抗人羟基类固醇17-β脱氢酶13（HSD17B13）兔单克隆抗体及其应用的制作方法

抗人羟基类固醇17
‑
β
脱氢酶13(hsd17b13)兔单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗人羟基类固醇17
‑
β脱氢酶13 (hsd17b13)兔单克隆抗体及其在免疫检测方面应用。


背景技术：

2.17β
‑
羟类固醇脱氢酶(hsd17bs)是一类催化17
‑
酮
‑
和17
‑
羟类固醇之间转化的酶。到目前为止，已经确定了15个hsd17b成员，大部分成员参与调节性激素的生物活性，包括hsd17b1，hsd17b2，hsd17b3、hsd17b5和hsd17b6，其他成员也参与脂肪酸代谢、胆固醇生物合成和体内胆汁酸生成。人类 hsd17b13基因位于第4染色体(4q22.1)，其表达高度局限于肝脏，特别是肝细胞，而不是肝脏的其他细胞类型。人类hsd17b13基因编码一种300个氨基酸的蛋白质，定位于脂滴上，是新的肝脏特异性脂滴(ld)相关蛋白。
3.hsd17b13是一种与非酒精性脂肪性肝病组织学特征相关的肝视黄醇脱氢酶。在非酒精性脂肪肝患者中，hsd17b13表达显著上调，其在肝脏的过度表达促进肝脏的脂质积聚。hsd17b13作为一种肝脏特异性ld蛋白在调节肝脏脂质稳态和脂质代谢中发挥重要作用，可能是一种新的非酒精性脂肪肝(nafld) 及相关肝病治疗的牵引靶点。
4.中国专利关于hsd17b13兔单克隆抗体制备的条目基乎没有，申请公布号 cn 110199032 a涉及hsd17b13蛋白变体及其用途，未提到鼠单克隆抗体或兔单克隆抗体及抗体cdr序列。申请公布号cn 103520724 a介绍了hsd17b13 蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途，并未涉及鼠单克隆抗体或兔单克隆抗体及抗体cdr序列。国际专利申请利用hsd17b13或hsd17b13+monoclonalantibody作为关键词，有关与hsd17b13具有高亲和力和特异性结合的单克隆抗体的专利没有查到，有关检测利用抗hsd17b13兔单克隆抗体otir5c10和 otir13e1制备免疫检测试剂盒也未查到。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供特异性好、亲和力高的抗hsd17b13兔单克隆抗体 otir5c10和otir13e1及其在双抗体夹心elisa或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中的应用，为与hsd17b13相关疾病非酒精性脂肪肝(nafld)提供辅助诊断，也为下一步工程抗体的制备提供基础。
6.所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体otir5c10或兔单克隆抗体otir13e1。
7.所述兔单克隆抗体otir5c10和兔单克隆抗体otir13e1以真核细胞 hek293t表达的全长hsd17b13蛋白为免疫原。通过免疫注射新西兰大白兔，取免疫兔子外周血单核细胞(pmbcs)，分选特异性b细胞培养、筛选并利用分子克隆重组技术获得。
8.所述兔单克隆抗体otir5c10，其轻链可变区(vl)含109aa，其氨基酸序列如seq id no.1所示；所述抗体的重链(vh)含115aa，其氨基酸序列如seqidno.2所示。
9.所述兔单克隆抗体otir5c10，其中vl区域包括3个抗原决定簇：cdr1、 cdr2和
cdr3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa
‑
34aa，52aa
‑
54aa和91aa
‑
99aa。其氨基酸序列分别如seqidno.3
‑
5所示。
10.所述兔单克隆抗体otir5c10，其中vh区域包括3个抗原决定簇：cdr1、cdr2和cdr3，抗原决定簇的区域相应地分别为25aa
‑
32aa，50aa
‑
56aa和93aa
‑
104aa。其氨基酸残基序列分别如seqidno.6
‑
8所示。
11.所述兔单克隆抗体otir13e1，其轻链可变区(vl)含108aa，其氨基酸序列如seqidno.11所示；所述抗体的重链(vh)含116aa，其氨基酸序列如seqidno.12所示。
12.所述兔单克隆抗体otir13e1，其中vl区域包括3个抗原决定簇：cdr1、cdr2和cdr3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa
