一种编码重组禽流感病毒HA蛋白的基因、病毒样颗粒、疫苗及制备与应用

一种编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因、病毒样颗粒、疫苗及制备与应用
技术领域
1.本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因、病毒样颗粒、疫苗及制备与应用。


背景技术：

2.禽流感病毒(avian influenza virus，aiv)是囊膜型的、分节段的、负链rna病毒，属于正黏病毒科，流感病毒属，禽流感是禽类烈性传染病之一。
3.禽流感病毒编码多种蛋白，ha(表面抗原红细胞凝集素)蛋白是禽流感病毒编码的一种膜蛋白，在禽流感病毒感染宿主细胞方面发挥重要作用，也是宿主对禽流感病毒产生免疫效力的主要靶抗原。na(神经氨酸)蛋白也是一种膜蛋白，主要作用是协助子代病毒从宿主细胞中释放。ha和na蛋白是开发禽流感疫苗的主要抗原成分。
4.疫苗接种是预防禽流感病毒感染最有效的措施之一。当前国内禽流感疫苗以全病毒灭活疫苗为主，该疫苗依赖鸡胚生产，存在流感流行期间鸡胚供应不足，产生大量废弃物以及内源性污染等缺点。同时全病毒灭活苗的长期使用加快了禽流感病毒的变异速率，长期的免疫选择压力使禽流感病毒朝着非疫苗株的方向进化，导致全病毒灭活苗需要不断更新疫苗株来应对流感病毒新的流行。因此，我们需要开发一种新的安全有效的禽流感疫苗，来防控禽流感病毒的流行。
5.病毒样颗粒(virus
‑
like particle，vlp)是由病毒的结构蛋白组装而成的类病毒颗粒，其不具备病毒核酸，不具有传染性，是新型禽流感疫苗开发的热点。相比于全病毒灭活疫苗主要以体液免疫为主，病毒样颗粒疫苗可同时诱导体液免疫和细胞免疫，而后者正是禽流感疫苗具有交叉保护性的关键。杆状病毒表达系统安全性高，易操作，可大规模制备禽流感病毒样颗粒，是开发禽流感病毒样颗粒疫苗的重要工具。相比于全病毒灭活疫苗，仅需禽流感病毒的核酸序列，即可利用杆状病毒表达系统快速制备禽流感病毒样颗粒。因此基于杆状病毒表达系统开发的禽流感病毒样颗粒疫苗具有广阔的前景。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因。
7.本发明的另一目的在于提供一种禽流感病毒样颗粒。
8.本发明的再一目的在于提供上述禽流感病毒样颗粒的制备方法。
9.本发明的第四个目的在于提供一种禽流感病毒样颗粒疫苗。
10.本发明的第五个目的在于提供上述编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因、禽流感病毒样颗粒和禽流感病毒样颗粒疫苗的应用。
11.本发明的目的通过下述技术方案实现：
12.一种编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因，其核苷酸序列如seq id no:1所示；
13.一种禽流感病毒样颗粒，包含禽流感病毒ha蛋白、禽流感病毒na蛋白和禽流感病毒m1(基质蛋白)蛋白；其中，编码所述的禽流感病毒ha蛋白的基因为上述编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因；
14.编码所述的禽流感病毒na蛋白的基因和编码所述的禽流感病毒m1蛋白的基因的核苷酸序列分别如seq id no:2～3所示；
15.所述的禽流感病毒ha蛋白、禽流感病毒na蛋白、禽流感病毒m1蛋白的氨基酸序列分别如seq id no:4～6所示；
16.所述的禽流感病毒样颗粒优选由禽流感病毒ha蛋白、禽流感病毒na蛋白和禽流感病毒m1蛋白自我组装而成；
17.所述的禽流感为h7n9亚型禽流感；
18.所述的禽流感病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
19.(1)对禽流感病毒ha、na、m1基因进行物种密码子优化，并基因合成，得到密码子优化后的编码禽流感病毒ha蛋白的基因、编码禽流感病毒na蛋白的基因和编码禽流感病毒m1蛋白的基因，其核苷酸序列分别如seq id no:1～3所示；通过物种密码子优化，有利于昆虫细胞表达；
20.(2)以步骤(1)得到的密码子优化后的编码禽流感病毒ha蛋白的基因、编码禽流感病毒na蛋白的基因和编码禽流感病毒m1蛋白的基因为模板，进行pcr扩增，得到带有酶切位点的ha、na、m1基因片段，将带有酶切位点的ha、na、m1基因片段与杆状病毒转递质粒经酶切、连接、转化，分别得到ha基因重组转递质粒、na基因重组转递质粒以及m1基因重组转递质粒；
