奶牛瘤胃上皮组织体外培养体系的构建方法

1.本发明属于动物组织培养领域，涉及一种奶牛瘤胃上皮组织体外培养体系的构建方法。


背景技术：

2.近年来，我国畜牧业一直在快速的发展，尤其是牛，羊等反刍动物的养殖。养殖模式从最初的“分散化、低效率”向着“集中化、高效率”的方向转变。但是在养殖生产的过程中，出现了许多营养代谢紊乱导致的繁殖能力低下等问题。因此，如何能够在保证生产效益的前提下，安全高效的解决养殖过程中出现的问题，提高反刍动物生产效率，成为了很多学者最为关注的内容。
3.解决养殖过程中出现的问题，以反刍动物为试验对象是最直接高效的方法。但在试验动物需求量较大时，直接利用反刍动物进行试验的花费是十分昂贵的。因此，现在许多反刍动物营养研究都是通过饲喂某种添加剂，观察某些生理指标的变化。或者利用少量动物，在饲喂一定周期后屠宰，采取瘤胃，肠道等组织观察形态变化，从而评价添加剂的作用效果，而直接利用大量反刍动物的研究还是较少的。于是，为了探索某些添加剂或者营养素的作用效果以及影响机制，一些学者开始使用价格低廉，获取途径简单，模拟效果好的反刍动物外植体进行试验。
4.在奶牛的生产养殖过程中，出现的各种营养代谢紊乱与繁殖能力低下等问题与瘤胃是分不开的，直接利用价值比较高的奶牛进行试验，不仅花费十分昂贵，还会影响动物福利。为了解决这些问题，建立了奶牛瘤胃外植体的培养方法。利用这个方法，既能够减少实验经费的大量支出，降低试验成本，又能够避免活体实验时可能突发的状况，降低实验风险，同时也减少了活体实验动物的消耗。
5.到目前为止，国内外只有关于山羊的瘤胃外植体的培养技术，羊瘤胃细胞具有细胞系，能够连续传代，而奶牛瘤胃细胞不具有细胞系。因此，羊瘤胃外植体的培养技术不是适合于奶牛的瘤胃组织培养，而目前关于奶牛瘤胃的培养技术方法还不曾建立。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种奶牛瘤胃上皮组织体外培养体系的构建方法，克服目前实验需要屠宰奶牛，实验成本昂贵的问题。
7.本发明通过以下技术方案来实现：一种奶牛瘤胃上皮组织体外培养体系的构建方法，该方法包括以下步骤：
8.(1)采样：采取奶牛瘤胃，用生理盐水冲洗，然后浸泡在配置有双抗的pbs里，保持37℃左右；
9.(2)瘤胃上皮组织的分离：将取来的瘤胃用生理盐水洗去瘤胃内容物，用镊子钝性分离肌层和浆膜层，在分离过程中尤其注意瘤胃上皮的完整性，留下浆膜层，用含有双抗的pbs洗涤浆膜层3到4次，洗至表面无杂物，再用剪刀镊子将分离的组织分割成2mm
×
2mm的小
块；再将小块放入24孔细胞培养板中，每孔放2块组织小块，带乳头一侧朝上放置，孔内加入2.5ml培养基，所述的培养基为培养基a或培养基b中的任意一种；
10.(3)瘤胃上皮组织的的培养：将加完样品的24孔板放入co2恒温培养箱中，培养时间0-72h，然后将组织放入到离心管中-80℃保存。
11.进一步的，所述的有双抗的pbs的组方：pbs溶液加入庆大霉素2ml，两性霉素b2ml，双抗50ml，总量1000ml。
12.进一步的，所述的培养基a的组方：45ml dmem/f12培养基,5ml双抗，200ul浓度为2mg/l的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂，500ul l-谷氨酰胺，50ul两性霉素b，以及5ml的热灭活血清，总量50ml。
13.进一步的，所述的培养基b的组方：45ml dmem/f12培养基,5ml双抗，200ul胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂，500ul l-谷氨酰胺，50ul两性霉素b，总量50ml。
14.进一步的，所述的两性霉素b溶液的配置方法为：将25mg两性霉素b溶于10ml蒸馏水中，溶解后将其浓度调节至2.5mg/ml，过滤，-20℃保存。
15.进一步的，步骤(2)中所述的培养基为培养基a。
16.进一步的，步骤(3)中培养时间为4-12h。
