一种非变性II型胶原蛋白的制备方法与流程

一种非变性ii型胶原蛋白的制备方法
技术领域
1.本发明公开的是一种从动物软骨中提取胶原蛋白的方法，涉及食品生物技术领域，尤其涉及一种非变性ii型胶原蛋白的制备方法。


背景技术：

2.胶原蛋白是一种广泛分布于哺乳动物体内的结构性蛋白，是构成皮肤、骨骼和关节等组织的重要组成部分，同时也是多细胞动物细胞外基质的主要成分之一。目前已知的胶原蛋白种类已有二十余种，根据组织分类可分为间隙胶原蛋白、基膜胶原蛋白和软骨胶原蛋白三大类，其中ii型胶原蛋白主要分布于关节软骨中，少量存在于玻璃体、胚胎角膜等部位。
3.ii型胶原蛋白是由三股缠绕的多肽链组成，由于其具备稳定的三螺旋结构，因此，在体内主要起到支撑器官、保护机体的作用。近年来的研究表明，ii型胶原蛋白因其可作为关节的结构和功能性营养素，具有低免疫原性和生物相容性好等特点
1.，受到消费者的广泛关注。
4.目前市售的ii型胶原蛋白产品，多为完全酶解的胶原蛋白产品。由于提取工艺和制剂工艺的局限，在酶、高温等因素作用下，ii型胶原蛋白丧失原有的三螺旋结构，胶原蛋白被分解为20,000道尔顿以下的多肽和氨基酸，失去原有对类风湿关节炎和关节炎的预防及辅助治疗功能
2.。
5.目前，国内外已公开多种非变性ii型胶原蛋白的制备工艺，例如cn106916870a公开的一种含非变性ii型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，通过脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥等步骤；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的ph调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％～2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h。李洁，朱大开和龚辉（李洁, 朱大开, 龚辉. 非变性ⅱ型胶原蛋白生产方法.），采用胃蛋白酶先对软骨除杂24h，再进行酶解提取24h得到可溶性非变性ii型胶原蛋白。us7083820公开的一种生物活性产品的生产方法，鸡胸骨通过清洗、消毒、切碎、混合（无机盐）、干燥等步骤，其中上述所述步骤是在110℉以下操作，得到不改变生物活性产品原始结构的ii型胶原蛋白。
6.但已公开的技术方法及制备的非变性ii型胶原蛋白依然存在问题：一产品在溶液中悬浮性能差，易分层；二是产品制备提取经过蛋白酶或酶提取原料进行长时间的充分水解，非变性ii胶原蛋白含量较低，且提取时间长，不利于工业生产推广。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种非变性ii型胶原蛋白的制备方法，旨在解决上述问题中的一个或多个问题。
8.具体技术方案如下：本发明提供了一种非变性ii型胶原蛋白的制备方法，它的特征是依次包括以下步
骤：（1）选材：所选原料为新鲜鸡胸软骨，手工剔除脂肪和肌肉后，切取距离鸡胸软骨尖端3厘米以内部分备用；（2）清洗：使用温度不高于37℃的清水清洗步骤（1）中切取备用的软骨；（3）粉碎：将步骤（2）中经清洗的软骨沥干后，使用粉碎机将软骨粉碎为2 mm以下的软骨颗粒；（4）酶解：向步骤（3）所得软骨颗粒中加水，加水量为软骨颗粒质量的0.5~3倍（m/v），使用酸液或碱液调节料液ph值在2.0~4.0之间，加入软骨颗粒重量1.0~5.0%的胃蛋白酶，酶解温度不超过37℃，搅拌并酶解0.5~2.0 h；酶解结束后，使用碱液调节ph值至8.5~9.5，静置15~60 min；（5）过滤：使用20 ~ 60目筛过滤步骤（4）中的酶解液，收集筛上物；（6）干燥：将筛上物进行真空干燥或冷冻干燥，干燥后获得干燥品；（7）粉碎：将干燥品进行粉碎，经60~200目筛网过筛，取筛下物，得非变性ii型胶原蛋白粉末。
