玉米抗旱标记DRESH8及其应用

玉米抗旱标记dresh8及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种玉米抗旱标记dresh8及其应用。


背景技术：

2.玉米是我国主要粮食作物之一，多种植于我国的干旱和半干旱地区。近年来极端气候频发，玉米主要产区常出现大面积干旱造成严重的减产，制约我国农业发展，威胁农民利益和国家粮食安全。通过分子生物学手段解析玉米抗旱机理，利用遗传学手段进行玉米品种的培育和改良，可以提高玉米的耐旱性，保证干旱胁迫下玉米的稳产和高产。
3.植物营固着生长无法规避不利环境，因此在进化过程中产生了复杂的环境应答机制。植物可以通过感受脱落酸等信号分子，调节体内干旱应答转录因子的表达水平，进而调控下游基因参与干旱应答。植物中存在大量的单链小rna(srna)分子，大量研究表明这些srna广泛参与到植物的干旱应答过程中。如srna中的mir169可以调控nf
‑
ya基因的表达水平影响植物的耐旱性，在水稻中过量表达os
‑
mir408可以提高植株的抗旱性，同时研究表明srna还广泛参与植物的生长发育及开花结实。反向重复序列是产生srna的主要结构之一，因此反向重复序列在植物抗旱育种的培育中有着潜在的应用价值。
4.玉米的产量其生产关系到国家粮食安全和社会稳定。干旱是影响玉米生长发育的主要逆境因素，提升玉米的抗旱性是玉米育种迫切需要解决的问题，因此筛选干旱相关基因分子标记的可以有效提高选育抗旱玉米品种的效率


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供了一种玉米抗旱标记dresh8其应用，及该标记主要包含长度约20kb的反向重复片段。该标记的存在将显著降低玉米植株的抗旱性，其作用机制为通过产生大量sirna，介导干旱应答相关的靶标基因的表达水平，进而参与干旱应答。
6.为实现上述目的，本发明所设计一种玉米抗旱标记dresh8，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.上述dresh8全长为21395bp的dna序列；应当明确的是，dresh8区间可以形成大量srna，本领域技术人员有能力根据本发明说明书公开文本中的内容判断dresh8位点及产生srna表达水平对玉米抗旱能力强弱的影响，因此该判断方法并不仅限于pcr方法，还包括其他的针对该位点产生srna表达水平的检测方法等。
8.进一步地，所述抗旱标记dresh8在玉米自交系b73的物理位置为8号染色体的139987478至140008873区间。
9.本发明还提供了一种上述玉米抗旱标记dresh8在改良玉米抗旱性和辅助育种中的应用。
10.本发明还提供了一种引物对在鉴定抗旱玉米品种中的应用，所述引物对：
11.f1：5
’‑
ctgttctcatgttctgtagcatgg
‑3’
，
12.r1：5
’‑
aatccaagtgtggcacaagaac
‑3’
；
13.f2：5
’‑
tgttagctggctctgagcaagaac
‑3’
，
14.r2：5
’‑
accctcgtcgcacaacgacc
‑3’
。
15.本发明还提供了一种鉴定抗旱玉米品种的方法，包括以下步骤：
16.1)提取待检测玉米品种的dna；
17.2)设计两对引物对，引物对如下：
18.f1：5
’‑
ctgttctcatgttctgtagcatgg
‑3’
，
19.r1：5
’‑
aatccaagtgtggcacaagaac
‑3’
；
20.f2：5
’‑
tgttagctggctctgagcaagaac
‑3’
，
21.r2：5
’‑
accctcgtcgcacaacgacc
‑3’
；
22.3)以上述dna为模板进行pcr扩增；
23.4)电泳：
24.当一对引物f1物r1扩增出现目的条带，且一对引物f2和r2无法扩增出目的条带时，说明该玉米品种不含标记dresh8，说明该品种抗旱性强；
25.或者，当一对引物f1物r1无法扩增出目的条带，且一对引物f2和r2引物扩增出现目的条带时，说明该玉米品种含有标记dresh8，则说明该品种抗旱性弱。
26.本发明的有益效果：
