一种纽莫康定B1及其异构体的制备方法与流程

一种纽莫康定b1及其异构体的制备方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纽莫康定b1及其异构体的制备方法。


背景技术：

2.纽莫康定(pneumocandins)是由真菌glarea lozoyensis产生的次级代谢产物，是合成抗真菌药物卡泊芬净(caspofungin)的前体化合物，具有环状六肽母核和脂肪酸侧链结构。按照不同脯氨酸在母核上取代的位置差异可以分成三类分别是纽莫康定a0(32羟基42甲基脯氨酸)、b0(32羟基脯氨酸)、和c0(42羟基脯氨酸)。
3.专利cn201710575306.3公开了肺念菌素b0(即纽莫康定b0)及类似物的结构，纽莫康定各组分结构如下式i所示：
[0004][0005][0006]
现有技术中多对纽莫康定b0进行提纯制备，同时对其他杂质进行控制；例如cn105820213a公开了一种高效分离纽莫康定a0、b0和c0的方法，包括如下步骤：a.溶解：将含有纽莫康定b0的纽莫康定粗品用乙醇充分溶解，溶解时固液比为1:12～14，g：ml，过滤后得粗品溶液；b.上柱：采用层析柱分离纯化，层析柱填料选用150-400目硅胶，采用湿法装柱，用乙酸乙酯逐渐将柱子装实后加入粗品溶液；c.层析：采用上述硅胶柱层析，流速控制在0.5～2.5bv/h，洗脱剂采用低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水组成的三元溶剂体系，三者
体积比为(3～8)：(3～7)：(1～5)；d.浓缩及重结晶：将分段收集到的纽莫康定b0洗脱液减压浓缩，正丙醇中重结晶得到纯品。该方法是提纯纽莫康定b0，对于其他杂质组分进行了控制，并没有得到纽莫康定其他杂质单组分。
[0007]
杨渊等公开了一种亲水作用色谱法测定纽莫康定b0及其杂质的研究(中国抗生素杂志2016年12月第41卷第12期)，采用xlon色谱柱进行分离，以乙腈和水(87:13)为流动相，流速为2.0ml/min；检测波长210nm；柱温30℃；进样量10μl。可以实现纽莫康定a0、b0和c0的同时检测。但是，该研究并没有提供纽莫康定b1或同分异构体的检测方法。并且该检测方法为线性色谱，应用到以非线性色谱为原理的工业生产中时，不再适用分离a0、b0和c0。
[0008]
专利cn201611236860.0采用表面修饰了极性基团的硅胶作为亲水分离填料，采用有机溶剂和水混合为洗脱剂。有机溶剂与水的体积比为5/95～95/5。但没有涉及纽莫康定b1或同分异构体的制备。且技术方案所用粗品没有提供制备方法，对高纯度纽莫康定b0或杂质的制备适用范围有一定的局限性。
[0009]
专利cn202011333347.x亲水层析柱的填料为均粒hilic。洗脱液中乙腈、甲醇和水的体积比为(68-72):(19-23):(5-13)。均粒hilic的微球型号为unisil亲水硅胶，unisil亲水硅胶的粒径为10μm，孔径为然而，该方案所用特定填料为均一球，粗品上样前需要用缓冲盐再生、流动相平衡，给连续进样操作造成了不便。且方法为等度洗脱，仅把纽莫康定b0与杂质进行了充分分离，不适合于高纯度纽莫康定杂质的制备。
[0010]
现有技术主要采用树脂柱工艺来纯化纽莫康定，然而，作为杂质成分的纽莫康定b1不能在反相色谱中与纽莫康定b0进行有效分离，只有通过正相色谱分离。纽莫康定b1在纯化工艺中需要对其严格控制，否则会严重影响醋酸卡泊芬净的质量。
[0011]
在药品检测领域，需要纽莫康定b1作为对照品。纽莫康定b1是制备纽莫康定b0的副产物，也会参与到卡泊芬净合成过程中生成新的杂质，现有的研究都集中在如何尽量降低该副产物的产量，并没有如何制备高纯度纽莫康定b1的报道，因此，需要开发出一种制备高纯度的纽莫康定b1及其异构体的方法，以满足市场上对纽莫康定b1及其异构体的需要。


