1.本发明了提供了针对活化素受体样激酶1(alk-1)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段对alk-1具备提高的亲和力，能够更为有效地抑制alk-1/tgf-β-1/smadl信号通路，阻断smadl磷酸化及下游转录反应，从而产生抑制肿瘤血管生长的作用。本发明还涉及这些抗体或其抗原结合片段用于抑制肿瘤血管生长相关的治疗用途。
背景技术：
：：2.alk-1(activinreceptor-likekinase-1)，即活化素受体样激酶1，是tgf-β受体家族中的一员，主要表达在血管内皮细胞，与内皮细胞的生长和迁移有关，并在在调控血管发生或修复中具有重要作用。血管生成是一个生理学过程，包括从预先存在的血管和/或循环内皮干细胞形成新的血管。这在生长、发育以及创伤愈合中是一个正常过程。但是，在肿瘤从休眠状态到恶性状态的转变过程中，血管生成也是一个重要步骤。发生疾病例如肿瘤时，机体丧失维持血管生成平衡的能力。新生血管滋生异常组织，破坏正常组织，并且对于某些肿瘤，新生血管允许肿瘤细胞逃逸到循环系统并在其它器官留居(肿瘤转移)。因此，血管生成抑制剂是一类非常有希望的抗肿瘤药物，所述药物靶向抑制该异常过程从而阻断或减缓肿瘤生长。3.通过靶向具有高选择性内皮功能的靶标例如alk-1，可抑制ii型受体的二聚化，并进而阻断smadl磷酸化以及下游的转录反应，从而抑制血管生成。目前已报道抗alk-1单克隆抗体作为血管生成抑制剂的潜力，可参见例如pct国际申请wo2007040912。gt90001是一种结合alk-1的胞外域(ecd)的全人源化igg2单克隆抗体，其通过阻止阻断tgf-β受体，能够产生抑制肿瘤血管生长等作用，影响肿瘤微环境，从而减缓肿瘤进程。但是gt90001的亲和力较低，可能影响药效并提高后续产业化的难度。因此需要开发更为有效的抗alk-1的抗体，从而提供有效的治疗或辅助治疗肿瘤的手段。技术实现要素：4.本发明的抗体5.在一个方面，本发明提供了能够特异性结合活化素受体样激酶1(alk-1)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：6.(i)重链可变区(vh)，其包含seqidnos:1、3-11任一项所示的序列；以及，轻链可变区(vl)，其包含seqidnos:12-18任一项所示的序列；或，7.(ii)重链可变区(vh)，其包含seqidnos:3-11任一项所示的序列；以及，轻链可变区(vl)，其包含seqidnos:2、12-18任一项所示的序列。8.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含seqidno:1所示的序列的vh；以及，包含seqidnos:12-18任一项所示的序列的vl。9.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：10.(a)包含seqidno:1所示的序列的vh；以及，包含seqidno:15所示的序列的vl；或，11.(b)包含seqidno:1所示的序列的vh；以及，包含seqidno:16所示的序列的vl；或，12.(c)包含seqidno:1所示的序列的vh；以及，包含seqidno:18所示的序列的vl。13.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含seqidnos:3-11任一项所示的序列的vh；以及，包含seqidno:2所示的序列的vl。14.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含seqidnos:3-9任一项所示的序列的vh；以及，包含seqidnos:12、13、16-18任一项所示的序列的vl。15.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：16.(a)包含seqidnos:3、4、6、7、9任一项所示的序列的vh；以及，包含seqidno:18所示的序列的vl；或，17.(b)包含seqidnos:3、5、6、9任一项所示的序列的vh；以及，包含seqidno:17所示的序列的vl；或，18.(c)包含seqidnos:3-9任一项所示的序列的vh；以及，包含seqidno:16所示的序列的vl；或，19.(d)包含seqidno:7或8所示的序列的vh；以及，包含seqidno:13所示的序列的vl；或，20.(e)包含seqidno:6所示的序列的vh；以及，包含seqidno:12所示的序列的vl。21.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以进一步包含来源于哺乳动物(例如，人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。22.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(ch)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，23.本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(cl)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。24.在一些实施方案中，所述重链恒定区(ch)的变体与其所源自的序列相比可以具有一个或多个氨基酸的保守置换。在此类实施方案中，所述重链恒定区(ch)的变体与其所源自的野生型序列相比可以具有相同或基本相同的效应子功能。25.在另一些实施方案中，所述重链恒定区(ch)的变体可以包含一个或多个氨基酸突变以改变本发明抗体的下列中的一个或更多个特性：fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能等。