21.(3)将ha基因重组转递质粒、na基因重组转递质粒和m1基因重组转递质粒进行转化重组，分别得到ha基因重组杆状病毒质粒、na基因重组杆状病毒质粒和m1基因重组杆状病毒质粒；
22.(4)将ha基因重组杆状病毒质粒、na基因重组杆状病毒质粒和m1基因重组杆状病毒质粒经脂质体介导转染sf9细胞，分别得到ha基因重组杆状病毒、na基因重组杆状病毒和m1基因重组杆状病毒；
23.(5)ha基因重组杆状病毒、na基因重组杆状病毒和m1基因重组杆状病毒共同感染昆虫细胞，收取细胞外培养上清，得到ha、na和m1蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒；
24.步骤(2)中所述的杆状病毒转递质粒为pacebac1；
25.步骤(3)中所述的杆状病毒质粒为bacmid；
26.步骤(5)中所述的昆虫细胞为high five；
27.步骤(5)中所述的ha基因重组杆状病毒、na基因重组杆状病毒和m1基因重组杆状病毒共同感染时，moi为(2～7)：(1～4)：2；
28.步骤(5)中所述的ha基因重组杆状病毒、na基因重组杆状病毒和m1基因重组杆状病毒共同感染时，moi优选为2：1：2；
29.一种禽流感病毒样颗粒疫苗，包括药学上可以接受的载体和免疫量的上述禽流感病毒样颗粒；
30.所述药学上可以接受的载体包括佐剂；
31.所述佐剂为白油佐剂和油包水型佐剂中的至少一种；
32.所述的白油佐剂优选为道达尔eolane 150；
33.所述的油包水型佐剂为montanide
tm isa系列佐剂，进一步优选为montanide
tm isa71vg佐剂；
34.所述的禽流感病毒样颗粒疫苗的制备方法，包含如下步骤：
35.将上述禽流感病毒样颗粒以免疫剂量与佐剂混合乳化，得到禽流感病毒样颗粒疫苗；
36.当佐剂为白油佐剂时，所述的禽流感病毒样颗粒与白油佐剂的体积比优选为1：2；
37.当佐剂为油包水型佐剂时，所述的禽流感病毒样颗粒与油包水型佐剂的体积比优选为3：7；
38.所述的编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因、禽流感病毒样颗粒和禽流感病毒样颗粒疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用；
39.所述的禽流感病毒包括h7n9亚型禽流感病毒；
40.所述的制备预防和/或治疗禽流感病毒感染导致的疾病的药物的施用对象包括鸡。
41.相比于现有技术，本发明具有以下优点和效果：
42.(1)禽流感病毒的ha抗原是制备禽流感亚单位疫苗的主要靶抗原，本发明对禽流感病毒ha、na、m1基因进行物种密码子优化，使其不仅有利于昆虫细胞表达，而且免疫原性强。
43.(2)本发明基于昆虫
‑
杆状病毒表达系统生产h7n9亚型禽流病毒样颗粒抗原，其中禽流感病毒样颗粒由ha、na、m1抗原在昆虫细胞内自我组装，以病毒样颗粒形态释放到细胞外培养上清中，抗原表达高效。
44.(3)本发明探究了ha、na、m1重组杆状病毒共感染昆虫细胞的比例，优选ha、na、m1重组杆状病毒以moi＝2：1：2共同感染昆虫细胞，所获禽流感病毒样颗粒血凝效价最高，血凝效价达到13log2。
45.(4)本发明生产禽流感病毒样颗粒抗原是采用ha、na、m1重组杆状病毒共感染昆虫细胞的方法，相较于ha、na、m1基因串联到同一载体生产禽流感病毒样颗粒的方法，共感染的方式有更大的优化空间，可控的增加禽流感病毒样颗粒中主要靶抗原的含量以及调控各抗原含量的比例。
46.(5)本发明将定量后的h7n9禽流感病毒样颗粒与白油佐剂eolane 150混合乳化制备疫苗，评估该疫苗的免疫效力。免疫3周龄spf鸡，免疫后3周，平均血凝抑制(hi)抗体滴度在6log2以上；免疫后3周，使用a/chicken/guangdong/16876/2016(h7n9)毒株以2
×
10
6.0
eld
50
的剂量攻毒，攻毒后第5天采集咽喉和泄殖腔拭子检测排毒。结果显示未免疫组在攻毒后2天内全部死亡，疫苗组在攻毒后14天内未出现临床症状，全部存活，且在攻毒后第5天仅1只鸡排毒。
47.(6)本发明将定量后的h7n9禽流感病毒样颗粒与montanide