技术实现要素：

[0012]
本发明的目的是提供一种高纯度高收率的纽莫康定b1及其异构体的制备方法，以解决现有技术中没能得到大量高纯度的纽莫康定b1及其异构体(b5、b6、e0)方法的问题。
[0013]
本发明的技术方案如下：一种纽莫康定b1及其异构体的制备方法，包括以下步骤：将含有纽莫康定b1的粗品用醇溶剂溶解，制备柱上样，以水为流动相a、以乙腈-甲醇体系为流动相b进行梯度洗脱，收集目标成分流出液，各收集液经减压浓缩、冻干得纽莫康定b1及其异构体，所述异构体为纽莫康定b5、b6、e0。
[0014]
优选地，所述的醇溶剂选自甲醇或乙醇。
[0015]
优选地，所述的含有纽莫康定b1的粗品与醇溶剂的质量体积比为1～2:5，其中质量以g计，体积以ml计，进一步优选为1.5:5。
[0016]
优选地，所述的流动相b中乙腈与甲醇的体积为7～9.5:3～0.5；进一步优选为9:1。
[0017]
优选地，所述的制备柱为装有亲水性填料的制备柱，所述亲水性填料选自click xion、unisil hilic-2m、unisil hilic-t、arg silica、cosmosil hilic中的一种，进一步
优选为click xion。
[0018]
优选地，所述的梯度洗脱的梯度条件为：
[0019]
时间-min流动相a％流动相b％06.0-7.594.0-92.5187.5-8.092.5-92.0238.5-10.090.0-91.58311.0-13.089.0-87.012011.0-13.089.0-87.0
[0020]
其中，流动相a为纯化水、流动相b是体积比为7～9.5:3～0.5的乙腈-甲醇溶液。
[0021]
进一步优选地，所述的梯度洗脱的梯度条件为：
[0022]
时间-min流动相a％流动相b％07.093.0187.7592.25239.590.58312.088.012012.088.0
[0023]
其中，流动相a为纯化水、流动相b是体积比为9:1的乙腈-甲醇溶液。
[0024]
优选地，所述梯度洗脱测定波长范围是270～280nm，进一步优选为278nm。
[0025]
优选地，所述的减压浓缩条件为：水浴温度35～45℃、真空度-0.090mpa～-0.100mpa。
[0026]
优选地，所述的冻干的冻干参数设置为：
[0027][0028]
进一步优选地，所述冻干曲线参数为：
[0029][0030]
本发明所述的纽莫康定b1的粗品溶液可采用如下的方法获得：
[0031]
对纽莫康定b0粗品(含有纽莫康定b0及纽莫康定b1、b5、b6、e0)溶解后上样于dn150高压液相制备柱。填料为正相硅胶，粒径10um。流动相为二氯甲烷、甲醇、水的混合溶液(体积比42：9：1)收集含纽莫康定b1、b5、b6、e0富集液，将富集液进行减压浓缩，40℃水浴，真空-0.09mpa～-0.100mpa。蒸至无冷凝液流出时，加乙醇，继续浓缩至干粉得含纽莫康定b1、b5、b6、e0粗品。纽莫康定b1及其异构体富集的在线制备液相图谱见附图7，其中标号1的为含纽莫康定b1和异构体的粗品对应的保留峰，标号2为纽莫康定b0对应的保留峰。
[0032]
对本发明得到的冻干粉经过液质分析，得纽莫康定b1及其异构体，分子量为1048，将所得产物进行液相检测，其相对保留时间rrt分别为1.09、1.11、1.17、1.14，其中，纽莫康定b1结构鉴定结果如下：
[0033][0034]
纽莫康定b1样品在cd3od中的1h-nmr数据
[0035]
[0036][0037]
纽莫康定e0结构鉴定结果如下：
[0038][0039]
纽莫康定e0样品在cd3od中的1h-nmr数据
[0040][0041]
[0042]
纽莫康定b5结构鉴定结果如下：