9.本发明的上述方案中，首先通过对原料进行选择，选取鸡胸软骨，并选择距离骨尖端3厘米以内，结合对工艺的改进，尤其是酶解步骤的改进，可以获得蛋白含量大于15%的非变性ii型胶原蛋白。而且提取过程快速、简便：总提取时间不超过4 h。
10.更加优选，原料选用鸡胸软骨尖端1.5厘米以内。
11.作为优选，所述胃蛋白酶通过负载载体加入，所述负载载体为食品级二氧化硅。本方案中，胃蛋白酶通过负载载体的形式加入，能够有效控制酶解程度，结合胃蛋白酶的浓度以及酶解时间，得到的非变性ii胶原蛋白含量高。
12.作为优选，所述胃蛋白酶与所述负载载体的添加比例为0.3~0.6：15。
13.作为优选，步骤（4）中在软骨颗粒中加水后，先进行打浆，再使用酸液或碱液调节料液ph值在2.0~4.0之间。
14.作为优选，打浆温度控制在25℃以下。
15.作为优选，步骤（2）中清洗次数为1~3次，每次10 ~15min。
16.作为优选，酶解温度为30℃~32℃。
17.通过本发明的提取方法获得非变性ii型胶原蛋白。
18.与现有技术相比，本发明的优点在于：（1）提取过程快速、简便：总提取时间不超过4 h，与现有技术24 h以上的长时间提取相比，制备时间明显缩短；（2）非变性ii型胶原蛋白含量高，产品性能好：通过本发明所述方法制备的非变性ii型胶原蛋白，非变性ii型胶原蛋白含量大于15%，在水溶液中吸水倍数为10~12倍，体积膨胀率为5~7倍；（3）在水溶液中悬浮性能好，不易分层，除可应用于硬胶囊、片剂外，还适合软胶囊、固体饮料、凝胶糖果等剂型。
附图说明
19.图1为本发明从动物软骨中提取的非变性ii型胶原蛋白，在透射电镜下的天然胶
原蛋白特征性、规律性横纹组织图片。
具体实施方式
20.下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
21.实施例1（1）选材：选择新鲜鸡胸骨，手工剔去脂肪和肌肉后，切取距离尖端1 cm以内部位的软骨1.0kg；（2）清洗：使用不高于37℃的清水清洗1~3次，每次10 min；沥干；（3）粉碎：将步骤（2）中经清洗的软骨沥干后，使用粉碎机将软骨粉碎为2 mm以下的软骨颗粒；（4）酶解：将步骤（3）所得软骨颗粒投入反应罐，加入1 l清水，温度控制在35℃，使用酸液或碱液调节料液ph值在3.0~4.0之间，加入20 g胃蛋白酶，搅拌并酶解2.0 h；酶解结束后，使用碱液调节ph值至9.0，静置30 min；（5）过滤：使用40目筛过滤步骤（4）中的酶解液，收集筛上物；（6）干燥：将筛上物进行冷冻干燥，干燥后获得干燥品s1，共计91.6 g。；（7）粉碎：将干燥品进行粉碎，经100目标准筛过筛，取筛下物。
22.采用《卫生部药品标准生化药品》89年版第一册氨基己糖法检测糖胺聚糖，糖胺聚糖含量为22.3%（以硫酸软骨素计，系数按2.82计）；采用gb 5009.5的方法检测，总蛋白质含量为79.1%（蛋白质折算系数按5.79计）；采用gb/t 9695.23的方法检测，羟脯氨酸含量6.8%；采用elisa试剂盒检测非变性ii型胶原蛋白含量为21.88%。
23.吸水倍数检测：称取上述筛下物20 g至带刻度的量入式量筒中，加入纯化水至样品全部湿润呈胶状，产品体积由42 ml迅速膨胀至260 ml，体积膨胀6.2倍，使用定量滤纸过滤除去自由水，湿润后产品质量为276.1 g，吸水256.1 g，为产品自身重的12.8倍。
