生物标志物在制备或筛选结直肠癌诊断试剂中的用途的制作方法

1.本发明涉及医学领域，具体涉及生物标志物在制备或筛选结直肠癌诊断试剂中的用途。


背景技术：

2.结肠直肠癌(crc，carcinoma of colon and rectum)是全世界最常见的癌症之一，随着每年都有1百万至2百万诊断病例的增加，使crc成为第三大常见的癌症和第四大致死癌症。当前结直肠癌最主要的治疗手段是外科手术、辅助放射治疗以及辅助化疗(患者为iii、iv期或高风险的ii期结肠癌)。在生存期方面，i期患者的5年生存率可达90％以上，而iv期患者只有大约10％的生存率。


技术实现要素：

3.根据第一方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症诊断试剂中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam。
4.根据第二方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症治疗药物中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam。
5.根据第三方面，在一实施例中，提供一种计算癌症风险值的方法，包括：
6.表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam；
7.风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值。
8.根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于预测癌症风险的装置，包括：
9.表达量计算模块，用于计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam；
10.风险值计算模块，用于根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
11.判断模块，用于根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
12.根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：
13.存储器，用于存储程序；
14.处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现癌症风险预测，预测方法包括：
15.表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam；
16.风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
17.判断步骤，包括根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
18.根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有
程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第三方面或第五方面所述方法。
19.依据上述实施例的生物标志物在制备或筛选结直肠癌诊断试剂中的用途，本发明提供的生物标志物可以用于对患者预后进行有效的监测预警。
附图说明
20.图1为预测因子在原位肿瘤中的表达水平图。
21.图2为预测因子在正常结直肠组织(colorectum)、癌旁组织(adjacent normal)、结直肠癌(crc)中基因表达的降维分析图。
22.图3为预测因子与患者的生存曲线分析图。
具体实施方式
23.下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
24.另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
25.本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
26.如本文所用，“生物标志物”(biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。本文中，“生物标志物”、“预测因子”、“分子标志物”可互换使用。生物标志物具体可以为表达特定蛋白的特定基因。
27.对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。