可以通过将抗体恒定区中的至少一个氨基酸残基替换为不同残基，产生功能改变，例如，改变抗体对效应子配体(如fcr或补体c1q)的亲和力，从而改变效应子功能(例如降低)。抗体的fc区介导几种重要的效应子功能，例如adcc、吞噬作用、cdc等。26.在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区是人igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。27.在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。在某些实施方案中，所述轻链恒定区是人κ轻链恒定区。28.在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含seqidno:19所示的重链恒定区(ch)；和/或，seqidno:20所示的轻链恒定区(cl)。29.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自igg、igm、ige、igd或iga，例如igg1、igg2、igg3或igg4。30.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自scfv、di-scfv、(scfv)2、fab、fab’、(fab’)2、fv、二硫键连接的fv。31.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的一项或多项：32.(1)特异性结合alk-1(例如人alk-1)(例如其胞外域(ecd))；33.(2)以小于约5nm，例如小于约4.5nm、4nm、3.5nm、3nm、2.5nm、2nm、1.5nm、1nm、0.5nm、0.4nm或更低的kd结合alk-1(例如人alk-1)；优选地，所述kd通过表面等离子共振技术(例如fortebio)测定；34.(3)阻断或抑制smadl磷酸化；35.(4)阻断或抑制alk-1/tgf-β-1/smadl信号通路36.(5)抑制肿瘤血管生成。37.在本文中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。38.抗体的制备39.本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的dna分子。将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。40.本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见morimotoetal.,j.biochem.biophys.methods24:107-117(1992)andbrennanetal.,science229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewedinhudson,curr.opin.immunol.11:548-557(1999)；littleetal.,immunol.today,21:364-370(2000))。比如，fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将fab’片段化学偶联形成f(ab’)2片段(carteretal.,bio/technology,10:163-167(1992))。另外，fv、fab或f(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。41.因此，在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。42.在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的第一核苷酸序列和编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于相同或不同的分离的核酸分子上。当所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于不同的分离的核酸分子上时，本发明所述的分离的核酸分子包含含有所述第一核苷酸序列的第一核酸分子以及含有所述第二核苷酸序列的第二核酸分子。43.在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。44.在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的第一核苷酸序列和编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于相同或不同的载体上。当所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于不同的载体上时，本发明所述的载体包含含有所述第一核苷酸序列的第一载体以及含有所述第二核苷酸序列的第二载体。45.在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一核苷酸序列，和/或编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。46.在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链的第一核苷酸序列，和/或编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。47.在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞)，以及真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞)，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。