24.悬浮能力测试：取上述筛下物20 g，用纯化水配制成5%（w/v）液体，静置2 h，未分层。
25.实施例2（1）选材：选择新鲜鸡胸骨，手工剔去脂肪和肌肉后，切取距离尖端2~3 cm以内部位的软骨1.0 kg；（2）清洗：使用不高于37℃的清水清洗1~3次，每次10 min；沥干；（3）粉碎：将步骤（2）中经清洗的软骨沥干后，使用粉碎机将软骨粉碎为2 mm以下的软骨颗粒；（4）酶解：将步骤（3）所得软骨颗粒投入反应罐，加入1 l清水，温度控制在35 ℃，使用酸液或碱液调节料液ph值在3.0~4.0之间，加入30 g胃蛋白酶，搅拌并酶解2.0 h；酶解结束后，使用碱液调节ph值至9.0，静置30 min；（5）过滤：使用40目筛过滤步骤（4）中的酶解液，收集筛上物；（6）干燥：将筛上物进行冷冻干燥，干燥后获得干燥品s2，共计81.5 g；（7）粉碎：将干燥品进行粉碎，经100目标准筛过筛，取筛下物。
26.采用《卫生部药品标准生化药品》89年版第一册氨基己糖法检测糖胺聚糖，糖胺聚糖含量为28.9%（以硫酸软骨素计，系数按2.82计）；采用gb 5009.5的方法检测，总蛋白质含量为70.3%（蛋白质折算系数按5.79计）；采用gb/t 9695.23的方法检测，羟脯氨酸含量5.2 %；采用elisa试剂盒检测非变性ii型胶原蛋白含量为16.77%。
27.吸水倍数检测：称取上述筛下物20 g至带刻度的量入式量筒中，加入纯化水至样品全部湿润呈胶状，产品体积由39 ml迅速膨胀至200 ml，体积膨胀5.1倍，使用定量滤纸过滤除去自由水，湿润后产品质量为252.2 g，吸水232.2 g，为产品自身重的11.6倍。
28.悬浮能力测试：取上述筛下物20 g，用纯化水配制成5%（w/v）液体，静置2 h，未分层。
29.实施例3（1）选材：选择新鲜鸡胸骨，手工剔去脂肪和肌肉后，切取距离尖端3 cm以内部位的软骨1.0 kg；（2）清洗：使用不高于37℃的清水清洗1~3次，每次10 min；沥干；（3）粉碎：将步骤（2）中经清洗的软骨沥干后，使用粉碎机将软骨粉碎为2 mm以下的软骨颗粒；（4）酶解：将步骤（3）所得软骨颗粒投入反应罐，加入1 l清水，温度控制在35 ℃，使用酸液或碱液调节料液ph值在3.0~4.0之间，加入50 g胃蛋白酶，搅拌并酶解2.0 h；酶解结束后，使用碱液调节ph值至9.0，静置30 min；（5）过滤：使用40目筛过滤步骤（4）中的酶解液，收集筛上物；（6）干燥：将筛上物进行冷冻干燥，干燥后获得干燥品s3，共计90.1 g；（7）粉碎：将干燥品进行粉碎，经100目标准筛过筛，取筛下物。
30.采用《卫生部药品标准生化药品》89年版第一册氨基己糖法检测糖胺聚糖，糖胺聚糖含量为25.2%（以硫酸软骨素计，系数按2.82计）；采用gb 5009.5的方法检测，总蛋白质含量为74.5%（蛋白质折算系数按5.79计）；采用gb/t 9695.23的方法检测，羟脯氨酸含量5.9 %；采用elisa试剂盒检测非变性ii型胶原蛋白含量为18.81%。
31.吸水倍数检测：称取上述产品20 g至带刻度的量入式量筒中，加入纯化水至样品全部湿润呈胶状，产品体积由40 ml迅速膨胀至212 ml，体积膨胀5.3倍，使用定量滤纸过滤除去自由水，湿润后产品质量为266.1 g，吸水246.1 g，为产品自身重的12.3倍。
32.悬浮能力测试：取上述产品20 g，用纯化水配制成5%（w/v）液体，静置2 h，未分层。