28.生物标志物是生物体受到严重损害之前，在不同生物学水平(分子、细胞、个体等)上因受环境污染物影响而异常化的信号指标。它可以对严重毒性伤害提供早期警报。这种信号指标可以是细胞分子结构和功能的变化、可以是某一生化代谢过程的变化或生成异常的代谢产物或其含量，可以是某一生理活动或某一生理活性物质的异常表现，可以是个体表现出的异常现象，可以是种群或群落的异常变化，可以是生态系统的异常变化。
29.如本文所用，术语“表达水平”等同于“表达谱，”“表达谱”是指从待测样本(例如肿瘤组织)获得的一种或多种蛋白(即基因产物)的表达水平。对于从待测样本中回收的基因产物，表达水平可以表示为每ml待测样本中特定多肽的质量或任何其他合适的单位。类似单位可用于从其他待测样本获得的基因产物。基因产物的表达可使用任何合适的方法(例如，如下所述)确定。通常对测量值进行归一化，以解释样本数量和质量、逆转录效率等方面的变化。当表达谱反映来自多个不同基因产物(例如，不同基因的rna转录物，主要为mrna转录物)的表达时，在生成或比较表达谱或参考谱时，可以赋予基因产物不同的权重。
30.如本文所用，hmgb1基因编码一种属于高迁移率族box超家族的蛋白质。编码的非组蛋白，核dna结合蛋白调节转录，并参与dna的组织。该蛋白在多种细胞过程中发挥作用，包括炎症、细胞分化和肿瘤细胞迁移。已鉴定出该基因的多个假基因。选择性剪接导致编码相同蛋白质的多个转录变体。(由refseq提供，2015年9月)
31.如本文所用，hmgb1基因为编码高迁移率族蛋白b1的基因，高迁移率族蛋白b1是一种高度保守的核蛋白，广泛分布于哺乳动物细胞。
32.如本文所用，slc12a2基因编码的蛋白质介导钠和氯的转运和再吸收。编码的蛋白质是一种膜蛋白，对维持适当的离子平衡和细胞体积很重要。这种蛋白质在dna损伤时被磷酸化。已发现编码该基因两种不同亚型的三种转录变体。(由refseq提供，2012年1月)
33.如本文所用，krt15基因编码的蛋白质是角蛋白基因家族的成员。角蛋白是负责上皮细胞结构完整性的中间丝蛋白，分为细胞角蛋白和毛发角蛋白。大多数i型细胞角蛋白由酸性蛋白质组成，这些蛋白质排列成一对异型角蛋白链，聚集在染色体17q21.2上的一个区域。(由refseq提供，2008年7月)
34.如本文所用，krt8基因是聚集在12号染色体长臂上的ii型角蛋白家族成员。i型和ii型角蛋白在上皮细胞的细胞质中异源聚合形成中等大小的丝。该基因的产物通常与角蛋白18二聚，在简单的单层上皮细胞中形成中间丝。该蛋白在维持细胞结构完整性以及信号转导和细胞分化中起作用。该基因突变导致隐源性肝硬化。已发现该基因的选择性剪接转录变体。(由refseq提供，2012年1月)
35.如本文所用，ephb2基因编码受体酪氨酸激酶跨膜糖蛋白eph受体家族的一个成员。这些受体由n端糖基化配体结合域、跨膜区和细胞内激酶域组成。它们结合称为ephrins的配体，参与多种细胞过程，包括运动、分裂和分化。eph-ephrin信号的一个显著特征是受体和配体都有能力转导信号级联，从而产生双向信号。这种蛋白质属于称为ephb的eph受体亚群。通过序列同源性和膜结合ephrin-b配体的优先结合亲和力，该亚群的蛋白质与该家族的其他成员不同。等位基因变异与前列腺癌和脑癌易感性相关。选择性剪接导致多个转录变体。(由refseq提供，2015年5月)
36.如本文所用，lgr5基因编码的蛋白质是一种富含亮氨酸重复序列的受体(lgr)，属于g蛋白偶联的7-跨膜受体(gpcr)超家族成员。编码的蛋白质是r-海绵蛋白的受体，参与典型的wnt信号通路。在胚胎后发育过程中，这种蛋白在成人肠道干细胞的形成和维持中起作用。已发现编码该基因不同亚型的几种转录变体。(由refseq提供，2015年9月)
37.如本文所用，e2f1基因编码的蛋白质是e2f转录因子家族的成员。e2f家族在控制细胞周期和肿瘤抑制蛋白的作用中起着关键作用，也是小dna肿瘤病毒转化蛋白的靶标。e2f蛋白包含在该家族大多数成员中发现的几个进化上保守的结构域。这些结构域包括dna
结合结构域、决定与分化调节转录因子蛋白(dp)相互作用的二聚化结构域、富含酸性氨基酸的反式激活结构域以及嵌入反式激活结构域内的肿瘤抑制蛋白结合结构域。该蛋白和另外2个成员e2f2和e2f3具有额外的细胞周期蛋白结合域。该蛋白以细胞周期依赖的方式优先与视网膜母细胞瘤蛋白prb结合。它可以介导细胞增殖和p53依赖/非依赖性凋亡。(由refseq提供，2008年7月)
38.如本文所用，cd133基因编码一种五跨跨膜糖蛋白。该蛋白定位于膜突起，通常在成体干细胞上表达，被认为通过抑制分化来维持干细胞特性。该基因突变已被证明会导致视网膜色素变性和stargardt病。该基因的表达也与几种类型的癌症有关。该基因由至少五种以组织依赖性方式表达的替代启动子表达。已发现编码该基因不同亚型的多个转录变体。(由refse q提供，2009年3月)