‑
32aa，50aa
‑
52aa和89aa
‑
98aa。其氨基酸序列分别如seqidno.13
‑
15所示。
13.所述兔单克隆抗体otir13e1，其中vh区域包括3个抗原决定簇：cdr1、cdr2和cdr3，抗原决定簇的区域相应地分别为25aa
‑
32aa，50aa
‑
56aa和93aa
‑
105aa。其氨基酸残基序列分别如seqidno.16
‑
18所示。
14.所述的兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体otir5c10或兔单克隆抗体otir13e1可以与hsd17b13高特异性结合，可通过本领域技术人员所公知的的方法，制备成检测hsd17b13的各种免疫检测试剂盒。尤其是，应用于双抗体夹心elisa或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中。双抗体夹心elisa检测hsd17b13标准品，检测灵敏度能达到300pg/ml；板式化学发光检测hsd17b13标准品，检测灵敏度能达到78pg/ml。
附图说明
15.图1为兔单克隆抗体otir5c10和otir13e1重链和轻链全长扩增产物的电泳图，m为dna分子量marker；
16.图2为兔单克隆抗体otir5c10特异识别完整的hsd17b13(fulllengthhsd17b13,hsd17b13
‑
fl)蛋白的westernblot检测结果图；
17.图3为兔单克隆抗体otir13e1特异识别完整的hsd17b13(fulllengthhsd17b13,hsd17b13
‑
fl)蛋白的westernblot检测结果图；
18.图4为双抗体夹心elisa法检测hsd17b13蛋白标准曲线；
19.图5为板式化学发光检测hsd17b13蛋白。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
21.实施例1:抗hsd17b13兔单克隆抗体的制备
22.一、hsd17b13重组蛋白的制备
23.从genebank中选调hsd17b13基因nm_178135.5(np_835236.2)，该基因编码hsd17b13全长300个氨基酸(aa)。以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒rc213132(含hsd17b13orf900bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点sgfi和mlui，克隆入表达载体pcmv6，建立hsd17b13重组表达质粒。采用本领域技术人员所知的技
术方法将该基因转染hek293t细胞，转染48小时后，进行细胞裂解，收集所有培养皿中的裂解液，4℃离心，ddk亲和层析柱纯化，sds
‑
page电泳鉴定纯度。电泳后从凝胶上观察到分子量为 34kda左右的目的蛋白条带，纯度在85％以上，达到了制备单抗的纯度要求。
24.二、动物免疫
25.上述纯化的hsd17b13重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下注射方法免疫2kg左右的新西兰大白兔，免疫剂量为500μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为250μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；依据elisa效价128000时的od450大于1.0为标准，根据结果判定是否收集pbmcs或是继续免疫，选取抗体效价最高的兔子进行pbmcs收集。
26.三、pbmcs分离、特异性b细胞分选、克隆重组将兔仰卧固定在手术台上，将心脏部位被毛减掉，用酒精消毒皮肤，选择心搏最明显处用50ml注射器穿刺，针头刺入心脏后即有血液涌入注射器，取得所需血量后迅速将针头拔出，将注射器中的全血转入无菌50ml管中，与等量的pbs混匀后逐滴缓慢的加入到淋巴细胞分离液上方，室温400
×
g离心30分钟，离心后，液面由上至下分为四层：黄色血浆层、白色薄膜层即单个核细胞层、分离液层及红细胞层，小心吸取单个核细胞层并用pbs洗涤去除血小板和淋巴细胞分离液后即可获得兔 pbmcs。从兔pbmcs中继续分选抗原特异性的b细胞进行培养，培养后的b 细胞上清用抗原包被的elisa板筛选阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取rna并反转录成cdna,天然配对的兔单克隆抗体轻重链全长序列从对应阳性克隆的cdna中被扩增出来，通过克隆重组方法构建兔单克隆抗体表达载体，并经测序确定序列。扩增的全长pcr产物结果如图1。
