一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法与流程

1.本发明是关于一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法，属于捕获建库技术领域。


背景技术：

2.杂交捕获是ngs中目标区域捕获的主要技术之一，杂交过程中通常会采用两种封闭试剂来分别封闭adaptor序列和人类基因组上的重复序列。因为adaptor序列和人类基因组上的重复序列可能会和部分目标文库序列碱基互补结合，捕获磁珠捕获探针结合的目标区域文库的同时，这部分文库也结合在非目标文库上面，后续洗脱时候也洗脱不掉，从而使得非目标文库结合过多，导致捕获效率降低。所以不管是adaptor序列的封闭试剂，还是人类基因组上的重复序列的封闭试剂，任意一种封闭试剂使用错误的话都会显著降低捕获效率。
3.目前主流的液相捕获产品都会用到两种封闭试剂：通用封闭序列和cot
‑
1 dna；通用封闭序列的作用是封闭文库接头，减少接头杂交；cot
‑
1 dna的作用是封闭人基因组上的重复序列，减少重复序列杂交。
4.人基因组dna的cot部分主要由快速退火的重复序列组成。sine(小散在重复序列，例如alu序列)和line(大散在重复序列，例如l1序列)等散在重复序列(irs)在整个基因组中广泛分布。在富含这些重复序列的条件下，通过剪切、变性和再退火，由人胎盘dna制备人cot dna。
5.现有技术“人cot
‑
1dna的制备”(革文新等，人cot
‑
1dna的制备[j]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第3期(127))报道了采用羟基磷石灰柱层析法(hap柱分离法)分离制备cot
‑
1dna的方法。该方法是将获得的基因组dna用超声波打断到需要大小，根据hap的吸附能力和分离柱所装的hap的量计算出所需要用的打断的dna的量，100℃变性10min，冰浴骤冷，按照公式cot＝1＝mol/l
×
ts计算dna复性时间t，于60℃cot
‑
1dna复性t秒，复性结束后，立即置于冰浴中10min，加入等体积的水溶液，将样品加入到hap分离柱上，经过调整磷酸盐的浓度，依次洗脱游离核苷酸等杂质，单链核苷酸，最终洗脱cot
‑
1dna洗脱峰，并收集，用两倍体积的乙醇室温沉淀收集的cot
‑
1dna，8000r/min室温离心20min，用适当的水溶解所得到的盐和cot
‑
1dna所得到的共沉淀混合物，然后用sephadex g
‑
50脱盐，收集dna峰，加入1/10体积3m的醋酸钠，和两倍体积的酒精8000r/min4℃离心20min，收集沉淀得到cot
‑
1dna。上述制备cot
‑
1dna的方法
‑
hap柱分离法虽然制备效果可以满足杂交的需求，但是制作方法繁琐，且耗时耗力。目前，invitrogen公司的商品cot
‑
1dna是常见的商品化的cot
‑
1dna，但是价格也是较为昂贵的。


技术实现要素：

[0006]
本发明的主要目的在于提供一种制备重复序列封闭试剂的新方法。
[0007]
为实现上述目的，本发明提供了一种制备重复序列的封闭试剂的方法，该方法包
括：
[0008]
采用多重取代扩增技术(mda)对基因组dna进行扩增；
[0009]
对扩增产物进行纯化后，打断至约200
‑
300bp长度的dna片段，所得产物即为重复序列的封闭试剂。
[0010]
本发明中，采用多重取代扩增技术(mda)对基因组dna进行扩增以制备重复序列的封闭试剂。mda是最近几年发展起来的一种单细胞全基因组扩增技术，该技术是基于环状滚动扩增方法创建的一种链置换扩增技术，mda利用具有高度延伸活性的phi29dna聚合酶和耐核酸外切酶的六聚体随机引物在等温条件下对基因组进行扩增。与dop
‑
pcr和pep
‑
pcr比较，mda无论是扩增的效率还是扩增的可信度都明显具有优势，能均匀扩增全基因组，而没有明显的偏移。mda可以从1
‑
10个拷贝的基因组dna扩增出20
‑
30fg的产物。
[0011]
利用本发明的方法制备重复序列的封闭试剂，可以规避现有技术方法存在的胎盘dna不容易获得以及hap柱分离法繁琐且费时费力的缺点。
[0012]
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法，还包括提取基因组dna的过程。
[0013]
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法中，基因组dna的提取可以使用本领域的现有技术，包括使用商品化的基因组提取试剂盒。