39.如本文所用，c-myc基因是一个原癌基因，编码一种核磷蛋白，在细胞周期进展、凋亡和细胞转化中发挥作用。编码蛋白与相关转录因子max形成异二聚体。该复合物与e盒d na共有序列结合并调节特定靶基因的转录。在许多人类癌症中经常观察到该基因的扩增。涉及该基因的易位与人类伯基特淋巴瘤和多发性骨髓瘤相关。有证据表明，翻译起始于上游、帧内非aug(cug)和下游aug起始位点，导致产生两种具有不同n-末端的异构体。(由refseq提供，2017年8月)
40.epcam基因编码癌相关抗原，是至少包含两种i型膜蛋白的家族成员。这种抗原在大多数正常上皮细胞和胃肠道癌上表达，并作为一种同型钙非依赖性细胞粘附分子发挥作用。这种抗原正被用作人类癌症免疫治疗的靶点。该基因突变导致先天性簇状肠病。(由refseq提供，2008年12月)
41.gapdh基因编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白家族的一个成员。基于其执行机械不同功能的能力，编码的蛋白质已被鉴定为兼职蛋白质。该基因的产物催化碳水化合物代谢中重要的能量产生步骤，即在无机磷酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)存在下甘油醛-3-磷酸的可逆氧化磷酸化。该编码蛋白还被鉴定为在细胞核中具有尿嘧啶dna糖苷酶活性。此外，这种蛋白质含有一种对大肠杆菌具有抗菌活性的肽。大肠杆菌。铜绿假单胞菌和c。白色念珠菌。对小鼠中类似蛋白质的研究赋予了多种额外功能，包括核蛋白的亚硝基化、mrna稳定性的调节以及作为巨噬细胞细胞表面的转铁蛋白受体。在人类基因组中存在许多类似于该位点的假基因，选择性剪接导致多个转录变体。(由refseq提供，2014年11月)
42.根据第一方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症诊断试剂中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam。
43.我们通过对原位肿瘤组织进行转录组测序和蛋白芯片分析，发现在肿瘤中高表达的转录因子、表面粘附分子的编码基因hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam(转录因子：hmgb1、e2f1、c-myc，其他为细胞表面分子)，与患者的生存曲线具有显著相关性。因而对患者肿瘤组织中关键基因进行针对性检测，可以有效地对患者预后进行监测预警。上述10个基因可以作为标志物，用于辅助预测结直肠癌患者的术后生存时间。还可以构建包含上述10因子的检测试剂盒，用于辅助诊断结直肠癌癌患者的术后预后。
44.在一实施例中，所述生物标志物包含如下基因中的全部：hmgb1、slc12a2、krt15、
krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam。
45.在一实施例中，所述生物标志物包含待测样本中所述基因的表达水平。
46.在一实施例中，所述生物标志物包含待测样本中所述基因相对于参考基因的表达水平。
47.在一实施例中，所述参考基因包含在细胞中组成型、稳定表达的基因。
48.在一实施例中，所述参考基因包含内参基因。
49.在一实施例中，所述内参基因包括不限于gapdh基因、actin基因、tubulin基因中的至少一种。
50.在一实施例中，所述癌症包括但不限于结肠癌、直肠癌中的至少一种。
51.在一实施例中，根据待测样本中所述基因的相对表达量，计算风险值，根据所述风险值，评估受试者癌症复发的风险。
52.在一实施例中，根据所述风险值与阈值的大小关系，评估受试者首次患癌和/或复发的风险。
53.在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险，如果风险值≤阈值，则预测为低风险。
54.在一实施例中，所述风险值＝[rq
(hmgb1)
*rq
(slc12a2)
*rq
(krt15)
*rq
(krt8)
*rq
(ephb2)
*rq
(lgr5)
*rq
(e2f1)
*rq
(cd133)
*rq
(c-myc)
*rq
(epcam)
]/α，α为非零常数，rq表示对应基因相对于参考基因的相对表达量。
[0055]
在一实施例中，rq＝2-δδct
，δδct＝(待测样本中靶基因pcr循环数-参考基因pcr循环数)-(对照样本中靶基因pcr循环数-参考基因pcr循环数)。
[0056]
在一实施例中，所述pcr循环数是通过实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr)检测得到。
[0057]
实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr)是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。