tm isa 71vg佐剂混合乳化制备疫苗，评估该疫苗针对野生型的h7n9亚型禽流感病毒的免疫效力。结果显示疫苗血清针对不同野生型的h7n9禽流感野毒株具有良好的交叉反应性。针对a/chicken/guangdong/e157/2017(h7n9)毒株，免疫后19天，平均hi效价达6.875log2，平均中和抗体效价达1：1706.67；针对a/chicken/qingyuan/e664/2017(h7n9)毒株，免疫后19天，平均hi效
价达8log2，平均中和抗体效价达1：3413.33；使用a/chicken/guangdong/e157/2017(h7n9)毒株以10
6.0
eid
50
的剂量攻毒，0.2ml/只，攻毒后3、5、7、9天采集咽喉和泄殖腔拭子检测排毒。结果显示未免疫组在攻毒后3天内全部死亡，疫苗组在攻毒后14天内未出现临床症状，全部存活，且仅在攻毒后第9天检测到1只鸡排毒。
48.(7)本发明制备的禽流感病毒样颗粒疫苗具有良好的交叉保护性。本发明制备的h7n9亚型禽流感病毒样颗粒联合eolane 150佐剂使用针对同源h7n9亚型高致病性禽流感病毒的致死性攻击能够提供完全的临床保护且显著抑制排毒；本发明制备的h7n9亚型禽流感病毒样颗粒联合montanide
tm isa 71vg佐剂使用针对野生型h7n9亚型高致病性禽流感病毒诱导了高水平的hi和中和抗体；针对野生型h7n9禽流感病毒的致死性攻击提供完全的临床保护，且仅一只鸡检测到排毒。本发明制备的h7n9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗为h7n9亚型禽流感的防控提供新的疫苗选择。
附图说明
49.图1是ha、na、m1基因重组转递质粒的酶切鉴定结果分析图，其中，a：pace
‑
ha，b：pace
‑
na，c：pace
‑
m1。
50.图2是ha、na、m1基因重组杆状病毒按照moi＝2：1：2感染昆虫细胞表达的禽流感病毒样颗粒的sds
‑
page和western blot结果分析图。
51.图3是禽流感病毒样颗粒的电镜观察图。
52.图4是禽流感病毒样颗粒与montanide
tm isa 71vg混合乳化制备的疫苗免疫spf鸡后第14和19天血清血凝抑制抗体(hi)和中和抗体结果分析图。
具体实施方式
53.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
54.下述实施例中的试验材料，若无特别说明，均是来源于商业途径。所述的试验方法，若无特别说明，均为常规试验方法。
55.实施例1 ha、na和m1基因的重组杆状病毒质粒的构建
56.(一)ha、na、m1基因重组转递质粒的构建
57.(1)本实施例中，对禽流感病毒ha、na、m1基因的核苷酸序列进行了密码子优化，偏向于昆虫细胞表达，且ha、na、m1基因c末端加入6x his标签；通过人工合成，得到密码子优化后的ha、na、m1基因的核苷酸序列，并分别连入puc57载体中，得到对应重组质粒(北京六合华大基因科技有限公司)；其中，密码子优化后的ha基因的核苷酸序列为seq id no:1，其氨基酸序列为seq id no:4；密码子优化后的na基因的核苷酸序列为seq id no:2，其氨基酸序列为seq id no:5；密码子优化后的m1基因的核苷酸序列为seq id no:3，其氨基酸序列为seq id no:6。
58.密码子优化后的ha基因的核苷酸序列：
59.atgaacactcagatcctggtcttcgctctgatcgctatcatccccactaacgccgacaagatctgcctgggtcaccacgctgtgagcaacggcactaaggtcaacactctgactgaacgtggtgtcgaggtcgtgaacgctactgagactgtggaacgcactaacaccccccgcatctgcagcaagggcaagcgcaccgtcgacctgggtcagtgcggcctgc