27.本发明通过eqtl发现在玉米中存在一个长约21kb的反向重复序列，当它存在时会显著降低植物在逆境下的抗旱性，通过深入的生信分析以及分子机制研究发现，该位点是由于产生大量的small rna(srna)靶标降解下游抗旱基因导致的。这一研究发现dresh8作为一个显著的玉米干旱分子标记，对推动玉米抗旱育种进程具有重要的理论和实践意义。
附图说明
28.图1为玉米crispr
‑
ddresh8载体pcpb
‑
zmubi
‑
hspcas9构建示意图(通用载体图谱，无中文注释)；
29.图2为crispr
‑
ddresh8敲除玉米株系基因型鉴定图；
30.图3为ddresh8材料的抗旱性检测；
31.图4为检测dresh8位点对srna表达水平的影响；
32.图5为dresh8
‑
srna通过转录后水平基因沉默调控干旱应答基因zmmybr38的表达；
33.图6为关联群体及f2群体中dresh8位点的基因型鉴定；
34.图7为关联群体及f2群体中dresh8位点的自然变异影响玉米的抗旱性。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
36.实施例1
37.对玉米关联群体自交系在干旱和对照下的small rna测序数据进行分析，发现位于八号染色体140mb区间处(在玉米自交系b73的物理位置为8号染色体的139987478至140008873区间)存在一个与大量干旱应答small rna表达水平显著相关的eqtl热点区间，将该区间命名为抗旱标记dresh8，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
38.实施例2玉米crispr
‑
ddresh8载体构建
39.以pcpb
‑
zmubi
‑
hspcas9载体为基础，通过同源重组将u6启动子，grna和sgrna骨架通过重叠pcr所得的片段插入pcpb
‑
zmubi
‑
hspcas9载体中(图1)。电泳检测及测序分析表明我们成功得到了玉米crispr
‑
ddresh8载体，具体实验步骤如下：
40.1.u61启动子扩增
41.根据u6启动子序列设计一对引物进行pcr扩增，引物序列如下：
42.u6
‑
f：5
’‑
tgcactgcacaagctgctgtttttgttagccccatcg
‑3’
，
43.u6
‑
r：5
’‑
aattcggtgcttgcggctc
‑3’
；
44.使用vazyme phanta max super
‑
fidelity dna polymerase进行基因扩增，得到u6启动子序列，其反应体系如下(总体积20ul)：
45.2x phanta buffer10uldntp0.4ulu6
‑
f0.8ulu6
‑
r0.8ulphanta max0.4ubackbone1.5ulddh2o6.9ul
46.注：backbone为同时含有u6启动子序列和sgrna序列的模板质粒(来源于网上已公开论文,doi:10.1105/tpc.19.00934)。
47.2.grna
‑
sgrna的扩增
48.grna1
‑
f：5
’‑
gaacatggtaattgtaaacga
‑3’
，
49.grna2
‑
f：5
’‑
gcttgcaggaaccatgccatg
‑3’
，
50.grr1：5
’‑
ggccagtgccaagcttaaaaaaagcaccgactcg
‑3’
；
51.使用vazyme phanta max super
‑
fidelity dna polymerase进行基因扩增，得到连有sgrna骨架的grna序列即grna
‑
sgrna，其反应体系如下(总体积20ul)：
52.2x phanta buffer10uldntp0.4ulgrna1
‑
f/grna2
‑
f0.8ulgrr10.8ulphanta max0.4ulbackbone1.5ulddh2o6.9ul
53.3.重叠pcr获得u6启动子、grna
‑
sgrna
54.使用vazyme phanta max super
‑
fidelity dna polymerase进行基因扩增，得到含有u6启动子的grna
‑
sgrna序列即u6
‑
grna1
‑
sgrna和u6
‑
grna2
‑
sgrna，其反应体系如下(总体积20ul)：
55.2x phanta buffer10uldntp0.4ul