[0043][0044]
纽莫康定b5样品在cd3od中的1h-nmr数据
[0045]
[0046][0047]
纽莫康定b6结构鉴定结果如下：
[0048][0049]
纽莫康定b6样品在cd3od中的1h-nmr数据
[0050]
[0051][0052]
本发明相对于现有技术取得的有益效果：
[0053]
1、通过本发明技术方案，可以实现纽莫康定b1和其三种同分异构体(纽莫康定b5、纽莫康定b6、纽莫康定e0)的同时制备，较大提高了纽莫康定杂质制备的效率。
[0054]
2、填补了纽莫康定b1及其异构体纽莫康定b5、纽莫康定b6、纽莫康定e0制备的空白。
[0055]
3、采用梯度洗脱方法可以实现连续进样，不必每针都再生，操作方便。
附图说明
[0056]
图1实施例1纽莫康定b1粗品的hplc分析图谱；
[0057]
图2实施例1纽莫康定b1在线制备图谱；
[0058]
图3实施例1纽莫康定b1纯品的hplc分析图谱；
[0059]
图4实施例1纽莫康定b5纯品的hplc分析图谱；
[0060]
图5实施例1纽莫康定b6纯品的hplc分析图谱；
[0061]
图6实施例1纽莫康定e0纯品的hplc分析图谱；
[0062]
图7纽莫康定b1及其异构体富集的在线制备液相图谱。
具体实施方式
[0063]
本发明中纽莫康定b1及其异构体的分析检测方法为：
[0064]
色谱柱：ymc j’sphere ods-m80，4.6
×
250mm，4um；
[0065]
流动相a：0.1％磷酸水溶液；
[0066]
流动相b：乙腈；
[0067]
检测波长：210nm；
[0068]
流速：1.5ml/min；
[0069]
柱温：30.0℃；
[0070]
进样量：10μl
[0071]
梯度洗脱：
[0072]
time/mina％b％0604020604035505045199466040526040
[0073]
hplc检测相对保留时间rrt为1.09、1.11、1.14、1.17的目标峰分别对应纽莫康定b5、纽莫康定e0、纽莫康定b1、纽莫康定b6。
[0074]
参考实施例1
[0075]
纽莫康定b0粗品的制备：以专利cn107778357a方法制得。具体如下：将经真菌glarea lozoyensis发酵得到的含有纽莫康定b0的中试发酵液3000l(发酵效价为681mg/l)在搅拌的状态下，用磷酸调节ph值4.2，加入2％的助滤剂硅藻土，混匀，静置0.5小时，过滤，得到固体菌渣。菌渣用2倍体积的95％乙醇浸提，过滤去除菌丝，得浸提液；调整浸提液的醇浓度至20(v/v)。将其以0.5-1.0bv/h的速度流经d101柱，依次用纯化水、30％(v/v)乙醇-水溶液冲洗树脂柱，然后用80％(v/v)乙醇-水溶液洗脱树脂柱，收集富含纽莫康定b0的洗脱
液。在洗脱液中加入0.5％活性炭，在20℃条件下搅拌30分钟，过滤脱色。脱色液经过超滤过滤后，加水稀释至30％(v/v)。以0.5-1.0bv/h的速度流经kb-spe-hlb柱，用含乙醇30％(v/v)溶液冲洗树脂柱，再用乙醇80％(v/v)溶液洗脱，收集富含纽莫康定b0的洗脱液。将收集到的纽莫康定b0洗脱液，在30℃条件下真空浓缩，得到纽莫康定b0粗品1.35kg。
[0076]
纽莫康定b1的粗品的制备：以上述含有纽莫康定b0粗品为原料，获取纽莫康定b1的粗品。采用正相硅胶，以动态轴向装柱技术装柱150mm色谱柱，流动相v(二氯甲烷(工业))∶v(甲醇)∶v(水)＝42∶9∶1，上样量为11.4g粗品，洗脱流量为480ml/min，检测波长分别为276nm，210nm。连续进样，收集峰段rt62.7min-67.9min。将收集合并液减压浓缩，40℃水浴，真空-0.09mpa～-0.100mpa。蒸至无冷凝液流出时，加乙醇，继续浓缩至干粉得纽莫康定b1粗品。