tgggcactatcactggtcccccccagtgcgaccagttcctggagttcagcgctgacctgatcatcgaacgccgcgagggttccgacgtctgctaccctggtaaattcgtcaacgaagaagctctgcgccagatcctgcgcgagagcggcggaatcgacaaggagcctatgggcttcacttacaacggtatccgcactaacggtgtgactagcgcttgccgccgcagcggtagcagcttctacgccgaaatgaagtggctgctgtccaacaccgacaacgctactttcccccagatgaccaagtcctacaagaacactcgcaagagccccgccatcatcgtgtggggtatccaccactccgtctccactgctgaacagactaagctgtacggttccggtaacaagctggtgaccgtcggttcctccaactaccagcagtccttcgtccccagccctggtgcccgtcctcaggtgaacggtcagagcggccgcatcgacttccactggctgatcctgaaccctaacgacaccgtgaccttcagcttcaacggtgctttcatcgctcctgaccgcgcttccttcctgcgcggtaaaagcatgggtatccagtccggcgtgcaggtggacgccaactgcgaaggcgactgctaccacagcggcggtactatcatctccaacctgcctttccagaacatcgacagccgtgctgtcggtaaatgcccccgttacgtcaagcagcgctccctgctgctggctactggcatgaagaacgtccctgaggttcctaagggcaagcgtactgctcgcggtctgttcggcgccatcgccggtttcatcgagaacggttgggagggcctgatcgacggctggtacggtttccgccaccagaacgcccagggcgagggcactgctgctgactacaagagcactcagtccgctatcgaccagatcaccggtaaactgaaccgcctgatcgccaagaccaaccagcagttcaagctgatcgacaacgagtttaatgaggtcgagaagcagatcggcaacgtcatcaactggactcgtgactccatcactgaggtctggagctacaacgccgagctgctggtggctatggaaaaccagcacaccatcgacctcgctgactccgagatggacaagctgtacgaacgcgtcaagcgccagctgcgcgagaacgctgaagaagacggcactggctgcttcgagatcttccacaagtgcgacgacgactgcatggcttccatccgtaacaacacctacgaccaccgtaagtaccgcgaagaagccatgcagaaccgtatccagatcgaccccgtcaagctgagctccggctacaaggacgtcatcctgtggttctccttcggtgccagctgcttcatcctgctggctattgttatgggtctggtcttcatctgcgtgaagaacggtaacatgcgttgcaccatccaccaccaccaccatcactaa
60.ha蛋白氨基酸序列：
61.mntqilvfaliaiiptnadkiclghhavsngtkvntltergvevvnatetvertntpricskgkrtvdlgqcgllgtitgppqcdqflefsadliierregsdvcypgkfvneealrqilresggidkepmgftyngirtngvtsacrrsgssfyaemkwllsntdnatfpqmtksykntrkspaiivwgihhsvstaeqtklygsgnklvtvgssnyqqsfvpspgarpqvngqsgridfhwlilnpndtvtfsfngafiapdrasflrgksmgiqsgvqvdancegdcyhsggtiisnlpfqnidsravgkcpryvkqrslllatgmknvpevpkgkrtarglfgaiagfiengweglidgwygfrhqnaqgegtaadykstqsaidqitgklnrliaktnqqfklidnefnevekqignvinwtrdsitevwsynaellvamenqhtidladsemdklyervkrqlrenaeedgtgcfeifhkcdddcmasirnntydhrkyreeamqnriqidpvklssgykdvilwfsfgascfillaivmglvficvkngnmrctihhhhhh.