17.采用上述技术方案的积极效果：本发明通过多次对试剂和培养基成分配比的优化，以及瘤胃组织培养条件的研究，利用荧光定量pcr的方法来检测瘤胃组织中e-钙粘附蛋白基因的表达，利用mtt和he染色检测组织的活性，从而确定瘤胃外植体存活的时间以及活性的强弱变化规律，从而得到培养瘤胃外植体各试剂的最佳成分；本发明提供了一种奶牛瘤胃上皮组织体外培养体系，利用屠宰场的正常屠宰的奶牛的瘤胃上皮组织作为外植体，进行体外实验，不用专门的屠宰奶牛，能够大量的节约实验成本，具有非常大的应用价值和市场价值。
附图说明
18.图1是β－actin、e-cadherin pcr产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，a:β－actin pcr扩增产物电泳结果，b:e-cadherin pcr扩增产物电泳结果，m:dl2 000marker；s1～s9:pcr扩增产物；
19.图2是不同培养时间e-钙粘附蛋白mrna相对表达量；
20.图3是不同培养基、培养时间的瘤胃组织he染色结果，其中，培养基a：含10％的血清；培养基b：不含血清；
21.图4是不同培养基对组织活性的影响，其中，1-3：对照组；a1-a3：培养基a；b1-b3：培养基b。
具体实施方式
22.下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
23.实施例1
24.本实施例说明奶牛瘤胃上皮组织体外培养体系的构建方法。
25.1、采样：出发前先将所需的试剂准备好，并准备好剪子，镊子和手套。泡沫箱中放
置冰袋(提前放置37℃恒温箱)，pbs要保持在37℃水平。在采取瘤胃后，先冲洗，然后浸泡在配置有双抗的pbs里，泡沫箱带回，整个过程中为了尽量保持瘤胃的活性，瘤胃组织要保存在37℃左右，延缓活性降低。
26.2、瘤胃上皮组织的分离：将取来的瘤胃用生理盐水洗去瘤胃内容物，用镊子钝性分离肌层和浆膜层，在分离过程中尤其注意瘤胃上皮的完整性，留下浆膜层，并用含抗生素的pbs(37℃)洗涤浆膜层3到4次，洗至表面无杂物，再用剪刀镊子将分离的组织分割成统一小块若干，小块的尺寸为2mm
×
2mm。再将小块放入24孔细胞培养板中，每孔放2块组织小块，带乳头一侧朝上放置，孔内分别加入2.5ml培养基a、培养基b。
27.3、瘤胃上皮组织的的培养：将加完样品的24孔板放入co2恒温培养箱中，并分别培养0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、48h、72h，并在每个时间点收取样品，用灭过菌的镊子将组织放入到离心管中，用于he染色的组织加入4％多聚甲醛，剩余组织放入-80℃冰箱中保存，等待后续步骤。
28.有双抗的pbs的组方：pbs溶液加入庆大霉素2ml，两性霉素b2ml，双抗50ml，总量1000ml。
29.培养基a的组方：45ml dmem/f12培养基,5ml双抗，200ul胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(2mg/l)，500ul l-谷氨酰胺，50ul两性霉素b，以及5ml的热灭活血清，总量50ml。
30.培养基b的组方：45ml dmem/f12培养基，5ml双抗，200ul浓度为2mg/l的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂，500ul l-谷氨酰胺，50ul两性霉素b，总量50ml。
31.其中，两性霉素b溶液的配置方法为：将25mg两性霉素b溶于10ml蒸馏水中，溶解后将其浓度调节至2.5mg/ml，过滤，-20℃保存。
32.实施例2
33.本实施例说明检测e-钙粘附蛋白基因的表达。
34.一、组织rna的提取
35.从-80℃冰箱中取出冻存的奶牛瘤胃外植体：
36.(1)每个离心管内加入3颗小钢珠，500ul trizol以及100ul氯仿，剧烈震荡20min后，常温静置10min。
