一种组织干细胞的获得、功能和调控方法与流程

1.本发明属于干细胞研究技术领域，具体涉及一种组织干细胞的获得、功能和调控方法。


背景技术：

2.干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞；多年来对干细胞的定义不断进行修正，并从不同的层面上来进行定义；目前大多数生物学家和医学家认为干细胞是来自于胚胎、胎儿或成人体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。
3.干细胞具有自动归巢的特性，在注入人体后，会聚集到受损的器官和相应的部位，并分化为这些器官和部位的特异性细胞；干细胞注入人体后，在目标组织内的微环境作用下，会长出新的细胞与组织，修复受损组织。通过干细胞自身的分化功能来生长出新的组织细胞，弥补组织细胞的衰老、死亡、损伤，使得病变的组织与细胞恢复健康。并参与新生血管，形成改善损伤组织的微循环；同时干细胞注入目标组织后，可以通过分泌出各种蛋白质、酶与多种因子(如神经营养因子、抗凋亡因子等各种生长因子、细胞因子)以及调节肽和气体信号分子等多种生物活性因子，作用于周围细胞，发挥旁分泌作用，可以促进细胞增殖，抑制功能细胞的凋亡，使现有组织祖细胞分化成组织细胞修复受损组织与生长新的组织。
4.综上所述，细胞在分裂过程中受到多种调控因子的影响，进而影响了组织干细胞的功能性，因此针对组织干细胞的获得、功能和调控的研究显得尤为重要，以明确组织干细胞中调控因子对细胞功能特性的影响。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种组织干细胞的获得、功能和调控方法，以解决上述背景技术中提出的组织干细胞中调控因子对细胞功能特性的影响的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种组织干细胞的获得、功能和调控方法，包括以下步骤：
7.步骤1：组织干细胞获取和培养；
8.步骤2：组织干细胞分组诱导分化；
9.步骤3：分化细胞多组移植；
10.步骤4：根据对比结果得出结论。
11.优选的，所述步骤1包括以下步骤：
12.步骤1.1：取50d左右小白鼠，颈椎脱臼处死，剃除背毛约10～20cm2大小，剪下背
皮，浸入d
‑
pbs洗3～4次，小心去除皮肤基底的筋膜和脂肪，将皮肤放入盛有12mlcnt
‑
57培养基的离心管中，12ml溶液中还包括3mg ml+性蛋白酶、5x抗菌素/抗真菌素，4℃孵育15h左右；
13.步骤1.2：将皮肤转至含有2ml cnt
‑
57培养基的培养皿(不贴壁培养皿)中,洗去多余的中性蛋白酶，用镊子分离真皮(粉红色、不透明、胶状)和表皮(白色、半透明)，将500ul胰酶滴入一个新的培养(不贴壁培养皿)中,将表皮基底层朝下覆盖到胰酶液滴上，尽量避免组织破裂，室温孵育20～30min(盖上皿盖以防止蒸发)，直至溶液开始混浊，加入2ml cnt
‑
57培养基(稀释剩余胰酶)，将液体吸入15ml离心管中,用1～2ml培养基将单细胞冲洗到平皿的底部,转移至离心管中；加入2ml培养基后继续摩擦,再吸入离心管，160r/min、室温离心5min，弃上清，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养。
14.优选的，所述步骤2包括以下步骤：
15.步骤2.1：将组织干细胞分为a组和b组；
16.步骤2.2：油红o对组织干细胞进行染色标记；
17.步骤2.3：在相同件下进行对a组和b组进行诱导分化；
18.步骤2.4：观察统计组织干细胞分化程度；
19.步骤2.5：分化一定程度后进行复染。
20.优选的，所述步骤3包括以下步骤：
21.步骤3.1：分别取成年小白鼠c和幼年小白鼠d；
22.步骤3.2：将小白鼠c和小白鼠d进行麻醉，并且割除10～20cm2大小的背皮；
23.步骤3.3：分别将a组和b组分化的组织细胞移植到小白鼠c和小白鼠d体外；
24.步骤3.4：24h后观察a组和b组的组织细胞分化情况。
25.优选的，所述步骤4包括以下步骤：
26.步骤4.1：根据a组的染色深浅，以a组的组织发育程度为1，确定对比标准；
27.步骤4.2：根据b组的染色深浅，观察a组的组织发育程度x,并且与a组的对比标准1进行对比；
28.步骤4.3：记录对比结果。
29.优选的，所述步骤2.1包括以下步骤：
30.步骤2.1.1：通过血球计数板对组织干细胞进行计数；
31.步骤2.1.2：根据计数结果将组织干细胞基本平均分为a组和b组。
32.优选的，所述步骤2.5中a组和b组复染后颜色基本保持一致。
33.与现有技术相比，本发明提供了一种组织干细胞的获得、功能和调控方法，具备以下有益效果：
34.1、本发明通过采用成年小白鼠c和幼年小白鼠d进行对比，可以更加清晰的得出组织微环境对组织干细胞分化的影响，并且小白鼠的基因序列和人类的差不多，它的全基因组和人类的相似度极高，很多人类难以治愈的疾病可以在小白鼠身上找到相似性状，进而可用于实验研究；
35.2、本发明通过将同一组织干细胞诱导分化后的组织细胞分为a组和b组，分别移植到成年小白鼠c和幼年小白鼠d进行组织发育，并且根据a组和b组发育后的组织颜色进行对比，便于得出对比结果，研究更加方便。