48.在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。49.药物组合物及治疗用途50.本发明的抗体或其抗原结合片段能够抑制alk-1/tgf-β-1/smadl信号通路，阻断smadl磷酸化及下游转录反应，从而产生抑制肿瘤血管生长的作用。51.因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。52.在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。53.在另一个方面，本发明提供了用于在受试者中抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤生长和/或治疗肿瘤的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物。本发明还涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、分离的核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物在制备用于在受试者中抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移和/或治疗肿瘤的药物中的用途。54.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如抗肿瘤药物，例如免疫检查点抑制剂)联合使用。本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。55.在某些实施方案中，所述肿瘤选自实体瘤，例如肝胆管癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、间皮瘤或尿道癌。56.本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。57.本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物通过静脉注射或推注给予。58.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段。“治疗有效量”涉及治疗试剂的给药剂量，在一定程度上减轻治疗疾病的一种或多种症状。在治疗肿瘤时，治疗有效剂量涉及其剂量至少有以下一种效应：缩小肿瘤体积，抑制(即在一定程度上减缓，更好停止)肿瘤转移，在一定程度上抑制(即在一定程度上减缓，停止更好)肿瘤生长，在一定程度上减轻(或者，更好消除)肿瘤相关的一种或多种症状。59.在本文中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。60.在本文中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。61.术语定义62.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。63.如本文中所使用的，术语“alk-1”(可互换地称为“激活蛋白受体样激酶-1(activinreceptor-likekinase)”)，是指转化生长因子β受体1型(tgf-β-1)的i型细胞表面受体。在本文中，术语“alk-1”指任何天然的或变异的(无论是天然的或合成的)alk-1多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。人alk-1是503个氨基酸的多肽，其包括信号肽(氨基酸：1-21)，n端的细胞外tgf-β-1配体结合结构域或ecd(氨基酸：22-118)，单次跨膜结构域(氨基酸：119-141)，富含甘氨酸/丝氨酸(gs)的调节结构域(氨基酸：142-202)以及c端的丝氨酸-苏氨酸激酶结构域(202-492)。64.如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(lc)和一条重链(hc))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循kabat,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定义。65.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个cdr，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883)或imgt编号系统(lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。66.如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情况下，scfv的vh与vl之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成di-scfv，其指的是两个或两个以上单个scfv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成(scfv)2，其指的是两个或两个以上单个scfv并联而形成抗体。74.上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。75.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。76.在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。77.如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。78.