27.四、单克隆抗体的制备和纯化为了获得多株识别人hsd17b13蛋白的兔单克隆抗体，本发明将兔单克隆抗体重链、轻链基因装载在表达载体上，将质粒转染hek293细胞；转染120
‑
144小时获得培养上清中含有重组的识别人 hsd17b13蛋白的兔单克隆抗体。收取细胞悬液，离心取上清，亲和层析法进行抗体纯化。以bca法测定纯化后的单抗浓度，再分装、冻干。
28.实施例2:抗hsd17b13兔单克隆抗体otir5c10或otir13e1的鉴定
29.一、兔单克隆抗体的特异性鉴定
30.采用westernblot(wb)检测。hsd11b1、hsd17b2、hsd17b3、hsd17b4、 hsd17b6、hsd17b7、hsd17b8、hsd17b10、hsd17b11、hsd17b13等蛋白上样进行sds
‑
page，蛋白上样量为20ng，转膜后进行wb检测。
31.结果显示，兔单克隆抗体otir5c10或otir13e1仅特异识别hsd17b13 蛋白，而不识别其它9种同家族蛋白，说明本发明的抗hsd17b13兔单克隆抗体otir5c10或otir13e1对hsd17b13蛋白具有高度特异性。结果见图2和图3。
32.二、兔单克隆抗体的效价
33.采用倍比稀释法稀释兔单克隆抗体otir5c10或otir13e1，用间接elisa 测抗体效价，结果显示本发明涉及的兔单克隆抗体otir5c10或otir13e1效价为6.6
×
106。
34.三、抗体配对
35.为了挑选包被抗体和检测抗体的最佳组合，采用棋盘组合，将获得的多株hsd17b13兔单克隆抗体相互配对。基本步骤：多株单克隆抗体分别包被酶标板， 4℃过夜。第二天取出酶标板，pbst洗涤一次，1％bsa溶液37℃封闭2小时， pbst洗涤3次；每孔加入
hsd17b13蛋白100μl，浓度分别为20、5、1和0ng/ml， 37℃孵育1小时；孵育完成后取出酶标板，pbst洗涤3次，分别加入生物素标记的上述多株抗体作为检测抗体，37℃孵育1小时；孵育完成后取出酶标板， pbst洗涤3次，分别加入hrp标记的avidin，37℃孵育0.5小时。pbst洗涤 5次，加入tmb底物，37℃显色10min。取出后加终止液，在酶标仪上测定od450 读数。根据样品的od值与阴性对照的背景值，选出最为理想的兔单克隆抗体对，配对筛选结果见表1。本发明涉及的抗体otir5c10作为包被抗体，抗体 otir13e1作为检测抗体最佳。抗人羟基类固醇17
‑
β脱氢酶13(hsd17b13) 兔单克隆抗体otir5c10和otir13e1可以识别hsd17b13蛋白表面的不同抗原决定簇。
36.表1抗体配对实验筛选结果
[0037][0038]
实施例3:兔单克隆抗体otir5c10或otir13e1可变区基因与氨基酸序列分析
[0039]
分别以otir5c10或otir13e1抗体的重组质粒为dna模板，根据模板上轻链及重链5'端载体序列设计轻链可变区及重链可变区测序引物，采用测序仪 abi 3730进行测序。经测序获得兔单克隆抗体otir5c10和otir13e1轻链及重链可变区的核苷酸序列。
[0040]
利用互联网，在http://www.imgt.org上使用imgt/v
‑
quest分析软件，分别将轻链与重链的核苷酸序列进行测序结果数据分析，得到兔单克隆抗体 otir5c10的轻链氨基酸序列如seq id no.1所示，重链氨基酸序列如 seq id no.2所示。vl全长为109个氨基酸，其fr的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和10，cdr的3个结构域氨基酸数分别为8、3和9，cdr1、 cdr2和cdr3的区域相应地分别为27aa
‑
34aa，52aa
‑
54aa和91aa
‑
99aa，其氨基酸序列分别:qsvyrnnq、gas、ggghstgve。
[0041]
通过分析，所述兔单克隆抗体otir5c10 vh全长为115个氨基酸，其fr 的4个结构域氨基酸数分别为24、17、35和11，cdr的3个结构域氨基酸数分别为8、7和12，cdr1、cdr2和cdr3分别为25aa
‑
32aa，50aa
‑
56aa和 93aa
‑
104aa，其氨基酸序列分别为gfslstna、issrgnt、ardpytndrwcl。