[0077]
实施例1
[0078]
将含有纽莫康定b1的粗品1.5g用5ml甲醇溶解，制备柱上样(填料click xion)，以水为流动相a、以体积比9:1的乙腈-甲醇溶液为流动相b进行梯度洗脱，分别收集在线制备图谱保留时间为65.54min、73.63min、78.48min、92.30min的目标成分流出液。连续进样7针，合并各峰段对应收集液。合并液经减压浓缩、冻干得纽莫康定b1及其异构体(b5、b6、e0)。
[0079]
制备洗脱梯度为：
[0080]
时间-min流动相a％流动相b％07.093.0187.7592.25239.590.58312.088.012012.088.0
[0081]
纽莫康定b1粗品的hplc分析图谱见图1，图1中标号1为纽莫康定b5、标号2为纽莫康定e0、标号3为纽莫康定b1、标号4为纽莫康定b6；纽莫康定b1在线制备图谱见图2，图2中标号1为纽莫康定b5、标号2为纽莫康定e0、标号3为纽莫康定b6、标号4为纽莫康定b1；纽莫康定b1纯品的hplc分析图谱见图3；纽莫康定b5纯品的hplc分析图谱见图4；纽莫康定b6纯品的hplc分析图谱见图5；纽莫康定e0纯品的hplc分析图谱见图6。
[0082]
冻干参数设置为：
[0083][0084]
得到的四种冻干粉，经过液质分析，分子量均为1048，为纽莫康定b1或其同分异构
体(b5、b6、e0)，结果如下：
[0085][0086]
hplc检测相对保留时间rrt为1.09、1.11、1.14、1.17的目标峰分别对应纽莫康定b5、纽莫康定e0、纽莫康定b1、纽莫康定b6。纽莫康定b1纯品的hplc分析图谱见图3。
[0087]
实施例2
[0088]
将含有纽莫康质b1的粗品2.0g用5ml甲醇溶解，制备柱上样(填料click xion)，以水为流动相a、以体积比8:2的乙腈-甲醇溶液为流动相b进行梯度洗脱，分别收集在线制备图谱保留时间为63.02min、72.93min、77.46min、90.12min的目标成分流出液。连续进样7针，合并各峰段对应收集液。合并液经减压浓缩、冻干得纽莫康定b1及其异构体(b5、b6、e0)。
[0089]
制备洗脱梯度为：
[0090]
时间-min流动相a％流动相b％07.093.0187.7592.25239.590.58312.088.012012.088.0
[0091]
纽莫康定b1粗品的hplc分析图谱同图1；纽莫康定b1在线制备图谱在60min-93min显示4个目标成分峰，各个成分之间分离较好。
[0092]
冻干参数设置为：
[0093][0094]
得到的四种冻干粉，经过液质分析，分子量均为1048，为纽莫康定b1或其同分异构体(b5、b6、e0)，结果如下：
[0095][0096]
hplc检测相对保留时间rrt为1.09、1.11、1.14、1.17的目标峰分别对应纽莫康定b5、纽莫康定e0、纽莫康定b1、纽莫康定b6。
[0097]
实施例3
[0098]
将含有纽莫康定b1的粗品1.0g用5ml甲醇溶解，制备柱上样(填料click xion)，以水为流动相a、以体积比9.5:0.5的乙腈-甲醇溶液为流动相b进行梯度洗脱，分别收集在线制备图谱保留时间为67.48min、75.71min、80.44min、94.27min的目标成分流出液，连续进样7针，合并各峰段对应收集液。合并液经减压浓缩、冻干得纽莫康定b1及其异构体(b5、b6、e0)。
[0099]
制备洗脱梯度为：
[0100][0101][0102]
纽莫康定b1粗品的hplc分析图谱同图1；纽莫康定b1在线制备图谱在63min-98min显示4个目标成分峰，各个成分之间分离较好。
[0103]
冻干参数设置为：
[0104][0105]
得到的四种冻干粉，经过液质分析，分子量均为1048，为纽莫康定b1或其同分异构
