一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组毕赤酵母及其构建方法与应用

idno.1所示，所述岩藻糖激酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.在本发明的一些实施方式中，所述岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶来源于野猪(sus scrofa)的 fpgt基因，所述岩藻糖激酶基因来源于野猪(sus scrofa)的fcsk基因。
11.在本发明的一些实施方式中，所述岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶的表达序列如seq id no.3 所示，所述岩藻糖激酶的表达序列如seq id no.4所示。
12.在本发明的一些实施方式中，所述载体的序列如seq id no.5所示。
13.本发明的第二个方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞包含本发明第一方面所述的表 达载体，其中所述细胞为非植物细胞。
14.在本发明的一些实施方式中，所述细胞为毕赤酵母。
15.在本发明的一些优选实施方式中，所述细胞为毕赤酵母gs115。
16.本发明的第三个方面，提供本发明第二方面所述的重组细胞的构建方法，包括以下步骤： 将本发明第一方面所述载体转入细胞中。
17.在本发明的一些实施方式中，所述构建方法具体为将本发明第一方面所述载体电转化毕 赤酵母gs115的感受态细胞。
18.本发明的第四个方面，提供本发明第一方面所述的载体或本发明第二方面所述重组细胞 的应用。
19.在本发明的一些优选实施方式中，所述应用具体为在制备鸟苷二磷酸岩藻糖中的应用。
20.本发明的第五个方面，提供一种制备鸟苷二磷酸岩藻糖的方法，通过本发明第二方面所 述的重组细胞生成。
21.在本发明的一些实施方式，所述发酵条件为将重组细胞种子液以od600值为0.5～1.5的 接种量接入发酵培养基，在25～35℃，200～300rpm条件下培养100～140h。
22.在本发明的一些优选实施方式中，所述发酵条件为将重组细胞种子液以od值为1的接 种量接入发酵培养基，在30℃，250rpm条件下培养120h。
23.本发明还提供一种鸟苷二磷酸岩藻糖，由本发明第五方面所述的方法制备而成。
24.本发明的有益效果是：
25.本发明提供了一种载体，所述载体含有岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶的表达序列和/或岩藻糖 激酶的表达序列。并且提供了一种重组细胞，是在毕赤酵母gs115的基础上表达岩藻糖
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磷 酸鸟苷转移酶和岩藻糖激酶基因得到的，通过改造获得了可合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组菌 株。本发明重组毕赤酵母的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
26.图1为鸟苷二磷酸岩藻糖生物合成示意图。
27.图2为本发明实施例1合成鸟苷二磷酸岩藻糖质粒示意图。
28.图3为本发明实施例1中质粒转化表达fpgt和fcsk基因的酵母菌落pcr验证琼脂糖 凝胶电泳图。
29.图4为本发明实施例2中的高效液相色谱图。
30.图5为本发明实施例2中的质谱图。
具体实施方式
31.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地 理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不 是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获 得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
32.高效液相色谱(hplc)检测法：agilent，uv检测器，c18柱(250
×
4.6mm，5μm)，流动相 a：20mm ph6.0三乙胺乙酸缓冲液(teaa)，流动相b：乙腈，流速0.35ml/min，柱温40℃， 进样体积为10μl。
33.实施例1重组毕赤酵母的构建
34.根据ncbi上公布的野猪[sus scrofa(pig)]的岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶(fpgt)和岩藻糖 激酶(fcsk)的序列，其中岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶基因在ncbi上的gene id：100513664， 其氨基酸序列如seq id no.1所示；岩藻糖激酶基因在ncbi上的gene id：100625448，其 序列如seq id no.2所示，上述两基因均按照毕赤酵母密码子偏好性进行优化。其优化后的 岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶的碱基序列如seq id no.3所示，岩藻糖激酶的碱基序列如seqid no.4所示；通过酶切连接，构建序列如seq id no.5所示的重组质粒。其质粒示意图如 图2所示。
[0035]
其中：
[0036]
seq id no.5：no.5：
[0037]
[0038]
[0039]
[0040]
[0041]
[0042]
[0043][0044]
在seq id no.5中“_”为基因fpgt区域，“～”为fcsk区域，
“…”
为启动子区域。
[0045]
将构建好的重组质粒电转化重组毕赤酵母gs115的感受态细胞，重组质粒的添加量为 800～1500ng，电转化条件：电压2.5kv，电击试剂5.6ms，30℃复苏1.5h，涂布终浓度为100mg/l 博莱霉素抗性的ypdz平板，30℃培养96h，挑选若干单菌落。
[0046]
通过博莱霉素抗性平板筛选，菌落pcr验证，确证岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶(fpgt) 和岩藻糖激酶(fcsk)成功整合到酵母基因组。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图3所示，其中条 带1、2、3、4、5均为菌落样品，m为marker。可以看出菌落pcr验证有特殊条带，证明岩 藻糖
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磷酸鸟苷转移酶和岩藻糖激酶成功整合的毕赤酵母gs115基因组中。确认野猪来源的 岩藻糖
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磷酸鸟苷转移酶和岩藻糖激酶表达成功，得到重组毕赤酵母gs115。
[0047]
实施例2发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖
[0048]
将实施例1中重组毕赤酵母制成种子液，种子液培养基的配方为：甘油10g/l、胰蛋白胨 10g/l、酵母粉5g/l、nacl 10g/l；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养 基中，培养24h。
[0049]
将种子液以od值为1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：蛋白胨 20g/l、酵母粉10g/l、1.34％ynb；10％10
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ph6.0磷酸缓冲液，于30℃、250rpm条件下培养 120h，每隔24h流加1％碳源，碳源为甲醇，在发酵48h后每隔24h向培养基中添加1g/l岩 藻糖至发酵结束。
[0050]
发酵结束后，使用高效液相色谱测定发酵细胞中的鸟苷二磷酸岩藻糖，结果如图4所示， 并通过质谱进一步确证，结果如图5所示，鸟苷二磷酸岩藻糖的含量为289.8mg/l。
[0051]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术 领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。 此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。