[0014]
在本发明的一些具体实施方案中，按照以下方法提取基因组dna：
[0015]
提取基因组dna的时候加入核裂解液、蛋白酶k、sds以使组织能够充分裂解，37℃
‑
56℃消化12
‑
16小时；3000
‑
10000rpm离心5
‑
15min将dna分离。
[0016]
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法中，采用多重取代扩增技术对基因组dna进行扩增过程中，采用以下引物：
[0017]
中度重复序列和/或高度重复序列的引物；或
[0018]
将cot
‑
1 dna打断后作为随机引物。
[0019]
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法中，所述中度重复序列和/或高度重复序列的引物可选自alu、kpn、line中的一种或多种。优选地，所述中度重复序列和/或高度重复序列的引物包括alu、kpn、line家族中的各至少一种，即，至少包括alu家族中的至少一种、kpn家族中的至少一种以及line家族中的至少一种(对)。
[0020]
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法中，将cot
‑
1 dna打断后作为随机引物时，是将cot
‑
1 dna打断至约20
‑
40bp小片段。
[0021]
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法中，采用多重取代扩增技术对基因组dna进行扩增过程按照以下操作进行：
[0022]
对样本进行裂解，中和后离心，加入扩增混合液，进行pcr扩增。优选地，扩增时，其中pcr仪中设置30℃，8h；65℃，5min；热盖70℃。
[0023]
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法中，裂解采用的裂解液配方包括：每1反应体积，裂解缓冲液1.15μl，dtt 0.35μl，nf水1.5μl。
[0024]
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法中，扩增混合液配方包括：每1反应体积，扩增缓冲液37μl，dna聚合酶2μl，引物3μl，增强子0.5μl。
[0025]
除特别注明外，本发明中所用的各试剂材料，例如各缓冲液、聚合酶、增强子等，均可采用本领域中的常规试剂材料。
[0026]
本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法中，扩增产物纯化后进行打断时，按照所属领域的常规操作或仪器厂商的说明书进行即可。
[0027]
根据本发明的具体实施方案，本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法，还包括对打断产物进行纯化回收与质控的过程。
[0028]
需要说明的是，本发明中所述的打断的长度，例如“打断至约200
‑
300bp长度的dna片段”，是指打断得到的dna片段中有80％以上的片段长度在该长度范围内即可。同样的，“打断至约20
‑
40bp小片段”，是指打断至产物中有80％以上的小片段的长度在20
‑
40bp即可。
[0029]
本发明的制备重复序列的封闭试剂的方法，所制备得到的重复序列的封闭试剂可以与常用的cot1dna达到相同的封闭效果，同时制备方法方便简单。
具体实施方式
[0030]
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。实施例中，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件操作。
[0031]
实施例1
[0032]
本实施例提供了一种mda扩增方法制备重复序列封闭试剂的，主要操作包括：
[0033]
步骤一：提取基因组dna
[0034]
1.本实施例中，采用下面的步骤进行基因组dna的提取。
[0035]
取新鲜动物组织25
‑
50mg，加入600μl的lysis buffer，颠倒充分混匀。加入10μl proteinase k(浓度为10mg/ml)混合均匀。水浴56℃消化12
‑
16小时，4700rpm离心10min使dna和蛋白等杂质分离。由于给予充分的消化时间，此时的dna已经得到很好的消化，可免去对dna进行纯化的步骤，不仅节约了一部分对dna进行纯化的试剂，还可避免在纯化过程中减少提出的dna的损失。