[0058]
real-time pcr是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
[0059]
在一实施例中，α可以为11.16。α为经验常数，可以根据自测序的样本测序数据以及tcga数据库中的测序数据得到。
[0060]
在一实施例中，所述待测样本包括肿瘤组织样本。肿瘤组织样本通常为实体肿瘤组织。
[0061]
在一实施例中，所述对照样本包括正常组织样本。
[0062]
在一实施例中，所述正常组织样本包括但不限于癌旁组织样本、其他正常的非癌旁组织样本。癌旁组织样本为实体组织块。
[0063]
根据第二方面，在一实施例中，提供生物标志物在制备或筛选癌症治疗药物中的用途，所述生物标志物包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam。
[0064]
在一实施例中，所述生物标志物包含如下基因中的全部：hmgb1、slc12a2、krt15、
krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam。
[0065]
在一实施例中，所述生物标志物包含待测样本中所述基因的表达水平。
[0066]
在一实施例中，所述生物标志物包含待测样本中所述基因相对于参考基因的相对表达水平。
[0067]
在一实施例中，所述癌症包括但不限于结肠癌、直肠癌中的至少一种。
[0068]
根据第三方面，在一实施例中，提供一种计算癌症风险值的方法，包括：
[0069]
表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam；
[0070]
风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值。该风险值为中间结果，并且，待测样本为离体样本，因此，计算患癌风险值的方法不属于疾病的诊断、治疗方法。
[0071]
在一实施例中，所述靶基因包含如下基因中的全部：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam。
[0072]
在一实施例中，所述靶基因的表达量包含靶基因相对于参考基因的相对表达量。
[0073]
在一实施例中，所述靶基因的相对表达量rq＝2-δδct
，δδct＝(待测样本中靶基因pcr循环数-参考基因pcr循环数)-(对照样本中靶基因pcr循环数-参考基因pcr循环数)。
[0074]
在一实施例中，所述癌症包括但不限于结肠癌、直肠癌中的至少一种。
[0075]
在一实施例中，所述风险包括复发风险。
[0076]
在一实施例中，所述风险值＝[rq
(hmgb1)
*rq
(slc12a2)
*rq
(krt15)
*rq
(krt8)
*rq
(ephb2)
*rq
(lgr5)
*rq
(e2f1)
*rq
(cd133)
*rq
(c-myc)
*rq
(epcam)
]/α，α为非零常数，rq表示对应基因相对于参考基因的相对表达量。
[0077]
在一实施例中，还包括信号采集步骤，包括采集信号，并根据所述信号计算得到靶基因和/或参考基因的pcr循环数。
[0078]
在一实施例中，所述信号包含荧光信号。
[0079]
根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于预测癌症风险的装置，包括：
[0080]
表达量计算模块，用于计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam；
[0081]
风险值计算模块，用于根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
[0082]
判断模块，用于根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
[0083]
在一实施例中，所述靶基因包含如下基因中的全部：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam。
[0084]
在一实施例中，所述靶基因的表达量包含靶基因相对于参考基因的相对表达量。
[0085]
在一实施例中，所述靶基因的相对表达量rq＝2-δδct
，δδct＝(待测样本中靶基因pcr循环数-参考基因pcr循环数)-(对照样本中靶基因pcr循环数-参考基因pcr循环数)。
[0086]
在一实施例中，所述癌症包括但不限于结肠癌、直肠癌中的至少一种。
[0087]
在一实施例中，所述风险包括复发风险。
[0088]
在一实施例中，所述风险值＝[rq
(hmgb1)
*rq
(slc12a2)
*rq
(krt15)
*rq
(krt8)
*rq
(ephb2)
*rq