[0042]
通过分析，所述兔单克隆抗体otir13e1的轻链氨基酸序列如 seq id no.11所示，重链氨基酸序列如seq id no.12所示。vl全长为108 个氨基酸，其fr的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和10，cdr的3个结构域氨基酸数分别为6、3和10，cdr1、cdr2和cdr3的区域相应地分别为27aa
‑
32aa，50aa
‑
52aa和89aa
‑
98aa，其氨基酸序列分别:ekiysf、las、 qqtytyengd。
[0043]
通过分析，所述兔单克隆抗体otir13e1 vh全长为116个氨基酸，其fr 的4个结构域氨基酸数分别为24、17、36和11，cdr的3个结构域氨基酸数分别为8、7和13，cdr1、cdr2和cdr3分别为25aa
‑
32aa，50aa
‑
56aa和 93aa
‑
105aa，其氨基酸序列分别为gfslstya、iyasgst、ardfpgyspdtgy。
[0044]
实施例4:抗hsd17b13兔单克隆抗体otir5c10或otir13e1用于制备双抗体夹心
elisa检测试剂盒
[0045]
采用本领域技术人员所公知的基于elisa双抗体夹心法原理的检测技术，制作hsd17b13检测试剂盒，为与hsd17b13相关疾病非酒精性脂肪肝 (nafld)提供辅助诊断，也为下一步工程抗体的制备提供基础。
[0046]
一、试剂盒组成
[0047]
1.包被otir5c10抗体的板条：用pbs缓冲液稀释抗体至5μg/ml，包被到微孔板上，每孔100μl，4℃孵育过夜，以pbst洗涤3次，甩干；加含有1％ bsa、5％蔗糖、0.05％proclin300的pbs进行封闭，37℃反应2h，弃去孔内封闭液，甩干；将包被板置于37℃烘箱2h，即完成包被，以铝箔袋密封，存放于 4℃保存备用。
[0048]
2.试剂配制
[0049]
1.生物素结合物配制采用thermo scientific的ez
‑
link
tm sulfo
‑
nhs
‑
lc
‑
biotin标记抗hsd17b13兔单克隆抗体otir13e1，滴定工作浓度，配制成1:20的浓缩液，稀释液为含1％bsa、5％甘油、0.05％proclin 300的 pbs，过滤除菌。
[0050]
2.洗涤缓冲液为常规的ph7.4的pbst，含0.05％proclin300，配制成20 倍浓缩液。
[0051]
3.hrp标记的avidin配制成1:20的浓缩液，稀释液为含1％bsa、5％甘油、0.05％proclin 300的pbs，过滤除菌。
[0052]
4.酶的底物液(显色液)单组分tmb(从市场采购)。
[0053]
5.样本稀释液含1％bsa、0.05％proclin 300的pbs，过滤除菌。
[0054]
6.终止液用10ml hcl(36
‑
38％)加入110ml蒸馏水中，混合过程需缓慢进行，配置成1n的hcl。
[0055]
7.标准品hsd17b13重组蛋白，以含1％bsa、5％蔗糖、10％甘油、 0.05％proclin300的pbs为稀释液，将样品稀释为20μg/ml，过滤除菌，无菌分装。
[0056]
二、检测操作要点
[0057]
1、为保证检测结果的准确性，建议标准品及样本均设双孔测定。每次检测均需做标准曲线。
[0058]
2、如标本中待测物质含量过高，请先用样本稀释液进行稀释，以使样本符合试剂盒的检测范围，最后计算时再乘以相应的稀释倍数。
[0059]
3、加样：加样时，请使用一次性的洁净吸头，避免交叉污染。加样时应尽量轻缓，避免起泡，将样本加于酶标板孔底部，切勿沿孔壁加样。
[0060]
4、温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须覆上板贴，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃，及时调整。温育过程中，温箱不易开启太多次，以免影响温度平衡。
[0061]
5、洗涤：洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
[0062]
6、显色：为保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一下显色情况以控制反应时间(比如每隔 10分钟)。当肉眼可见标准品前3
‑
4孔有明显梯度蓝色，后3
‑
