一种幽门螺杆菌的快速培养方法与流程

1.本发明属于幽门螺杆菌培养技术领域，具体涉及一种幽门螺杆菌的快速培养方法。


背景技术：

2.幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性菌，因其严格的生长条件所以很难在实验室大规模培养。目前培养幽门螺杆菌的培养基一般都是以心浸液琼脂、哥伦比亚琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂等加上无菌脱纤维羊血及hp抑菌剂组成。在经过一定比例配制成溶液后高压灭菌，随之倾入无菌培养皿内冷却凝固。随后可用幽门螺杆菌菌株在平板上划线涂板，放入培养罐中利用真空机抽取罐内空气至微需氧后倒扣放置于37℃培养箱内培养72h左右后即可。
3.目前市面上培养幽门螺杆菌的方法在培养效率方面还存在着一定的问题，虽然能培养出菌株但是想要快速又广泛的培养幽门螺杆菌还存在着一些不足，一方面可能是由于幽门螺杆菌苛刻的生长条件使得培养流程变得复杂，其次在培养时平板内因为抗菌药物的不足很容易滋生一些杂菌。


技术实现要素：

4.发明目的：为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种幽门螺杆菌的快速培养方法。
5.技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种幽门螺杆菌的快速培养方法，包括在培养基内添加甲氧苄氨嘧啶、头孢万古霉素、头孢磺啶以及二性霉素b，并且在放入培养器抽取至微需氧前，在培养器的最上部和底部各放置一个空板隔绝霉菌污染。
7.优选的，所述培养基中甲氧苄氨嘧啶、头孢万古霉素、头孢磺啶以及二性霉素b的添加量如下：
8.头孢万古霉素8
‑
12mg/l，头孢磺啶4
‑
6mg/l，
9.甲氧苄氨嘧啶4
‑
6mg/l，二性霉素b 4
‑
6mg/l。
10.优选的，所述培养基包括如下原料：
11.万古霉素8
‑
12mg/l，头孢磺啶4
‑
6mg/l，甲氧苄氨嘧啶4
‑
6mg/l，
12.二性霉素b 4
‑
6mg/l，牛脑心浸粉6
‑
10g/l，蛋白胨4
‑
6g/l，
13.酪蛋白胨14
‑
18g/l，氯化钠4
‑
6g/l，葡萄糖1
‑
3g/l，磷酸氢二钠2
‑
3g/l，
14.琼脂12
‑
15g/l。
15.优选的，所述培养基中还添加有l
‑
半胱氨酸盐酸盐，其添加量为90
‑
110mg/l。
16.进一步优选，所述培养基配制完成后，将ph值调整至7.2
‑
7.6，随后高压灭菌，冷却，加入7％
‑
10％的脱纤维羊血，即可倾入无菌培养皿冷却后涂板化划线。
17.更进一步优选，所述高压灭菌的温度为121
±
3℃，冷却至50
‑
55℃时加入7％
‑
10％的脱纤维羊血。
18.优选的，所述幽门螺杆菌的快速培养方法，包括将培养基置于培养平板上，接种幽门螺杆菌菌株，均匀涂抹，划线；完成后放入培养器中，在在培养器的最上部和底部各放置一个空板隔绝霉菌污染，随后封闭，抽至微需氧状态，倒置放入培养箱内培养。
19.进一步优选，所述培养箱内培养的条件为：37
±
3℃培养箱内培养72
‑
96h。
20.本发明采用了一种新型的培养技术，在培养基中添加一定的抗菌药物时，考虑到部分菌株会对啶酸及多粘菌素敏感，因而培养基中应尽量避免使用该抗生素。同时，再以物理方法将霉菌隔绝，以及添加的l
‑
半胱氨酸盐酸盐可以去氧化，使涂板划线容错率提高。
21.有益效果：与现有技术相比，本发明方法具有以下优势：
22.1)本发明中的抗菌药物都是排除了幽门螺杆菌敏感的药物，可以增加培养效率；同时，配合物理隔绝方法，可以进一步避免杂菌滋生。
23.2)本发明培养基中添加的l
‑
半胱氨酸盐酸盐可以去氧化，使涂板划线容错率提高。
附图说明
24.图1为显微镜下幽门螺杆菌的鉴定图。
25.图2为幽门螺杆菌平板图。
26.图3为幽门螺杆菌测序序列ncbi比对图。
具体实施方式
27.下文将结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
28.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
29.实施例1
30.1)配固体培养基：
31.万古霉素(10mg/l)；
32.头孢磺啶(5mg/l)；
33.甲氧苄氨嘧啶(5mg/l)；
34.二性霉素b(5mg/l)；
35.牛脑心浸粉(8g/l)；
36.蛋白胨(5g/l)；
37.酪蛋白胨(16g/l)；
38.氯化钠(5g/l)；
39.葡萄糖(2g/l)；
40.磷酸氢二钠(2.5g/l)；
41.琼脂(13.5g/l)；
42.如果在涂板划线时的速度不够快还可以在培养基中添加l
‑
半胱氨酸盐酸盐(100mg/l),配制完成后将ph值调整至7.2
‑
7.6，随后放入高压灭菌锅121℃灭菌，在冷却至
50
‑
55℃时加入7％
‑
10％的脱纤维羊血，即可倾入无菌培养皿等待凝固即可。
43.2)取出保存的幽门螺杆菌菌株，在超净台内用接种环接种一些菌液在固体平板上均匀涂抹，从接种至涂板划线在15s内完成。
44.3)涂板划线完成后放入培养罐中，在培养罐最底部和最上部各放入一个空板隔绝霉菌与污染，随后盖盖抽至微需氧状态，倒置放入37℃培养箱内培养72
‑
96h。
45.经过72
‑
96h的培养后可以开盖观察幽门螺杆菌状态，平板上已经长满则可挑菌进行鉴定，鉴定所用引物为幽门螺杆菌基因组内选取，经pcr验证及测序验证后则可进行保菌处理以备后续实验使用。
46.图1为显微镜下幽门螺杆菌的鉴定图，由图1可见利用新鲜培养物的湿涂片在显微镜下的幽门螺杆菌体呈螺旋杆状，活性较好。
47.图2为幽门螺杆菌平板图，由图2可见，幽门螺杆菌呈尖絮状且生长数量较多，分布均匀。
48.图3为幽门螺杆菌测序序列ncbi比对图，由图3可见经过培养的幽门螺杆菌经过幽门螺杆菌基因组引物pcr验证后得到目的条带且将菌液送至测序公司进行测序后结果表明其属于幽门螺杆菌属。
49.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。