(lgr5)
*rq
(e2f1)
*rq
(cd133)
*rq
(c-myc)
*rq
(epcam)
]/α，α为非零常数，rq表示对应基因相对于参考基因的相对表达量。
[0089]
在一实施例中，根据风险值与阈值的大小关系，预测受试者患癌风险。
[0090]
在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险；如果风险值≤阈值，则预测为低风险。
[0091]
在一实施例中，还包括信号采集模块，用于采集信号，并根据所述信号计算得到靶基因和/或参考基因的pcr循环数。
[0092]
在一实施例中，所述信号包含荧光信号。
[0093]
根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：
[0094]
存储器，用于存储程序；
[0095]
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现癌症风险预测，预测方法包括：
[0096]
表达量计算步骤，包括计算靶基因的表达量，所述靶基因包含如下基因中的至少一种：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam；
[0097]
风险值计算步骤，包括根据所述靶基因的表达量，计算得到风险值；
[0098]
判断步骤，包括根据所述风险值，预测受试者患癌风险。
[0099]
在一实施例中，所述靶基因包含如下基因中的全部：hmgb1、slc12a2、krt15、krt8、ephb2、lgr5、e2f1、cd133、c-myc、epcam。
[0100]
在一实施例中，所述靶基因的表达量包含靶基因相对于参考基因的相对表达量。
[0101]
在一实施例中，所述靶基因的相对表达量rq＝2-δδct
，δδct＝(待测样本中靶基因pcr循环数-参考基因pcr循环数)-(对照样本中靶基因pcr循环数-参考基因pcr循环数)。
[0102]
在一实施例中，所述癌症包括但不限于结肠癌、直肠癌中的至少一种。
[0103]
在一实施例中，所述风险包括复发风险。
[0104]
在一实施例中，所述风险值＝[rq
(hmgb1)
*rq
(slc12a2)
*rq
(krt15)
*rq
(krt8)
*rq
(ephb2)
*rq
(lgr5)
*rq
(e2f1)
*rq
(cd133)
*rq
(c-myc)
*rq
(epcam)
]/α，α为非零常数，rq表示对应基因相对于参考基因的相对表达量。
[0105]
在一实施例中，根据风险值与阈值的大小关系，预测受试者患癌风险。
[0106]
在一实施例中，如果风险值＞阈值，则预测为高风险；如果风险值≤阈值，则预测为低风险。
[0107]
在一实施例中，还包括信号采集步骤，包括采集信号，并根据所述信号计算得到靶基因和/或参考基因的pcr循环数。
[0108]
在一实施例中，所述信号包含荧光信号。
[0109]
根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第三方面或第五方面所述方法。
[0110]
实施例1
[0111]
本实施例使用的试剂盒包含：
[0112]
trizol裂解液(invitrogen,15596-026)；
[0113]
rnase-free匀浆器；
[0114]
rnase-free 1.5毫升管；
[0115]
氯仿；
[0116]
异丙醇；
[0117]
洗涤液(rnase-free水配制的75％v/v乙醇)；
[0118]
rnase-free水；
[0119]
逆转录试剂混合物(10μl/管，takara，rr047a)；
[0120]
q-pcr试剂混合物(takara，639676)；
[0121]
引物稀释液(含有引物的水溶液)。
[0122]
操作方法如下：
[0123]
1、肿瘤样本制备：对于有多个结直肠癌灶点的患者，每个灶点取一块肿瘤(50毫克/份)，总取3个灶点；对于少于3个结直肠癌灶点的患者，则随机取3个肿瘤块(50毫克/份)；肿瘤组织标记为crc1、crc2、crc3。随机取3块癌旁组织(50毫克/份)，标记nor1、nor2、nor3。
[0124]
2、用消毒灭菌的剪刀将组织尽可能剪碎，加入200微升trizol裂解液。
[0125]
3、用移液枪将上述组织碎片裂解液混合物转移至rnase-free匀浆器中，将组织碎片磨碎直到没有明显颗粒状组织。
[0126]
4、加入800微升trizol裂解液，将组织裂解液转移到新的rnase-free 1.5毫升管，用移液枪反复吹打10次，混匀，常温静置5分钟。
[0127]
5、向组织裂解液中加入200微升氯仿，盖上盖，上下用力摇动使液体混匀，常温静置5分钟。
[0128]
6、将上述组织裂解液于4℃、12000
×