4孔显色不明显时，即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
[0063]
7、底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。
[0064]
三、标准hsd17b13蛋白不同稀释度标准曲线的确定
[0065]
上述制备的检测hsd17b13蛋白双抗体夹心elisa检测试剂盒从4度冰箱取出，平衡到室温。将标准品用pbs从20μg/ml稀释到5ng/ml，制备成0、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5共7个系列浓度标准品，按照上述的检测方法在每孔中加入标准品100μl，进行温育，然后弃去液体，加入生物素标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，最后加入hrp标记的avidin工作液进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度od值做标准曲线，结果见表2。依据表2制作hsd17b13检测标准曲线，见附图4。标准曲线的r2＝0.9934，推出样品浓度计算公式：y＝0.0045x+0.1622。
[0066]
表2.双抗体夹心elisa法检测hsd17b13标准蛋白
[0067]
包被抗体5c10ng/mlod450nm51.672.50.9251.250.5070.6250.2860.31250.220.156250.15800.092检测抗体13e1
[0068]
实施例5：抗hsd17b13蛋白兔单克隆抗体otir5c10或otir13e1用于板式化学发光免疫检测
[0069]
采用本领域技术人员所公知的基于双抗体夹心法原理的板式化学发光免疫检测技术，制作hsd17b13蛋白检测试剂盒，用于临床上与hsd17b13蛋白相关疾病辅助诊断。
[0070]
一、检测原理与方法
[0071]
采用基于双抗体夹心法原理的板式化学发光免疫检测技术。在不透光的白色微孔板内包被抗hsd17b13蛋白的兔单克隆抗体otir5c10，将封闭好的包被板放置到科斯迈全自动发化学发光仪上，设置仪器程序，将标准品或待测标本与生物素标记的兔单克隆抗体otir13e1同时进行温育，则三者形成抗体
‑
抗原
‑ꢀ
抗体复合物。洗涤除去未结合的物质，加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的亲和素(avidin)，洗涤除去未结合的物质，加入北京科跃中楷化学发光底物，反应10min后科斯迈全自动发化学发光仪显示化学发光值。依据信噪比大于2.0 判读结果为阳性。发光值的大小反映了结合的酶标抗体的量，它与标本中的 hsd17b13蛋白的浓度成正比。根据所测定的标准品的发光值绘制标准曲线,待测标本中的hsd17b13蛋白浓度值即可从标准曲线上获得。
[0072]
二、检测hsd17b13蛋白的板式化学发光检测试剂盒组成
[0073]
1.包被otir5c10抗体的板条：同实施例4。
[0074]
2.试剂配制
[0075]
1.生物素结合物配制同实施例4。
[0076]
2.洗涤缓冲液同实施例4。
[0077]
3.hrp标记的avidin配制成1:20的浓缩液，稀释液为含1％bsa、5％甘油、0.05％proclin 300的pbs，过滤除菌。
[0078]
4.化学发光显色液a液和b液，购于北京科跃中楷生物技术有限公司。
[0079]
5.样本稀释液含1％bsa、0.05％proclin 300的pbst，过滤除菌。
[0080]
6.标准品hsd17b13全长蛋白，以含1％bsa、5％蔗糖、10％甘油、 0.05％proclin300的pbs为稀释液，将样品稀释为5μg/ml，过滤除菌，无菌分装。
[0081]
三、对hsd17b13全长蛋白的检测
[0082]
把hsd17b13全长蛋白进行梯度稀释，分别为0pg/ml、78pg/ml、156pg/ml、 312pg/ml、625pg/ml、1260pg/ml、2500pg/ml、5000pg/ml，以otir5c10抗体为包被抗体、otir13e1抗体为检测抗体，用上述检测方法检测8个梯度稀释的抗原，检测结果见表3。根据信噪比大于2.0判定，本发明所述的兔单克隆抗体用于板式化学发光免疫检测试剂，最低灵敏度大于78pg/ml，线性范围为 78
‑
5000pg/ml。依据表3制作hsd17b13蛋白检测标准曲线，见图5
[0083]
表3.板式化学发光法检测hsd17b13全长蛋白
[0084]