附图说明
36.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：
37.图1为本发明提出的一种组织干细胞的获得、功能和调控方法的流程框图；
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种组织干细胞的获得、功能和调控方法，包括以下步骤：
40.步骤1：组织干细胞获取和培养；
41.步骤2：组织干细胞分组诱导分化；
42.步骤3：分化细胞多组移植；
43.步骤4：根据对比结果得出结论。
44.本发明中，优选的，步骤1包括以下步骤：
45.步骤1.1：取50d左右小白鼠，颈椎脱臼处死，剃除背毛约10～20cm2大小，剪下背皮，浸入d
‑
pbs洗3～4次，小心去除皮肤基底的筋膜和脂肪，将皮肤放入盛有12mlcnt
‑
57培养基的离心管中，12ml溶液中还包括3mg ml+性蛋白酶、5x抗菌素/抗真菌素，4℃孵育15h左右；
46.步骤1.2：将皮肤转至含有2ml cnt
‑
57培养基的培养皿(不贴壁培养皿)中,洗去多余的中性蛋白酶，用镊子分离真皮(粉红色、不透明、胶状)和表皮(白色、半透明)，将500ul胰酶滴入一个新的培养(不贴壁培养皿)中,将表皮基底层朝下覆盖到胰酶液滴上，尽量避免组织破裂，室温孵育20～30min(盖上皿盖以防止蒸发)，直至溶液开始混浊，加入2ml cnt
‑
57培养基(稀释剩余胰酶)，将液体吸入15ml离心管中,用1～2ml培养基将单细胞冲洗到平皿的底部,转移至离心管中；加入2ml培养基后继续摩擦,再吸入离心管，160r/min、室温离心5min，弃上清，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养。
47.本发明中，优选的，步骤2包括以下步骤：
48.步骤2.1：将组织干细胞分为a组和b组；
49.步骤2.2：油红o对组织干细胞进行染色标记；
50.步骤2.3：在相同件下进行对a组和b组进行诱导分化；
51.步骤2.4：观察统计组织干细胞分化程度；
52.步骤2.5：分化一定程度后进行复染。
53.本发明的工作原理及使用流程：使用时，取50d左右小白鼠，颈椎脱臼处死，剃除背毛约10～20cm2大小，剪下背皮，浸入d
‑
pbs洗3～4次，小心去除皮肤基底的筋膜和脂肪，将皮肤放入盛有12mlcnt
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57培养基的离心管中，12ml溶液中还包括3mg ml+性蛋白酶、5x抗菌素/抗真菌素，4℃孵育15h左右，将皮肤转至含有2ml cnt
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57培养基的培养皿(不贴壁培养皿)中,洗去多余的中性蛋白酶，用镊子分离真皮(粉红色、不透明、胶状)和表皮(白色、半透
明)，将500ul胰酶滴入一个新的培养(不贴壁培养皿)中,将表皮基底层朝下覆盖到胰酶液滴上，尽量避免组织破裂，室温孵育20～30min(盖上皿盖以防止蒸发)，直至溶液开始混浊，加入2ml cnt
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57培养基(稀释剩余胰酶)，将液体吸入15ml离心管中,用1～2ml培养基将单细胞冲洗到平皿的底部,转移至离心管中；加入2ml培养基后继续摩擦,再吸入离心管，160r/min、室温离心5min，弃上清，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，再将组织干细胞基本平均分为a组和b组，用油红o对组织干细胞进行染色标记，在相同件下进行对a组和b组进行诱导分化，观察统计组织干细胞分化程度，分化一定程度后进行复染，使a组和b组颜色基本保持一致，便于根据a组和b组发育后的组织颜色进行对比。
54.实施例二
55.请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种组织干细胞的获得、功能和调控方法，包括以下步骤：
56.步骤1：组织干细胞获取和培养；
57.步骤2：组织干细胞分组诱导分化；
58.步骤3：分化细胞多组移植；
59.步骤4：根据对比结果得出结论。
60.本发明中，优选的，步骤1包括以下步骤：
61.步骤1.1：取50d左右小白鼠，颈椎脱臼处死，剃除背毛约10～20cm2大小，剪下背皮，浸入d
‑
pbs洗3～4次，小心去除皮肤基底的筋膜和脂肪，将皮肤放入盛有12mlcnt
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57培养基的离心管中，12ml溶液中还包括3mg ml+性蛋白酶、5x抗菌素/抗真菌素，4℃孵育15h左右；
62.步骤1.2：将皮肤转至含有2ml cnt