[0036]
步骤二：设计合成扩增高度重复序列的引物(如alu、kpn、line等)
[0037]
1.引物序列如下所示
[0038][0039]
采用dsl方式合成上述引物。
[0040]
步骤三：mda扩增反应
[0041]
1.样本裂解
[0042]
1)裂解液配方如下：
[0043]
试剂用量(1reactions)
lysis buffer1.15μldtt0.35μlnf水1.5μl
[0044]
2)4μl样本(gdna≥25pg)，加3μl裂解液，震荡混匀离心。
[0045]
3)pcr仪中65℃裂解10min，热盖70℃。
[0046]
2.中和
[0047]
取3μl stop solution加入裂解混合物中，震荡混匀离心
[0048]
3.扩增
[0049]
1)扩增混合液配方如下：
[0050]
试剂用量(1reactions)amplification buffer37μldna聚合酶2μl引物3μlenhancer0.5μl
[0051]
2)取42.5μl扩增混合液加入样本中，总体积52.5μl，震荡混匀
[0052]
3)pcr仪中设置30℃，8h；65℃，5min；热盖70℃
[0053]
4.mda产物纯化
[0054]
采用柱式纯化，推荐康为世纪cw2301m，具体操作详见说明书。
[0055]
步骤四：mda扩增产物片段打断
[0056]
以下为covaris m220 dna shearing步骤(按照厂商说明书进行即可)：
[0057]
开机检查
[0058]
1)检查固定在机器顶部的电脑与机器的线路连接是否妥当。
[0059]
2)确认水盘(drip tray)放置机器下方。
[0060]
3)插入操作管支架(tube holder)
[0061]
水浴设置
[0062]
1)将操作管支架(tube holder)顶部的滑行砝码(sliding weight)拉起并旋转90℃。
[0063]
2)用随机水瓶(wash bottle)将约15ml蒸馏水或去离子水加入支架中心，水位到达或超过运行标记(“run”marker)为宜。
[0064]
样品放置
[0065]
1)将操作管支架(tube holder)顶部的滑行砝码(sliding weight)拉起并旋转90℃。
[0066]
2)放入样品管，旋转并放下滑行砝码，使之压住样品管，然后关闭安全门。
[0067]
3)开机：先打开仪器主机，然后开启电脑和软件。
[0068]
参数设置
[0069]
1)点击软件run界面的method，下拉菜单中显示编辑过的method信息，可进行method选择，点击new新建或在列表中选择一个已有的操作方法后点edit编辑。
[0070]
2)根据样品要打断的目的片段的长度设置相关参数。具体参数可参考如下：
[0071]
microtube afa fiber screw
‑
cap
‑
50ul sample
‑
from 150bp to 800bp。
[0072]
target bp(peak)150200250300400450500800peak incident power(w)5050505050505050duty factor20％20％20％20％20％20％20％20％cycles per burst200200200200200200200200treatment time(s)3751751208050403225temperature(℃)2020202020202020sample volume(ul)5050505050505050
[0073]
microtube afa fiber snap
‑
cap
‑
130ul sample
‑
from 150bp to 1500bp。
[0074]
target bp(peak)15020030040050080010001500peak incident power(w)5050505050505050duty factor20％20％20％10％10％5％5％2％cycles per burst200200200200200200200200treatment time(s)350160759060806025temperature(℃)2020202020202020sample volume(ul)130130130130130130130130
[0075]
运行程序
[0076]
在run界面点击“run”按钮，运行程序。
[0077]
关闭软件和机器
[0078]
1)用配套注射器清空水浴；若水盘(drip tray)有水，需倒掉并用吸水纸擦干。