两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见malmqvistm,nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数kd(参见davies等人,annualrevbiochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(spr)在biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或kinexa来测量解离常数。79.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。80.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。81.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。82.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。83.本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology-asynthesis(2ndedition,e.s.golubandd.r.gren,eds.,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。84.如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。85.如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。对于肿瘤，术语“治疗”可以表示癌症患者的预期寿命延长，或者疾病的一种或多种症状减轻。86.如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，“治疗有效剂量”涉及治疗试剂的给药剂量，在一定程度上减轻治疗疾病的一种或多种症状。在治疗肿瘤时，治疗有效剂量涉及其剂量至少有以下一种效应：缩小肿瘤体积，抑制(即在一定程度上减缓，更好停止)肿瘤转移，在一定程度上抑制(即在一定程度上减缓，停止更好)肿瘤生长，在一定程度上减轻(或者，更好消除)肿瘤相关的一种或多种症状。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。87.如本文中所使用的，术语“受试者”可指哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，所述受试者患有肿瘤。88.发明的有益效果89.本发明提供了亲和力优化的抗alk-1抗体，所述抗体能够更为有效地抑制alk-1/tgf-β-1/smadl信号通路，阻断smadl磷酸化及下游转录反应，从而产生抑制肿瘤血管生长的作用。本发明的抗体对肿瘤血管生成具有重要临床价值。90.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明91.图1显示了实施例3中流式检测突变抗体与cho-alk1细胞结合实验。92.图2显示了实施例3中流式检测突变抗体与huvec细胞结合实验。93.图3显示了实施例4中突变抗体对bmp9诱导alk1下游smad1磷酸化的阻断实验。94.序列信息95.本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。96.表1：序列的描述97.98.99.具体实施方式100.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。101.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。102.实施例1：亲和力成熟文库的构建及抗体筛选103.亲和力成熟文库构建104.以合成的gt90001基因为模板，pcr扩增重链可变区(vh)和轻链可变区(vk)，通过同源重组的方法，流程按照商品说明书(vazyme)，构建入酵母表达载体。将构建入酵母表达载体的gt90001重链和轻链同时电转化入酿酒酵母，铺平板，挑克隆并验证，获得正确的gt90001酵母单克隆。同时也将gt90001重链和轻链分别电转化入酿酒酵母，铺平板，挑克隆并验证，分别获得正确的gt90001重链和轻链的酵母单克隆。第一轮pcr，以gt90001vh和vk为模板，利用简并引物进行突变，获得vh和vk的部分片段。第一轮pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收用于第二轮overlappcr扩增。利用pcr纯化试剂盒(购自qiagen)回收目的片段。将线性化的酵母展示载体和第二轮的vh和vkpcr产物混合后分别电转化入gt90001轻链和重链的酵母单克隆中，分别构建重链突变和轻链突变的亲和力成熟文库并测定库容。105.alk-1抗体的筛选106.将上述构建的亲和力成熟文库接种于sd-caa扩增培养基中，培养过夜。取10×库容量的酵母细胞接种于sd-caa诱导培养基中，诱导过夜。取10×库容量的酵母细胞，离心去除培养基。用50ml洗涤缓冲液(pbs+0.5％bsa+2mmedta)重悬酵母细胞，离心去除上清。用10ml洗涤缓冲液重悬酵母细胞。加入生物素标记的alk-1蛋白，室温孵育30min，离心收集酵母细胞，并用50ml洗涤缓冲液洗涤酵母3遍。用5ml洗涤缓冲液重悬酵母细胞，并加入200μlsa磁珠(购自美天旎)，颠倒孵育10min。用洗涤缓冲液洗涤酵母和磁珠混合物3遍，将混合物加入ls柱(购自美天旎)中。将ls柱放在磁力架上，用洗涤缓冲液洗涤去除非特异性结合的酵母细胞。将柱子从磁力架上取出，加入洗涤缓冲液洗脱酵母。洗脱下来的酵母离心后转入20mlsd-caa扩增培养基中进行扩增。将经过macs富集的酵母细胞接种于sd-caa扩增培养基中，培养过夜。用诱导培养基重悬酵母细胞，诱导过夜。加入生物素标记的alk-1抗原，室温孵育20min。