g条件下离心20分钟。
[0129]
7、离心结束后，用移液枪吸取上清200微升到新的rnase-free 1.5毫升管。
[0130]
8、向上述上清中加入200微升异丙醇，盖上盖，上下摇动使液体混匀，常温静置10分钟。
[0131]
9、将上述液体于4℃、12000
×
g条件下离心10分钟。
[0132]
10、去掉上清液，管底可见白色沉淀，向沉淀中加入500微升洗涤液，盖上盖，上下用力摇动试管3次。
[0133]
11、将上述液体于4℃、6000
×
g条件下离心5分钟。
[0134]
12、去掉上清液，将试管开盖置于通风橱10分钟。
[0135]
13、加入50～100微升rnase-free水，60℃水浴5分钟。
[0136]
14、高速离心试管1分钟，收集液体于管底。
[0137]
15、测量rna浓度，置于冰盒或4℃冰箱待用。
[0138]
步骤1～15可用市场上现有的全自动核酸提取工作站完成，本实施例未使用全自动核酸提取工作站，为手动完成。
[0139]
16、对于同一患者或同一批检测，使用同一质量的rna(总rna)进行逆转录(模板量可以为100ng～1000ng，本实施例具体为500ng)。
[0140]
17、向逆转录试剂混合物(10μl/管)中加入待检测rna，并加入rnase-free水，补足至20微升。补充rnase-free水的体积(μl)＝10-rna质量(ng)/rna浓度(ng/μl)。
[0141]
18、在pcr仪器中进行逆转录反应，反应条件如下：
[0142]
25℃，10分钟；
[0143]
42℃，30分钟；
[0144]
85℃，5分钟；
[0145]
结束。
[0146]
19、q-pcr反应
[0147]
配制如下反应体系：步骤18获得的逆转录反应液1μl、引物混合物0.5μl、rox混合物0.5μl、q-pcr反应混合物8μl。每个反应设置3个重复。
[0148]
q-pcr反应过程如下：
[0149]
(a)95℃，3分钟；
[0150]
(b)95℃，5秒；
[0151]
(c)60℃，30秒；步骤b、c重复40次；
[0152]
(d)72℃，30秒(信号收集)；
[0153]
(e)72℃，5分钟；
[0154]
(f)熔解曲线(melting curve)生成反应。
[0155]
反应结束后，进入后续计算步骤。
[0156]
20、计算
[0157]
按如下公式进行计算：rq＝2-δδct
。
[0158]
rq：相对表达量。
[0159]
δct＝肿瘤样本(crc)靶基因pcr循环数-内参pcr循环数。
[0160]
δδct＝[肿瘤样本(crc)靶基因pcr循环数-内参pcr循环数]-[对照样本(nor)靶基因pcr循环数-内参pcr循环数]。
[0161]
21、复发风险值：
[0162]
risk＝rq
(hmgb1)
×
rq
(slc12a2)
×
rq
(krt15)
×
rq
(krt8)
×
rq
(ephb2)
×
rq
(lgr5)
×
rq
(e2f1)
×
rq
(cd133)
×
rq
(c-myc)
×
rq
(epcam)
/11.16。
[0163]
22、判定方法
[0164]
如果risk＞100，则为高风险，表明预后可能不乐观，需要积极复查，密切关注肿瘤状况。如果risk≤100，则为低风险。
[0165]
23、引物序列
[0166]
引物序列如表1所示。
[0167]
表1
[0168][0169]
gapdh为内参基因。
[0170]
图1为预测因子在原位肿瘤中的表达水平图，纵坐标为log2(tpm+1)，tpm:transcripts per million reads，可见，每一种因子在肿瘤组织样本(tumor)、癌旁组织样本(normal)样本中的表达水平均具有显著差异。
[0171]
图2为预测因子在正常结直肠组织(colorectum，为tcga数据库中的数据)、癌旁组织(adjacent normal)、结直肠癌(crc)中基因表达的降维分析图，可见，我们选择的预测因子在结直肠癌中的表达与正常结直肠组织、癌旁组织中的表达具有显著差异。
[0172]
图3为预测因子与患者的生存曲线分析图(共273例样本，其中有50例为自测序，另外223例的测序数据来自tcga数据库)，横坐标为月数(months)，纵坐标为生存率(percent survival)，靠近横坐标的实线为十因子高表达组，远离横坐标的实线为十因子低表达组，可见，高表达我们所选择的预测因子的患者五年生存率显著低于低表达预测因子的患者。
[0173]
本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。
[0174]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单
推演、变形或替换。