grna1
‑
f/grna2
‑
f0.8ulgrr10.8ulphanta max0.4ul模板一(u6启动子)1.5ul模板二(grna
‑
sgrna)1.5ulddh2o5.4ul
56.反应程序为：95℃3min；95℃15s；60℃30s；72℃60s；72℃5min；35循环。
57.4.线性化载体制备：使用限制性内切酶hindiii单酶切pcpb
‑
zmubi
‑
hspcas9载体，使环状载体线性化；
58.5.u6
‑
grna1
‑
sgrna和u6
‑
grna2
‑
sgrna与载体酶切产物的检测与回收：琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物与载体酶切产物，使用omega bio
‑
tek gel extraction kit回收目的片段；
59.6.胶回收产物重组：使用vazyme clonexpress ii one step cloning kit进行同源重组，反应体系如下：
60.线性化载体200ng插入片段24ng5x ce ii buffer4ulexnase ii2ulddh2oto 20ul
61.使用移液器轻轻吸打混匀，经短暂离心后将反应液收集至离心管管底；37℃水浴30min，放置冰上静置至室温；
62.7.重组产物转化：重组产物转化dh5α感受态细胞，参照分子克隆实验指南；
63.8.测序鉴定：经菌落pcr，质粒pcr,测序分析表明得到了连有grna1的中间载体；
64.9.重复步骤6至步骤8，进一步连接u6
‑
grna2
‑
sgrna至中间载体，得到最终载体，即为crispr
‑
ddresh8载体。检测涉及pcr及测序引物为：
65.cas9
‑
f：5
’‑
agataaactgcacttcaaacaagt
‑3’
，
66.cas9
‑
r：5
’‑
attaagttgggtaacgccagg
‑3’
。
67.实施例2：crispr
‑
ddresh8敲除玉米株系获得及检测
68.将实施例1构好的玉米crispr
‑
ddresh8载体送至江苏未米生物科技有限公司转化，转化用背景自交系材料为b104，获得的t0代及后代植株进行基因型鉴定，筛选得到dresh8位点被敲除的纯合子(即为ddresh8植株)(图2)；其中，鉴定引物及反应体系如下：
69.f1：5
’‑
ctgttctcatgttctgtagcatgg
‑3’
，
70.r1：5
’‑
aatccaagtgtggcacaagaac
‑3’
；
71.f2：5
’‑
tgttagctggctctgagcaagaac
‑3’
，
72.r2：5
’‑
accctcgtcgcacaacgacc
‑3’
；
73.pcr体积15ul：
74.dna100ng2xtaq7.5ulf1/f20.3ul
r1/r20.3uladd ddh2ot o15ul
75.反应程序为：95℃3min；95℃15s；57℃30s；72℃60s；72℃5min；35循环。
76.实施例3 crispr
‑
ddresh8玉米材料的抗旱表型检测
77.将ddresh8植株和野生型玉米材料同时种植在30cm
×
40cm
×
15cm规格的方盒中，左右对半种植。植株生长于温度为28℃的温室中，在正常状态下生长至四叶期时停止浇水进行干旱处理。干旱处理10天后植物呈现明显的萎蔫状态时进行复水，复水7天后统计每个方盒中阳性转基因材料和阴性分离材料的植株存活率。
78.结果表明：ddresh8植株存活率显著高于阴性分离材料，说明dresh8位点敲除的材料具有更强的抵抗干旱胁迫能力(图3)。
79.实施例4关联群体及crispr
‑
ddresh8玉米植株中srna表达量检测
80.通过在关联群体中检测不同自交系在dresh8位点处的基因型，根据基因型将自交系分为包含dresh8序列的自交系dresh8(+)和不包含dresh8(
‑
)的自交系。比较dresh8(+)和dresh8(
‑
)自交系间的srna表达水平，
81.结果显示ddresh8材料中比对至dresh8区间内的srna表达水平显著降低(图4)。