62.密码子优化后的na基因的核苷酸序列：
63.atgaaccctaaccagaagatcctgtgcacctccgctaccgctatcaccatcggtgctatcaccgtgctgatcggtatcgctaacctgggtctgaacatcggtctgcacctgaagtccggttgcaactgttcccgctcccaacctgagactaccaacacctcccagaccatcatcaacaactactacaacgagactaacatcaccaacatccagatggaggaacgcacctcccgcaacttcaacaacctgaccaagggtctgtgcaccatcaactcctggcacatctacggtaaggacaacgctgtgcgcattggtgaatcctccgacgttctggtgactcgcgagccttatgtgtcctgcgaccctgatgaatgccgcttctacgctctgtcccagggtactaccattcgcggtaagcactccaacggtactatccacgaccgttcccaataccgcgctctgatctcttggcctctgtcctctcctcctaccgtgtataactcccgcgtggagtgtattggttggtcctccacctcttgccacgatggtaagtcccgcatgtccatctgcatctccggtcctaacaacaacgcttccgctgtgatctggtacaaccgtcgccctgtggctgaaatcaacacctgggctcgcaacatcctgcgtacccaagagtctgagtgcgtgt
gccataacggtgtgtgccctgtggtgttcactgacggtcctgctactggtcctgctgatacccgcatctactacttcaaggagggtaagatcctgaagtgggagtccttgaccggcaccgctaagcacatcgaggagtgctcctgctatggtaagcgcaccggtattacttgtacctgccgcgacaattggcaaggttccaaccgccctgtgatccagattgaccctgtggctatgactcacacctcccagtacatctgctcccctgtgctgactgattcccctcgtcctaacgaccctaacatcggtaagtgcaacgacccttaccctggtaacaacaacaacggtgtgaagggtttctcctacctggacggtgacaacacttggctgggtcgtaccatttccaccgcttcccgttccggttacgagatgctgaaggtgcctaacgctctgactgacgaccgctccaagcctattcagggtcagaccatcgtgctgaacgctgactggtccggttactccggttccttcatggactactgggctgagggtgactgctatcgcgcttgcttctacgttgagctgatccgcggtaagcctaaagaggacaaggtgtggtggacctccaactccatcgtgtccatgtgctcctccaccgagtttctgggtcagtggaactggcctgacggtgctaagatcgagtacttcctgcaccaccaccaccaccactaa
64.na蛋白氨基酸序列：
65.mnpnqkilctsataitigaitvligianlglniglhlksgcncsrsqpettntsqtiinnyynetnitniqmeertsrnfnnltkglctinswhiygkdnavrigessdvlvtrepyvscdpdecrfyalsqgttirgkhsngtihdrsqyraliswplsspptvynsrvecigwsstschdgksrmsicisgpnnnasaviwynrrpvaeintwarnilrtqesecvchngvcpvvftdgpatgpadtriyyfkegkilkwesltgtakhieecscygkrtgitctcrdnwqgsnrpviqidpvamthtsqyicspvltdsprpndpnigkcndpypgnnnngvkgfsyldgdntwlgrtistasrsgyemlkvpnaltddrskpiqgqtivlnadwsgysgsfmdywaegdcyracfyvelirgkpkedkvwwtsnsivsmcssteflgqwnwpdgakieyflhhhhhh.
66.密码子优化后的m1基因的核苷酸序列：
67.atgtctctgctgaccgaggtggagacttacgtgctgtccatcatcccttccggtcctctgaaggctgagatcgctcagcgtctggaggatgtgttcgctggtaagaacgctgacctggaggctctgatggagtggatcaagacccgccctatcttgtcccctctgaccaagggtatcctgggtttcgtgttcaccctgaccgtgccttccgaacgtggtctgcaacgtcgtcgtttcgtgcagaacgctctgaacggtaacggtgaccctaacaacatggacaaggctgtgaagctgtacaagaagctgaagcgcgagatgaccttccacggtgctaaggaggtggctctgtcctattccaccggtgctctggcttcttgcatgggtctgatctacaaccgcatgggcaccgtgactgctgaaggtgctctgggtctggtttgtgctacctgcgagcagattgctgacgctcagcaccgttcccatcgtcaaatggctaccaccaccaaccctctgatccgccacgaaaaccgcatggtgctggcttctaccaccgctaaggctatggagcagatggctggttcctccgagcaagctgctgaggctatggaggtggcttcccaagctcgccagatggtgcaagctatgcgcactgtgggtactcaccctaactcctccaccggtctgaaggacgacctgatcgagaacctgcaggcttaccagaaccgcatgggtgttcaactgcagcgcttcaagcaccatcaccaccaccactaa
68.m1蛋白氨基酸序列：
69.mslltevetyvlsiipsgplkaeiaqrledvfagknadlealmewiktrpilspltkgilgfvftltvpserglqrrrfvqnalngngdpnnmdkavklykklkremtfhgakevalsystgalascmgliynrmgtvtaegalglvcatceqiadaqhrshrqmatttnplirhenrmvlasttakameqmagsseqaaeamevasqarqmvqamrtvgthpnsstglkddlienlqayqnrmgvqlqrfkhhhhhh.