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57培养基的培养皿(不贴壁培养皿)中,洗去多余的中性蛋白酶，用镊子分离真皮(粉红色、不透明、胶状)和表皮(白色、半透明)，将500ul胰酶滴入一个新的培养(不贴壁培养皿)中,将表皮基底层朝下覆盖到胰酶液滴上，尽量避免组织破裂，室温孵育20～30min(盖上皿盖以防止蒸发)，直至溶液开始混浊，加入2ml cnt
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57培养基(稀释剩余胰酶)，将液体吸入15ml离心管中,用1～2ml培养基将单细胞冲洗到平皿的底部,转移至离心管中；加入2ml培养基后继续摩擦,再吸入离心管，160r/min、室温离心5min，弃上清，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养。
63.本发明中，优选的，步骤2包括以下步骤：
64.步骤2.1：将组织干细胞分为a组和b组；
65.步骤2.2：油红o对组织干细胞进行染色标记；
66.步骤2.3：在相同件下进行对a组和b组进行诱导分化；
67.步骤2.4：观察统计组织干细胞分化程度；
68.步骤2.5：分化一定程度后进行复染。
69.本发明中，优选的，步骤3包括以下步骤：
70.步骤3.1：分别取成年小白鼠c和幼年小白鼠d；
71.步骤3.2：将小白鼠c和小白鼠d进行麻醉，并且割除10～20cm2大小的背皮；
72.步骤3.3：分别将a组和b组分化的组织细胞移植到小白鼠c和小白鼠d体外；
73.步骤3.4：24h后观察a组和b组的组织细胞分化情况。
74.本发明中，优选的，步骤4包括以下步骤：
75.步骤4.1：根据a组的染色深浅，以a组的组织发育程度为1，确定对比标准；
76.步骤4.2：根据b组的染色深浅，观察a组的组织发育程度x,并且与a组的对比标准1进行对比；
77.步骤4.3：记录对比结果。
78.本发明中，优选的，步骤2.1包括以下步骤：
79.步骤2.1.1：通过血球计数板对组织干细胞进行计数；
80.步骤2.1.2：根据计数结果将组织干细胞基本平均分为a组和b组。
81.本发明中，优选的，步骤2.5中a组和b组复染后颜色基本保持一致。
82.本发明的工作原理及使用流程：使用时，取50d左右小白鼠，颈椎脱臼处死，剃除背毛约10～20cm2大小，剪下背皮，浸入d
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pbs洗3～4次，小心去除皮肤基底的筋膜和脂肪，将皮肤放入盛有12mlcnt
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57培养基的离心管中，12ml溶液中还包括3mg ml+性蛋白酶、5x抗菌素/抗真菌素，4℃孵育15h左右，将皮肤转至含有2ml cnt
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57培养基的培养皿(不贴壁培养皿)中,洗去多余的中性蛋白酶，用镊子分离真皮(粉红色、不透明、胶状)和表皮(白色、半透明)，将500ul胰酶滴入一个新的培养(不贴壁培养皿)中,将表皮基底层朝下覆盖到胰酶液滴上，尽量避免组织破裂，室温孵育20～30min(盖上皿盖以防止蒸发)，直至溶液开始混浊，加入2ml cnt
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57培养基(稀释剩余胰酶)，将液体吸入15ml离心管中,用1～2ml培养基将单细胞冲洗到平皿的底部,转移至离心管中；加入2ml培养基后继续摩擦,再吸入离心管，160r/min、室温离心5min，弃上清，补充培养液，并放置在培养皿中进行培养，通过血球计数板对组织干细胞进行计数，根据计数结果将组织干细胞基本平均分为a组和b组，用油红o对组织干细胞进行染色标记，在相同件下进行对a组和b组进行诱导分化，观察统计组织干细胞分化程度，分化一定程度后进行复染，a组和b组复染后颜色基本保持一致，然后分别取成年小白鼠c和幼年小白鼠d，将小白鼠c和小白鼠d进行麻醉，并且割除10～20cm2大小的背皮，分别将a组和b组分化的组织细胞移植到小白鼠c和小白鼠d体外，24h后观察a组和b组的组织细胞分化情况，根据a组的染色深浅，以a组的组织发育程度为1，确定对比标准，根据b组的染色深浅，观察a组的组织发育程度x,并且与a组的对比标准1进行对比，记录对比结果，结果显示如下：
[0083][0084]
由此可知，经过同一组织干细胞诱导分化后的组织细胞，分别移植到成年小白鼠c和幼年小白鼠d进行组织发育时，位于幼年小白鼠d体外的组织干细胞发育能力较强，位于成年小白鼠c体外的组织干细胞发育能力较弱，而成年小白鼠c相对于幼年小白鼠d而言，其组织微环境相对较为衰老，而微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化，进而可以得出，组织干细胞的分化受到微环境的影响，并且微环境越衰老分化效率越低，进而影响组织干细胞功能特性。
[0085]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。