37.(2)置于高速离心机中4℃离心，12000r/min，10min，此时离心管内液体分为三层，上层：rna,中层：蛋白,下层：dna)，用无rna移液枪收集rna,100ul-120ul上清即可，勿吸到膜。
38.(3)在收集上清的离心管中再加入250ul的异丙醇，上下摇晃混匀，再置于冰上5-10min。
39.(4)再将离心管置于高速离心机中，12000r/min，10min，离心结束后，弃去管中上清液，直接倾倒即可。
40.(5)加入500ul 75％乙醇(depc水配制)后，置于离心机中，9600r/min，5min，弃去上清液，并重复此步骤两次，目的是为了清洗。
41.(6)将离心管打开盖，置于超净台中倒置晾干rna，以挥发酒精，40min左右即可。
42.(7)晾干后再离心管中加入20ul的depc水，然后置于-80℃冰箱中保存。
43.注意：
44.(1)本步骤中所使用的枪头均是无rna热源枪头。
15s，40个循环。荧光定量pcr结束后，将数据利用excel整理，再使用graphpad prism7.0软件作图。
66.表2荧光定量pcr反应体系
[0067][0068]
由图2可知，在0h-4h之间，瘤胃组织活力表现为逐渐上升的趋势，这是由于从上皮组织开始分离到在培养基中培养，中间大约1h的时间，虽然整体操作都在37℃pbs中进行，但由于没有营养物质的供给，瘤胃组织活力开始逐渐下降。而当瘤胃上皮分离完成，放入培养平板中，37℃，co2培养箱中培养时，组织活力开始逐渐恢复。瘤胃组织在培养12h后，代表上皮细胞分化能力的e-钙粘附蛋白基因的表达开始下降，组织细胞的活力开始降低。而使用添加胎牛血清的培养a与不添加胎牛血清的培养基b相比，组织中e-cadherin基因表达的整体变化趋势相同。但在各个时间点，培养基a中e-cadherin基因表达均显著高于培养基b。
[0069]
因此，本实验以12h为最佳培养时间。
[0070]
实施例3
[0071]
本实施例说明he染色。
[0072]
将在co2培养箱中，分别培养至0h，2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、48h、72h的瘤胃组织在收集时，放入4％多聚甲醛中固定(即1.2.3中收取的在两种培养基中培养的组织)，常温放置24h，然后进行he染色，观察各不同时间段瘤胃组织结构的完整性。
[0073]
由图3可以观察到，培养基a和培养基b对瘤胃上皮组织的培养效果差距没有e-钙粘附蛋白mrna相对表达量的结果明显，但整体可看出上皮组织培养到12h时依然能够保持完整的组织结构。从16h开始溃散，活性开始降低。即培养到12h时为最长培养时间，继续培养瘤胃组织的活性开始降低，这与荧光定量pcr的结果基本一致。
[0074]
实施例4
[0075]
本实施例说明mtt检测活性。
[0076]
为了检测培养基中某些成分对瘤胃外植体可能存在的毒性，将培养至最佳时间的瘤胃外植体用pbs洗涤5次以上，再分别加入含有mtt(250mg/ml)的培养基a和培养基b于37℃培养箱中培养4h,使得甲瓒在外植体内沉积。
[0077]
将外植体取出再放入甲醇中浸没使甲瓒析出。通过酶标仪将570nm的甲瓒的光密度除以外植体干重来确定其活力。
[0078]
用570nm下的甲瓒光密度值除以外植体干重，得到各组瘤胃外植体的相对活性，再利用graphpad prism 7.0软件得到培养基a和培养基b对瘤胃组织毒性的影响。由图4可知，培养基a和培养基b对瘤胃外植体没有毒性，对外植体活性的影响不存在差异，可进行后续试验。
[0079]
本发明通过多次对试剂和培养基成分配比的优化，以及瘤胃组织培养条件的研究，利用荧光定量pcr的方法来检测瘤胃组织中e-钙粘附蛋白基因的表达，利用mtt和he染
色检测组织的活性，从而确定瘤胃外植体存活的时间以及活性的强弱变化规律，从而得到培养瘤胃外植体各试剂的最佳成分；本发明提供了一种奶牛瘤胃上皮组织体外培养体系，利用屠宰场的正常屠宰的奶牛的瘤胃上皮组织作为外植体，进行体外实验，不用专门的屠宰奶牛，能够大量的节约实验成本，具有非常大的应用价值和市场价值。