70.(2)根据上述密码子优化后的ha、na、m1基因的核苷酸序列设计引物，以上述重组质粒为模板，进行对应基因扩增，其中，pcr反应体系(50μl)为：2
×
premix 25μl，ddh2o22μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板1μl；pcr仪运行程序为：变性98℃、10s，退火温度57℃、5s，延伸72℃、2min，30个循环；终延伸72℃，2min；4℃，保存；将pcr产物在琼脂糖凝胶上进
行电泳，电泳结束后切割目的条带，使用dna凝胶抽提试剂盒回收目的片段；
71.表1密码子优化后的ha、na、m1基因扩增引物信息
[0072][0073][0074]
注：gccgccacc(粗体)代表kozak序列；下划直线为酶切位点。
[0075]
(3)将步骤(2)回收的目的片段与pacebac1质粒(invitrogen公司)进行bamhi和ecori双酶切后进行连接，连接体系(10μl)如下：t4 dna连接酶1μl，10
×
buffer 1μl，目的片段酶切产物5μl，pacebac1质粒酶切产物3μl；将连接产物转化dh5α感受态细胞(invitrogen公司)，转化步骤如下：
①
冰浴静置30min，42℃水浴热激90s后立即冰浴2min；
②
无菌条件下向1.5ml ep管内加入800μl的无抗液体lb培养基，放置于恒温摇床中，37℃振荡(220rpm)45min；
③
将生长良好的菌液在生物安全柜中均匀涂布于含gen+抗性的固体lb培养基中，然后将细菌培养皿倒放置于37℃培养箱内，培养12～16h；使用质粒小提试剂盒提取质粒，酶切、电泳鉴定后测序，将序列保真的阳性质粒分别命名为pace
‑
ha、pace
‑
na、pace
‑
m1，其中，重组转递质粒pace
‑
ha、pace
‑
na、pace
‑
m1酶切鉴定结果如图1。
[0076]
(二)ha、na、m1基因重组杆状病毒质粒的构建
[0077]
将测序正确的重组转递质粒pace
‑
ha、pace
‑
na、pace
‑
m1转化dh10bac感受态细胞(invitrogen公司)，步骤如下：取1μl重组转递质粒与100μl dh10bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰上静置30min，42℃水浴热激45s后立即冰浴2min；加入900μl无抗lb液体培养基，37℃，220rpm振摇培养4h，使用无抗lb液体培养基对菌液进行10倍稀释，稀释到10
‑1、10
‑2、10
‑3，各取400μl菌液均匀涂布于三抗lb平板中，37℃温箱中放置48h；培养48h后，挑取白色单克隆菌落进行扩大培养，经pcr鉴定正确后提取质粒，得到重组杆状病毒质粒，分别命名为bacmid
‑
ha、bacmid
‑
na、bacmid
‑
m1。
[0078]
实施例2 ha、na和m1基因的重组杆状病毒的拯救
[0079]
(1)利用常规脂质体介导转染法，分别将实施例1制得的重组杆状病毒质粒bacmid
‑
ha、bacmid
‑
na、bacmid
‑
m1转染sf9昆虫细胞(invitrogen公司)，于27℃培养；培养至72h时，细胞出现病变，收集细胞培养上清，即分别获得第一代重组杆状病毒(p1)bv
‑
ha、bv
‑
na、bv
‑
m1；
[0080]
(2)将p1代重组杆状病毒接种sf9细胞，待细胞病变明显时，收集细胞上清(即p2代重组杆状病毒)，依次方法，继续获得p3代ha、na、m1重组杆状病毒。
[0081]
实施例3 h7n9
‑
vlp在昆虫细胞中的表达、优化及纯化
[0082]
(1)将p3代ha、na、m1重组杆状病毒按照moi＝7：4：2接种悬浮培养的high five细胞(invitrogen公司)，接种96h收获细胞，离心后分别获得细胞外培养上清和细胞；细胞重
悬后破碎，离心收获细胞内破碎上清；经测定细胞外培养上清中病毒样颗粒血凝效价为11log2，细胞内破碎上清血凝效价为13log2；
[0083]