体(b5、b6、e0)，结果如下：
[0106][0107]
hplc检测相对保留时间rrt为1.09、1.11、1.14、1.17的目标峰分别对应纽莫康定b5、纽莫康定e0、纽莫康定b1、纽莫康定b6。
[0108]
实施例4
[0109]
将含有纽莫康定b1的粗品1.5g用5ml甲醇溶解，制备柱上样(填料unisil hilic-2m)，以水为流动相a、以体积比9:1的乙腈-甲醇溶液为流动相b进行梯度洗脱，分别收集在线制备图谱保留时间为69.37min、77.51min、82.34min、92.19min目标成分流出液，连续进样7针，合并各峰段对应收集液。合并液经减压浓缩、冻干得纽莫康定b1及其异构体(b5、b6、e0)。制备洗脱梯度为：
[0110][0111][0112]
纽莫康定b1粗品的hplc分析图谱同图1；纽莫康定b1在线制备图谱在66min-95min显示4个目标成分峰，各个成分之间分离较好。
[0113]
冻干参数设置为：
[0114][0115]
得到的四种冻干粉，经过液质分析，分子量均为1048，为纽莫康定b1或其同分异构
体(b5、b6、e0)，结果如下：
[0116][0117]
hplc检测相对保留时间rrt为1.09、1.11、1.14、1.17的目标峰分别对应纽莫康定b5、纽莫康定e0、纽莫康定b1、纽莫康定b6。
[0118]
实施例5
[0119]
将含有纽莫康定b1的粗品1.5g用5ml甲醇溶解，制备柱上样(填料unisil hilic-t)，以水为流动相a、以体积比9:1的乙腈-甲醇溶液为流动相b进行梯度洗脱，分别收集在线制备图谱保留时间为62.13min、71.84min、76.38min、91.97min的目标成分流出液，连续进样7针，合并各峰段对应收集液。合并液经减压浓缩、冻干得纽莫康定b1及其异构体(b5、b6、e0)。
[0120]
制备洗脱梯度为：
[0121][0122][0123]
纽莫康定b1粗品的hplc分析图谱同图1；纽莫康定b1在线制备图谱在59min-95min显示4个目标成分峰，各个成分之间分离较好。
[0124]
冻干参数设置为：
[0125]
[0126]
得到的四种冻干粉，经过液质分析，分子量均为1048，为纽莫康定b1或其同分异构体(b5、b6、e0)，结果如下：
[0127][0128]
hplc检测相对保留时间rrt为1.09、1.11、1.14、1.17的目标峰分别对应纽莫康定b5、纽莫康定e0、纽莫康定b1、纽莫康定b6。
[0129]
实施例6
[0130]
将含有纽莫康定b1的粗品0.5g用5ml甲醇溶解，制备柱上样(填料arg silica)，按照乙腈：甲醇：水的体积比70:21:9进行等度洗脱。纽莫康定b5、纽莫康定e0、纽莫康定b6对应的在线制备图谱目标成分峰段重合严重，无法进行有效收集。纽莫康定b1对应的目标峰峰型矮宽，收集到的纽莫康定b1色谱纯度：93.16％。
[0131]
实施例7
[0132]
将含有纽莫康定b1的粗品3.0g用5ml甲醇溶解，制备柱上样(填料cosmosil hilic)，以水为流动相a、以体积比9:1的乙腈-甲醇溶液为流动相b进行梯度洗脱，纽莫康定b5、纽莫康定e0、纽莫康定b6对应在线制备图谱的目标峰段重合严重，无法进行有效收集。但可以收集到纽莫康定b1的目标峰。连续进样7针，合并收集液，经减压浓缩、冻干得纽莫康定b1；纽莫康定b1粗品的hplc分析图谱同图1。制备洗脱梯度为：
[0133]
时间-min流动相a％流动相b％05.095.0189.091.02311.089.08314.086.012014.086.0
[0134]
冻干参数设置为：
[0135]
[0136]
得到的一种冻干粉，经过液质分析，分子量为1048，为纽莫康定b1，结果如下：
[0137]