33.实施例4（1）选材：选择新鲜鸡胸骨，手工剔去脂肪和肌肉后，切取距离尖端3 cm以内部位的软骨1.0 kg；（2）清洗：使用不高于37℃的清水清洗1~3次，每次10 min；沥干；（3）粉碎：将步骤（2）中经清洗的软骨沥干后，使用粉碎机将软骨粉碎为2 mm以下的软骨颗粒；（4）酶解：将步骤（3）所得软骨颗粒加入1 l清水，25℃以下打浆，浆液投入反应罐，温度控制在35 ℃，使用酸液或碱液调节料液ph值在3.0~4.0之间，加入负载胃蛋白酶的食品级二氧化硅，胃蛋白酶10 g，食品级二氧化硅500g，搅拌并酶解2.0 h；酶解结束后，使用碱液调节ph值至9.0，静置30 min；
（5）过滤：使用40目筛过滤步骤（4）中的酶解液，收集筛上物；（6）干燥：将筛上物进行冷冻干燥，干燥后获得干燥品s3，共计86.2g；（7）粉碎：将干燥品进行粉碎，经100目标准筛过筛，取筛下物。
34.采用《卫生部药品标准生化药品》89年版第一册氨基己糖法检测糖胺聚糖，糖胺聚糖含量为24.8%（以硫酸软骨素计，系数按2.82计）；采用gb 5009.5的方法检测，总蛋白质含量为75.1%（蛋白质折算系数按5.79计）；采用gb/t 9695.23的方法检测，羟脯氨酸含量5.9 %；采用elisa试剂盒检测非变性ii型胶原蛋白含量为23.2%。
35.吸水倍数检测：称取上述产品20 g至带刻度的量入式量筒中，加入纯化水至样品全部湿润呈胶状，产品体积由40 ml迅速膨胀至256 ml，体积膨胀6.4倍，使用定量滤纸过滤除去自由水，湿润后产品质量为278.2 g，吸水258.2 g，为产品自身重的12.9倍。
36.悬浮能力测试：取上述产品20 g，用纯化水配制成5%（w/v）液体，静置2 h，未分层。
37.实施例5（1）选材：选择新鲜鸡胸骨，手工剔去脂肪和肌肉后，切取距离尖端3 cm以内部位的软骨1.0 kg；（2）清洗：使用不高于37℃的清水清洗1~3次，每次10 min；沥干；（3）粉碎：将步骤（2）中经清洗的软骨沥干后，使用粉碎机将软骨粉碎为2 mm以下的软骨颗粒；（4）酶解：将步骤（3）所得软骨颗粒加入1 l清水，25℃以下打浆，浆液投入反应罐，温度控制在35 ℃，使用酸液或碱液调节料液ph值在3.0~4.0之间，加入负载胃蛋白酶的食品级二氧化硅，胃蛋白酶20 g，食品级二氧化硅500g，搅拌并酶解2.0 h；酶解结束后，使用碱液调节ph值至9.0，静置30 min；（5）过滤：使用40目筛过滤步骤（4）中的酶解液，收集筛上物；（6）干燥：将筛上物进行冷冻干燥，干燥后获得干燥品s3，共计86.2g；（7）粉碎：将干燥品进行粉碎，经100目标准筛过筛，取筛下物。
38.采用《卫生部药品标准生化药品》89年版第一册氨基己糖法检测糖胺聚糖，糖胺聚糖含量为25.0%（以硫酸软骨素计，系数按2.82计）；采用gb 5009.5的方法检测，总蛋白质含量为75.1%（蛋白质折算系数按5.79计）；采用gb/t 9695.23的方法检测，羟脯氨酸含量5.8 %；采用elisa试剂盒检测非变性ii型胶原蛋白含量为23.5%。
39.吸水倍数检测：称取上述产品20 g至带刻度的量入式量筒中，加入纯化水至样品全部湿润呈胶状，产品体积由40 ml迅速膨胀至260ml，体积膨胀6.5倍，使用定量滤纸过滤除去自由水，湿润后产品质量为282g，吸水262 g，为产品自身重的13.1倍。
40.悬浮能力测试：取上述产品20 g，用纯化水配制成5%（w/v）液体，静置2 h，未分层。
41.比较例1（1）选材：选择新鲜鸡胸骨，手工剔去脂肪和肌肉后，切取距离尖端3 cm以外部位的软骨1.0 kg；（2）清洗：使用不高于37℃的清水清洗1~3次，每次10 min；沥干；（3）粉碎：将步骤（2）中经清洗的软骨沥干后，使用粉碎机将软骨粉碎为2 mm以下的软骨颗粒；（4）酶解：将步骤（3）所得软骨颗粒投入反应罐，加入1 l清水，温度控制在35 ℃，