(2)将p3代ha、na、m1重组杆状病毒按照moi＝3：3：2接种悬浮培养的high five细胞(invitrogen公司)，接种96h收获细胞，离心后分别获得细胞外培养上清和细胞；细胞重悬后破碎，离心收获细胞内破碎上清；经测定细胞外培养上清中病毒样颗粒血凝效价为9log2，细胞内破碎上清血凝效价为9log2；
[0084]
(3)将p3代ha、na、m1重组杆状病毒按照moi＝2：1：2接种悬浮培养的high five细胞(invitrogen公司)，接种96h收获细胞，离心后分别获得细胞外培养上清和细胞；细胞重悬后破碎，离心收获细胞内破碎上清；经测定细胞外培养上清中病毒样颗粒血凝效价为13log2，细胞内破碎上清血凝效价为13log2；
[0085]
(4)将p3代ha、na、m1重组杆状病毒按照moi＝2：1：2共感染high five细胞所收集的细胞外培养上清(步骤(3)制得)中的病毒样颗粒样品进行sds
‑
page和western blot分析鉴定，一抗为his标签单克隆抗体(his蛋白的his
‑
tag(4c2)monoclonal antiboby，bioword technology公司)，二抗为荧光标记的鼠二抗(800cw goat anti
‑
mouse igg(h+l)secondary antibody，li
‑
cor biosciences公司)。
[0086]
sds
‑
page和western blot结果如图2所示，ha蛋白约为70kda，na蛋白约为53kda，m1蛋白约为28kda。
[0087]
(5)使用蔗糖密度梯度离心法进行病毒样颗粒纯化
[0088]
配制不同浓度蔗糖溶液：配制20％、30％、45％、60％(m/v)蔗糖溶液，0.22μm滤器过滤；离心管从上至下分别加入20％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，最上方加入禽流感病毒样颗粒样品(步骤(3)所收集的细胞外培养上清)，100000
×
g，4℃离心1h；离心结束后，收取20％
‑
30％蔗糖层间的白色透明带；10000
×
g，4℃离心1.5h去除蔗糖；使用pbs缓冲液重悬禽流感病毒样颗粒，置于4℃保存。样品进行后续实验，并使用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，蛋白浓度约1.96mg/ml。
[0089]
实施例4透射电镜观察h7n9
‑
vlp的形态结构
[0090]
将实施例3纯化后的禽流感病毒样颗粒样品(h7n9
‑
vlp)滴加到碳涂层铜网上吸附，在室温下孵育2min。用吸水纸轻轻吸去铜网上的多余液体，干燥后用1wt.％的磷钨酸负染样品，并在室温下孵育10min；再用吸水纸缓慢吸弃铜网上多余的磷钨酸，室温晾干，在透射电子显微镜下可以观察到直径为100nm左右的、有囊膜、内部无遗传物质的圆形颗粒(图3)，囊膜上可见纤突，其形态特征与天然禽流感病毒高度相似，说明重组杆状病毒共感染成功组装成禽流感病毒样颗粒(h7n9
‑
vlp)。
[0091]
实施例5 h7n9
‑
vlp与白油佐剂制备的疫苗效力评估
[0092]
(1)疫苗的制备
[0093]
将实施例3中收获的h7n9
‑
vlp以免疫剂量与道达尔eolane 150佐剂按照1：2(v/v)的比例混合乳化，制备禽流感病毒样颗粒疫苗；其中，每0.3ml疫苗含有约30μg h7n9
‑
vlp抗原；
[0094]
(2)疫苗的免疫效力评估
[0095]
取30只3周龄spf鸡(购于广东省新兴大华农禽蛋有限公司，生产许可证号scxk(粤)2013
‑
0019)随机分为3组，10只/组。第1组经颈部皮下注射禽流感全病毒灭活疫苗(疫
苗来源是市场购买，产品由广州市华南农大生物药品公司生产)，0.3ml/只；第2组经颈部皮下注射禽流感病毒样颗粒疫苗，0.3ml/只(0.3ml疫苗含有约30μg h7n9
‑
