05水平下显著差异；**表示p<0.01水平下极显著差异；
[0031]
图8转基因拟南芥和野生型拟南芥株型比较
具体实施方式
[0032]
下面结合附图和实施例,并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物,均在首次出现时标明,其后所用相同引物,均以首次标明的内容相同。
[0033]
实施例1野生大豆gsmlp328及其编码基因的克隆与鉴定
[0034]
以黑龙江省拜泉野生大豆haas_187为实验材料，2020年6月种植于南京农业大学牌楼教学实验基地，以开花后daf35天荚cdna为模板，以gsmlp328
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f和gsmlp328
‑
r为引物进行pcr扩增。
[0035]
上游引物gsmlp328
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f：aaaccacgaccatttgagcc；(seq id no.3)
[0036]
下游引物gsmlp328
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r：aactttatttagcgtgaacc。(seq id no.4)
[0037]
应用rt
‑
pcr方法，从大豆荚器官总rna中扩增gsmlp328基因。取大豆荚组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5ml ep管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5ml ep管中，采用植物总rna提取试剂盒(tiangen dp404)进行总rna提取。用甲醛变性胶电泳鉴定总rna质量，然后在分光光度计上测定rna含量。以获得的总rna为模板,按照takara公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cdna第一链。进行pcr扩增反应。pcr反应体系为:2μl cdna(0.05μg)、上、下游引物各2μl(10μm)、25μl 2
×
phanta max buffer、1μl dntp(10mm)和1u phanta max super
‑
fidelity dna聚合酶(vazyme),用超纯水补足50μl。pcr程序如下：在bio
‑
rad ptc200型pcr仪上进行,其程序为94℃预变性3min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸45s,共30个循环；然后72℃延伸5min终止反应，4℃保存。pcr产物回收将其克隆至pclone007载体，测序后获得具有完整编码区的大豆基因gsmlp328的cdna序列seq id no.1，全长462bp，编码seq id no.2所示的153个氨基酸。
[0038]
实施例2gsmlp328在野生大豆不同器官中的表达特征
[0039]
提取haas_187材料的根、茎、叶、花、7d荚、15d荚、25d荚、35d荚、45d荚、35d种子的rna，反转成cdna进行rt
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pcr分析。
[0040]
总rna的提取同实施例1。以大豆组成型表达基因tubulin为内参基因，其扩增引物为tubulin正向引物序列:ggagttcacagaggcagag(seq id no.5)，tubulin反向引物序列:cacttacgcatcacatagca(seq id no.6)。以来自大豆不同组织或器官的cdna为模板，进行实时荧光定量pcr分析。gsmlp328的扩增引物为:gsmlp328
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qpcr
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f:cattcgctgatggggacact(seq id no.7),gsmlp328
‑
qpcr
‑
r:tgtacttggttggctcaggg(seq id no.8)。结果(图2)分析表明gsmlp328在荚中的表达相对较高，表明gsmlp328可能与大豆荚发育相关。
[0041]
实施例3gsmlp328的亚细胞定位
[0042]
亚细胞定位采用本氏烟草瞬时表达的方法，使用的载体是p2，引物为gsmlp328
‑
p2
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f:acaaatctatctctctcgagatgtctcaacccgactcgttgg(seq id no.9)，gsmlp328
‑
p2
‑
r:gctcaccatggatccacgagcctcaacaagatga(seq id no.10)。pcr扩增，目的条带正确后进行割胶回收，胶回收产物通过同源重组的方法连接到载体上，构建亚细胞定位载体p2
‑
gsmlp328(基因在gfp的n端)，烟草瞬时表达表达后暗培养48h，经激光共聚焦显微镜(zeiss，lsm780)激光照射后，可产生绿色荧光信号，对蛋白质进行定位，观察拍照。结果如图3
‑
5所示，转入空载质粒在整个细胞中都有分布，gsmlp328：gfp融合蛋白分布于细胞质、细胞膜和细胞核中，表明gsmlp328可能在核质膜中发挥功能。
[0043]
实施例4gsmlp328的基因工程
[0044]
利用双酶切法构建载体，分为酶切反应和重组反应两步，引物序列为：f:caggtcgactctagaggatccgccaccatgtctcaacccgactcgttgg(seq id no.11)
[0045]
r:gggaaattcgagctcggtaccttaacgagcctcaacaagatga(seq id no.12)
[0046]
pmdc83载体由bamh1和kpnl双酶切，通过加接头引物从t
‑
gsmlp328载体中扩增目的片段，然后重组连接，产物即表达载体pmdc83
‑
gsmlp328，转化大肠杆菌dh5α,转化液涂布于含50mg/l kana的lb固体培养基上筛选阳性克隆。经测序验证后,提取质粒,得到pmdc83
‑
gsmlp328植物过量表达载体,用冻融法将pmdc83
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gsmlp328转入根癌农杆菌菌株eha105中。将pmdc83
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gsmlp328通过农杆菌株eha105的介导转化拟南芥,在含有50mg/lkana的ms培养基上培养,初步筛选得到具有kana抗性的转基因植株。
[0047]
提取初步筛选得到具有kana抗性的转基因拟南芥的基因组dna,使用基因特异性引物gsmlp328
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f:gaggacctcgactctagaacta(seq id no.13),和gsmlp328
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r:gggaaattcgagctcggtaccttaacgagcctcaacaagatga(seq id no.14)进行pcr鉴定。能够扩增出约为462bp大小条带的为阳性转基因拟南芥(图3)。选择pcr鉴定为阳性的植株,以gsmlp328
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qpcr
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f：cattcgctgatggggacact(seq id no.15)和gsmlp328
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qpcr
‑
r：tgtacttggttggctcaggg(seq id no.16)为引物,进行实时荧光定量pcr检测。结果表明gsmlp328可在转基因拟南芥中表达(图4)。将pcr、实时荧光定量pcr检测均为阳性的转基因植株命名为35s::gsmlp328转基因拟南芥。
[0048]
对35s::gsmlp328转基因拟南芥进行表型观察。在25℃、长日照的生长条件下，35s::gsmlp328转基因拟南芥与对照相比，苗期时(发芽后3周和4周)观察表型发现，gsmlp328转基因植株有3个株系的叶片长势整体比wt大，测量叶片数目、长宽度发现，转基
因植株叶片数目增加，叶片长度、宽度以及叶面积也显著增加。对植株的株型性状进行观察，结果表明gsmlp328转基因植株分别有7个株系的株高与wt相比显著增加。对分枝数进行观察，发现有3个转基因株系的分枝数比wt显著增加。观察wt和转基因株系，发现与wt相比，有6个转基因株系的茎粗显著增加。对产量性状进行观察比较，wt相比，gsmlp328转基因的9个株系的长角果数量显著增加，有8个株系的千粒重显著增加，统计各株系每荚粒数，发现与wt相比，转基因株系每荚粒数变化不明显，有8个株系的单株种子重量显著增加。总的来说，gsmlp328转基因植株主要通过增加荚数，从而使单株产量提升，这对于大豆产量育种研究提供了新的思路。