使用酸液或碱液调节料液ph值在3.0~4.0之间，加入20 g胃蛋白酶，搅拌并酶解2.0 h；酶解结束后，使用碱液调节ph值至9.0，静置30 min；（5）过滤：使用40目筛过滤步骤（4）中的酶解液，收集筛上物；（6）干燥：将筛上物进行冷冻干燥，干燥后获得干燥品d1，共计90.1 g；（7）粉碎：将干燥品进行粉碎，经100目标准筛过筛，取筛下物。
42.采用《卫生部药品标准生化药品》89年版第一册氨基己糖法检测糖胺聚糖，糖胺聚糖含量为33.1%（以硫酸软骨素计，系数按2.82计）；采用gb 5009.5的方法检测，总蛋白质含量为64.2%（蛋白质折算系数按5.79计）；采用gb/t 9695.23的方法检测，羟脯氨酸含量4.1 %；采用elisa试剂盒检测非变性ii型胶原蛋白含量为6.71%。
43.吸水倍数检测：称取上述产品20 g至带刻度的量入式量筒中，加入纯化水至样品全部湿润呈胶状，产品体积由38 ml迅速膨胀至156 ml，体积膨胀4.1倍，使用定量滤纸过滤除去自由水，湿润后产品质量为208.1 g，吸水188.1 g，为产品自身重的9.4倍。
44.悬浮能力测试：取上述产品20 g，用纯化水配制成5%（w/v）液体，静置0.5 h，悬浮液开始分层，静置1.25 h，悬浮液呈1:1分层。
45.比较例2（1）选材：选择1.0 kg新鲜鸡胸骨，手工剔去脂肪和肌肉；（2）清洗：使用不高于37℃的清水清洗1~3次，每次10 min；沥干；（3）粉碎：将步骤（2）中经清洗的软骨沥干后，使用粉碎机将软骨粉碎为2 mm以下的软骨颗粒；（4）酶解：将步骤（3）所得软骨颗粒投入反应罐，加入1 l清水，温度控制在35 ℃，使用酸液或碱液调节料液ph值在3.0~4.0之间，加入20 g胃蛋白酶，搅拌并酶解2.0 h；酶解结束后，使用碱液调节ph值至9.0，静置30 min；（5）过滤：使用40目筛过滤步骤（4）中的酶解液，收集筛上物；（6）干燥：将筛上物进行冷冻干燥，干燥后获得干燥品d2，共计93.6 g；（7）粉碎：将干燥品进行粉碎，经100目标准筛过筛，取筛下物。
46.采用《卫生部药品标准生化药品》89年版第一册氨基己糖法检测糖胺聚糖，糖胺聚糖含量为30.4%（以硫酸软骨素计，系数按2.82计）；采用gb 5009.5的方法检测，总蛋白质含量为66.2%（蛋白质折算系数按5.79计）；采用gb/t 9695.23的方法检测，羟脯氨酸含量4.7 %；采用elisa试剂盒检测非变性ii型胶原蛋白含量为6.9%。
47.吸水倍数检测：称取上述产品20 g至带刻度的量入式量筒中，加入纯化水至样品全部湿润呈胶状，产品体积由38 ml迅速膨胀至170 ml，体积膨胀4.5倍，使用定量滤纸过滤除去自由水，湿润后产品质量为212.0 g，吸水192.0 g，为产品自身重的9.6倍。
48.悬浮能力测试：取上述产品20 g，用纯化水配制成5%（w/v）液体，静置47 min，悬浮液开始分层，静置65 min，悬浮液呈1:1分层。
49.针对不同取材部位，通过实施例4的方法制备非变性ii型胶原蛋白，其对应的产品性能如表1。
50.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
51.参考文献[1] 刘斌. 巴氏毕赤酵母基因工程菌高密度发酵表达重组人源胶原蛋白[d]. 南京理工大学, 2012.[2] trentham d e . autoimmunity to type ii collagen an experimental model of arthritis.[j]. journal of experimental medicine, 1977, 146(3):857
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