vlp)；第3组注射pbs作为空白对照。免疫后第3周对所有试验鸡采血并分离血清，免疫血清进行血凝抑制(hi)抗体检测，a/chicken/guangdong/16876/2016(h7n9)毒株(即为gd16株，均由华南农业大学兽医学院禽病研究室提供，已在参考文献“叶贺佳,仇微红,亓文宝,等.h7n9亚型重组禽流感病毒rgd76株灭活疫苗的研制[j].动物医学进展,2019,040(008):44
‑
48.”中公开)灭活后作为四单位抗原。免疫后3周，使用a/chicken/guangdong/16876/2016(h7n9)毒株进行攻毒，滴鼻接种，0.2ml/只(含2
×
10
6.0
eld
50
)。攻毒后每日观察试验鸡的发病或死亡情况并及时记录，持续14日，并于攻毒后第5日采集试验鸡喉头和泄殖腔拭子进行病毒分离，统计疫苗保护情况。结果见表2。
[0096]
表2疫苗免疫效力结果
[0097][0098]
结果显示，免疫后3周，疫苗组平均hi抗体滴度均在6log2以上；攻毒后，未免疫组在攻毒后2天内全部死亡，疫苗组在攻毒后14天内未出现临床症状，h7n9亚型病毒样颗粒疫苗组在攻毒后第5天仅检测到1只鸡咽喉排毒。
[0099]
实施例6 h7n9
‑
vlp与montanide
tm isa 71vg佐剂制备的疫苗效力评估
[0100]
(1)疫苗的制备
[0101]
将实施例3中收获的h7n9
‑
vlp以免疫剂量与montanide
tm isa 71vg佐剂按照3：7(v/v)的比例混合乳化，制备禽流感病毒样颗粒疫苗；其中，每0.3ml疫苗含有约30μg h7n9
‑
vlp抗原。
[0102]
(2)疫苗的免疫效力评估
[0103]
取20只3周龄spf鸡随机分为2组，10只/组。10只鸡经肌肉注射禽流感病毒样颗粒疫苗，0.3ml/只(0.3ml疫苗含有约30μg h7n9
‑
vlp)；另10只鸡注射pbs溶液作为空白对照，0.3ml/只。
[0104]
①
抗体水平检测
[0105]
所有试验鸡在免疫后第14和19天采血并分离血清。为评估疫苗血清的交叉反应性，将免疫血清分别与野生型的h7n9禽流感毒株进行交叉反应性试验，测定血凝抑制抗体(hi)和中和抗体水平。所用毒株包括：a/chicken/guangdong/e157/2017(h7n9)(即e157株，已在申请号为“201910117092.4”、申请名称为“基于multibac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗及制备与应用”中公开)和a/chicken/qingyuan/e664/2017(h7n9)(由华南农业大学兽医学院禽病研究室提供)。hi和中和抗体结果见图4。
[0106]
结果如图4所示，疫苗血清针对不同野生型的h7n9禽流感野毒株均具有良好的交叉反应性。针对a/chicken/guangdong/e157/2017(h7n9)毒株，免疫后19天，平均hi效价达6.875log2，平均中和抗体效价达1：1706.67；针对a/chicken/qingyuan/e664/2017(h7n9)
毒株，免疫后19天，平均hi效价达8log2，平均中和抗体效价达1：3413.33。
[0107]
②
攻毒保护实验
[0108]
免疫后3周，使用a/chicken/guangdong/e157/2017(h7n9)毒株以10
6.0
eid
50
进行攻毒，滴鼻接种，0.2ml/只。攻毒后每日观察试验鸡的发病或死亡情况并及时记录，持续14日，并于攻毒后3、5、7、9日采集试验鸡喉头和泄殖腔拭子进行病毒分离，统计疫苗保护情况。结果见表3。
[0109]
表3疫苗攻毒保护结果
[0110][0111]
注：dpc：days post challenge.
[0112]
结果显示未免疫组在攻毒后3天内全部死亡，疫苗组spf鸡在攻毒后14天内未出现临床症状，全部存活，仅第9天检测到1只鸡排毒。结果表明h7n9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗针对野生型h7n9亚型禽流感病毒的攻击能够提供完全的临床保护且显著抑制排毒。
[0113]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。