加入pbs清洗酵母3遍，加入fitc-anti-c-myc抗体和链霉亲和素apc偶联荧光抗体(购自invitrogen)，4℃避光孵育15min。加入pbs重悬细胞，使用bdfacsaraiiii仪器进行分选获得可与alk-1抗原有较高结合能力的酵母。107.alk-1抗体候选分子抗体基因的调取108.通过macs和facs富集得到的能与alk-1抗原有较高结合能力的酵母菌液，在sd-caa扩增培养基中30℃，225rpm培养过夜，按照酵母质粒抽提试剂盒(购自天根)操作抽提酵母质粒。质粒通过电转化入top10感受态细胞(购自天根)，涂布氨苄抗性和卡那霉素平板，于30℃培养过夜。挑取单克隆测序获得基因序列。109.实施例2：抗体的构建及表达纯化110.抗体基因构建入pcdna3.1表达载体111.将重链突变基因序列和轻链突变基因序列，利用同源重组酶(购自vazyme)分别构建入pcdna3.1-constantheavychain载体(包含seqidno:19所示的重链恒定区序列)和pcdna3.1-constantlightchain载体(包含seqidno:20所示的轻链恒定区序列)中，流程按照商品说明书。同源重组产物化转入top10感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃培养过夜，挑取单克隆测序。112.细胞转染、抗体纯化及alk-1抗体亲和力测定113.采用expi293tm表达系统试剂盒，将质粒转入expi-293细胞中，转染方法如下：根据所需转染体积传代hek293细胞，并在转染前一天将细胞密度调整至2.5-3×106细胞/ml；取待转染的细胞进行计数，并用预热的opm-293cd05medium培养基将细胞密度调整至3×106细胞/ml；取细胞转染体积十分之一的mem培养基作为转染缓冲液，按照1l细胞加入1mg质粒的浓度加入质粒(其中重链与轻链的比例为h:l＝1:1)，混匀，过滤除菌；按质量比pei：质粒＝3:1的比例加入pei，混匀后室温孵育10～20min，将混合物轻柔加入hek293f细胞中，36.5℃，8％co2，130rpm摇床中培养，转染后20-22h加入细胞转染体积5％的奥浦迈profeed补料。细胞培养6天后收集上清。利用蛋白a填料(购自常州天地人和)纯化目的抗体，利用fortebio检测抗体与alk-1(acro，al1-h5227)结合的亲和力。114.fortebio亲和力测定按照现有的方法(estep,p等人，基于溶液的高通量抗体-抗原亲和力和表位分级的测量，mabs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡10min，然后线上检测60s建立基线，在线加载如上所述获得的抗体至ahc传感器上。再将传感器放入100nmalk-1抗原中作用150s，之后将传感器转移至pbs中解离450s。使用1:1结合模型进行动力学的分析。结果如表2所示，有16个突变抗体可以在蛋白水平上和人alk-1结合，且亲和力高于gt90001与alk-1的结合。115.表2：16个突变抗体的单价亲和力116.[0117][0118]交叉配对重链突变和轻链突变的克隆[0119]将可以与alk-1高亲和力结合的重链突变和轻链突变进行两两配对瞬转表达，利用fortebio检测抗体与人alk-1结合的亲和力。单价亲和力范围如表3所示，19个交叉配对突变抗体和人alk-1蛋白有较高亲和力。[0120]表3：19个交叉配对突变抗体的单价亲和力[0121][0122][0123]实施例3：流式检测细胞水平结合实验[0124]通过转染克隆到mcs的编码人alk-1的cdna的pcho1.0载体(invitrogen)产生过表达人alk-1的cho-s细胞(cho-alk-1细胞)。将扩大培养的细胞调整至合适细胞密度加入96孔流式板，对于cho-alk1细胞检测，离心后加入梯度稀释的待测样品，4℃孵育1小时。pbs清洗两次，加入对应稀释至合适浓度的荧光二抗(abcam，ab98596),4℃孵育30min,pbs清洗两次。加入pbs重悬细胞，在cytoflex流式细胞仪上进行检测并计算对应的mfi。对于huvec细胞(atcc)检测，需要先用4％的甲醛溶液对细胞固定，然后离心后加入梯度稀释的待测样品，4℃孵育1小时或者室温孵育2小时。pbs清洗两次，加入对应稀释至合适浓度的荧光二抗,4℃孵育30min或者室温孵育1小时,pbs清洗两次。加入pbs重悬细胞，在cytoflex流式细胞仪上进行检测并计算对应的mfi。结果如图1、2所示，在alk-1表达丰度较高的cho-alk-1细胞中，亲和力成熟后的抗体mut-vk7、mut-vk8、mut-vk12的细胞结合能力至少与亲本抗体gt90001相当；在huvec细胞中，亲和力成熟后的抗体mut-vk7、mut-vk8、mut-vk12的细胞结合能力更是显著优于亲本抗体gt90001。[0125]实施例4：bmp9诱导alk1下游smad1磷酸化阻断实验[0126]huvec细胞接种于96孔板上，104细胞/孔置于含5％fbs和ecg的ecm(sciencell，1001)培养基中。37℃，5％的二氧化碳培养过夜。从细胞培养板中移除培养基，用200μlpbs洗涤两次。加入不含fbs和ecg的ecm100μl，然后饥饿细胞4小时。从细胞培养板中移除培养基，加入100μl梯度稀释的受试品，处理1.5小时，然后在培养基中加入终浓度1μg/mlbmp9(biolegend,553102)处理细胞45分钟。移除培养基，并使用elisa试剂盒(invitrogen，85-86182-11)测定smad1磷酸化水平。结果如图3所示，亲和力成熟后的alk1抗体mut-vk7、mut-vk8、mut-vk12相较于亲本抗体gt90001阻断bmp9诱导的smad1磷酸化的能力大幅提升，从而更为有效地阻断alk-1/tgf-β-1/smadl信号通路，抑制血管生成。[0127]尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12