82.分别在花盆中种植ddresh8植株及野生型玉米材料，三叶期前对照和干旱组材料均正常浇水，三叶期后对照组正常浇水，干旱组停止浇水。等干旱组的ddresh8和野生型材料出现明显萎蔫时对干旱和对照组同时取样，取样部位为最上展开叶。利用trizol法对样品总rna进行提取，并交由华大公司进行srna测序。比较ddresh8和野生型材料中比对至dresh8区间内srna的表达水平，结果表明野生型材料中比对至该区间的srna在干旱处理下的表达水平显著高于对照组，而ddresh8材料中比对至dresh8区间内srna的表达水平在干旱和对照下均显著低于野生型。
83.以上结果表明dresh8是玉米中一个产生srna的重要位点。
84.实施例5 dresh8
‑
srna对干旱应答基因zmmybr38的调控
85.利用网站预测dresh8
‑
srna的潜在靶标基因序列，并通过5
’‑
race实验验证dresh8
‑
srna对靶标基因的调控功能，5
’‑
race的操作步骤如下：
86.通过重叠pcr将srna整合到mir172骨架序列中，将整个片段通过同源重组的方法构建到phtlic1.0载体上，过表达srna。srna的靶标序列直接合成并在5’端和3’端分别加上xhoi和xbai酶切位点通过酶切酶连的方式将靶标序列插入到含有gfp的pms4载体上，插入的靶标序列位于gfp的5’端。然后将相关质粒转入gv3101中，注射烟草后弱光条件下培养48小时，剪取烟草叶片用trizol法抽提总rna。随后总rna用oligo d(t)25磁珠(new england biolabs)进行mrna富集，再利用t4 rna连接酶(new england biolabs)将特异性的接头添加到mrna的5’端。以此mrna为模板利用m
‑
mlv反转录酶合成cdna，反转录所用的引物通过重叠pcr扩增目的片段。用t4 dna连接酶将测序接头连接到pcr产物的5’端和3’端。通过pcr扩增对以上pcr产物进行富，跑胶，切割条带在200bp
‑
500bp范围内的片段，送至诺禾致源进行测序。
[0087]5’‑
race的结果表明：dresh8
‑
srna可以通过转录后水平基因沉默途径调控干旱应答基因zmmybr38的表达水平，同时通过qpcr测定ddresh8和野生型材料中zmmybr38的表达水平，发现ddresh8材料中zmmybr38的表达量相较于野生型显著上升也进一步证实了这一
点(图5)。
[0088]
实施例6玉米dresh8标记的基因型鉴定
[0089]
参照实施例2中给出的两队引物f1、r1和f2、r2，分别对玉米基因组dna进行扩增。若玉米为包含dresh8标记的材料，f2和r2扩增到特异条带，f1和r1不会扩增到特异条带。若玉米为不含dresh8的纯合基因型材料，f2和r2不会扩增出特异条带，f1和r1会扩增到特异条带。若dresh8区间为杂合状态，则f1和r1，f2和r2均能扩增出特异条带(图6)。
[0090]
使用引物信息如下：
[0091]
f1：5
’‑
ctgttctcatgttctgtagcatgg
‑3’
，
[0092]
r1：5
’‑
aatccaagtgtggcacaagaac
‑3’
；
[0093]
f2：5
’‑
tgttagctggctctgagcaagaac
‑3’
，
[0094]
r2：5
’‑
accctcgtcgcacaacgacc
‑3’
；
[0095]
实施例7 dresh8标记玉米材料的抗旱表型检测
[0096]
通过在关联群体中检测不同自交系在dresh8位点处的基因型，根据基因型将自交系分为包含dresh8序列的自交系dresh8(+)和不包含dresh8(
‑
)的自交系。比较dresh8(+)和dresh8(
‑
)自交系间的存活率差异表明包含dresh8的自交系存活率。
[0097]
利用包含dresh8位点的自交系cimbl144同不包含dresh8位点的自交系cimbl70，cimbl17分别进行杂交，并将得到的杂交f1材料进一步自交得到f2材料，对f2材料在干旱复水后的存活率进行统计；
[0098]
结果表明：不含有dresh8标记的材料存活率显著高于包含dresh8位点的材料，说明dresh8位点可以作为标记用于玉米材料抗旱性的选择(图7)。
[0099]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。