[0079]
2)关闭软件，然后关闭仪器主机，最后关闭电脑。
[0080]
步骤五：打断产物的纯化回收与质控
[0081]
使用亿康磁珠法dna纯化回收试剂(cat.no.yk003)进行dna片段选择性回收。
[0082]
注意：dna片段选择性回收是可选步骤，若起始样本量低于50ng，不建议进行dna片段选择性回收，可参考说明书，直接进行dna片段的纯化。另外构建不同大小的dna文库时，dna片段选择性回收的磁珠使用量不同，具体磁珠用量可参照如下(若使用除亿康以外厂家的磁珠，需自行摸索最佳磁珠用量)。
[0083][0084]
1)产量：纯化前≥25μg，纯化后≥12μg。
[0085]
2)片段大小：纯化前电泳，产物片段80％以上长度在200
‑
300bp范围内。
[0086]
实施例2
[0087]
步骤一：提取基因组dna
[0088]
参考实施例1中步骤一中的基因组dna提取方法。
[0089]
步骤二：cot
‑
1 dna的打断
[0090]
参考实施例1步骤四中打断的方法，将cot
‑
1 dna打断至约30bp小片段(实际打断
产物约80％以上在25bp
‑
35bp范围内)。
[0091]
步骤三：mda扩增反应
[0092]
以基因组dna做模板，打断后的cot
‑
1 dna做引物，进行mda扩增。具体操作步骤参考实施例1中步骤三。最终对mda扩增产物进行纯化定量。
[0093]
采用柱式纯化，推荐康为世纪cw2301m，具体操作详见说明书。利用qubit对mda扩增产物进行定量。
[0094]
步骤四：mda扩增产物片段打断
[0095]
参考实施例1步骤四中打断的方法，对mda扩增产物进行片段化。
[0096]
步骤五：打断产物的纯化回收与质控。
[0097]
使用亿康磁珠法dna纯化回收试剂(cat.no.yk003)进行dna片段选择性回收。利用qubit对回收产物进行定量。
[0098]
实施例3
[0099]
本实施例对上面实施例的两种方法制备的封闭试剂效果进行验证：
[0100]
靶向文库的制备与测序：
[0101]
1.dna提取:采用康为世纪固定组织基因组dna提取试剂盒提取ffpe样本基因组dna。具体操作参考说明书。
[0102]
2.文库构建：采用康为世纪ngs fast dna library prep set for illumina进行二代测序文库的构建，具体操作参考说明书进行。
[0103]
3.文库的杂交、捕获和洗脱。
[0104]
取构建好的同一文库3个1ug于新的离心管中，l1采用实施例1中制备的封闭试剂进行封闭，l2采用实施例2中制备的封闭试剂进行封闭，l3采用cot1 dna进行封闭，其余成分的添加如下所示：
[0105]
试剂用量文库1ug重复序列封闭试剂/cot1 dna5ul通用封闭序列1ul
[0106]
采用真空浓缩仪进行浓缩。对于每个浓缩后的文库，按照加入如下其余成分。
[0107]
试剂体积(ul)2x hybridization buffer8.5hybridization buffer enhancer2.7无核酸酶水1.8
[0108]
轻轻涡旋混匀后室温放置5min，转移至新的pcr管中，pcr仪上95℃孵育10min(热盖温度105℃)取出后立即加入4ul的捕获探针，50℃过夜孵育。
[0109]
洗脱：采用idt的洗脱试剂和方法进行洗脱。
[0110]
4.pcr扩增纯化后产物ngs上机测序。
[0111]
按照如下试剂进行pcr体系的配制：
[0112]
试剂体积洗脱后dna文库30μl
pcr buffer18μlpcr primer(25μm,for ilm)1μlpcr polymerase1μl总体积50ul
[0113]
配制好pcr反应体系放入pcr仪中进行扩增，反应程序如下：
[0114][0115]
pcr反应结束后采用1x agencourt ampure xp磁珠纯化、25μl nuclease
‑
free water洗脱.(文库浓度约在1
‑
20ng/μl)，取3个捕获后的文库进行illumina上机测序，测序数据量为200m。数据分析结果如下。
[0116]
文库名数据量捕获效率目标区有效深度l1200m85％1950xl2200m80％2103xl3200m79％2040x
[0117]
相同的样本，相同的捕获操作，最终采用该专利方法制备的封闭试剂效果可以与市售的cot1 dna的的封闭效率接近。证实该两种制备方法可行。
[0118]
以上所述仅是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。