奥沙利铂耐药相关生物标志物的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及奥沙利铂耐药相关生物标志物。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer)是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁到人类的生命和健康，其发病率已占到常见恶性肿瘤的第三位，其死亡率也占到癌症死亡的第三位。结直肠癌起病隐匿，早期无明显临床症状，虽然目前结直肠癌的早期诊断、手术治疗及新辅助治疗等诊疗手段得到显著提高，但结直肠癌的死亡率仍高达33％。早期结直肠癌的主要治疗手段是手术治疗，5年生存率约为56％～61％。但很多患者在就诊时已是中晚期，失去手术治疗的最佳机会，40～45％的患者在术后复发，失去了再次手术的机会。以化疗为主的综合治疗成为中晚期及复发的结直肠癌患者的主要治疗手段，其中以奥沙利铂为基础的化疗方案是目前临床治疗结直肠癌的一线化疗方案。并在抗癌活性方面具有明显的优势。奥沙利铂通过烷化作用，与dna形成链内和链间交联，从而抑制dna的合成与复制进而促进肿瘤细胞的凋亡。然而在治疗过程中，一些患者对奥沙利铂产生耐药严重制约其疗效。目前，有关预测奥沙利铂耐药的相关分子标志物的研究相对较少，主要为谷胱甘肽转移酶、p53、核苷酸切除修复基因ercc1、ercc2、xrcci等。但这些分子标记物作为奥沙利铂耐药相关分子标志物缺乏特异性，在临床应用上具有一定的局限性。因此，探索结直肠癌对奥沙利铂特异性的耐药分子标志物从而指导临床治疗具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明涉及生物标志物在预测结直肠癌对奥沙利铂治疗敏感性中的应用。在非限制性实施方式中，本发明提供了一种预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的产品，以及一种预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的装置。本发明还提供了生物标志物在制备提高结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的药物中的应用。
4.本发明提供了检测样本中生物标志物表达水平的试剂在制备预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的产品中的应用，所述的生物标志物包括c9、nptx2和/或bex2。
5.在某些非限制性实施方案方式中，所述的试剂包括通过聚合酶链式反应、原位杂交、凝胶电泳、测序和序列分析、微阵列分析、质谱技术、凝胶分析系统、色谱、酶联免疫吸附试验、放射免疫测定法、酶免疫测定法、蛋白质印迹、免疫沉淀、或免疫组织化学检测样本中生物标志物表达水平的试剂。
6.在某些实施方式中，所述的试剂包括引物、探针、微阵列、生物标志物特异性抗体、或生物标志物特异性珠。
7.本发明还提供了一种预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的产品，所述的产品包含检测样本中生物标志物表达水平的试剂，所述的生物标志物包括c9、nptx2和/或bex2。
8.在某些非限制性实施方案方式中，所述的产品包括试剂盒、芯片、试纸。在某些实
施方式中，所述试剂盒包括qpcr试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、elisa试剂盒和电化学发光检测试剂盒。
9.在某些实施方式中，所述的试剂盒包含预测结直肠癌患者是否对奥沙利铂治疗敏感的说明书。
10.在某些实施方式中，所述的产品还包括处理样本的试剂。
11.本发明还提供了生物标志物在制备提高结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的药物中的应用，所述的生物标志物包括c9、nptx2和/或bex2。
12.在某些非限制性实施方案方式中，所述的药物包括c9抑制剂、nptx2促进剂和/或bex2抑制剂。
13.本发明还提供了一种预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的装置，其包含：
14.a)包含特异性结合生物标志物的一种或多种检测试剂的分析器单元，所述单元适用于测定样品中的一种或多种生物标志物的量；和
15.b)用于将一个或多个测定量与一个或多个参考量进行比较的分析器单元，由此诊断肺癌，所述单元包含一个或多个参考量的数据库和用于实施比较的计算机执行的算法；
16.所述的生物标志物包括c9、nptx2和/或bex2。
附图说明
17.图1是c9差异表达的箱线图；
18.图2是nptx2差异表达的箱线图；
19.图3是bex2差异表达的箱线图；
20.图4是c9预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的roc曲线图；
21.图5是nptx2预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的roc曲线图；
22.图6是bex2预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的roc曲线图；
23.图7是c9和nptx2联合预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的roc曲线图；
24.图8是nptx2和bex2联合预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的roc曲线图；
25.图9是c9和bex2联合预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的roc曲线图；
26.图10是c9+nptx2+bex2联合预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的roc曲线图。
具体实施方式
27.为了清楚解释本发明而不是作为本发明的限制，将本发明的详细描述分为以下子部分：
28.a、生物标志物
29.b、生物标志物检测
30.c、试剂盒
31.d、药物
32.生物标志物
33.术语“生物标志物”是指以可用于预测个体的疾病状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。生物标志物可包括，但不限于，核酸、蛋白质及其变体和片段。生物标志物可以
是包含编码该生物标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的dna。可用于本发明的生物标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的dna和rna。
34.在本发明中，所述的生物标志物包括c9、nptx2和/或bex2。
35.如本文中在诸如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括a和b两者；a或b；a(单独)；以及b(单独)。同样地，在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
36.在本发明中，生物标志物例如c9(geneid：735)、nptx2(geneid：4885)、bex2(geneid：84707)，包括gene及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
37.在某些实施方式中，将生物标志物的水平与参考对照水平进行比较。本文可互换使用的的“参考对照水平”或“参考对照表达水平”可以使用例如参考对照样品来确立。参考对照样品的非限制性实例包括对奥沙利铂治疗敏感的结直肠癌患者样本。
38.术语“患者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括，但不限于，人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等。进一步，患者是人类患者。术语“患者”涵盖患有癌症(例如，结直肠癌)的个体，包括已经经历或进行切除(手术)以去除癌组织的候选者的那些个体。
39.如本文所用，术语“样本”是指从如本文所述的目的来源获得或衍生的生物样本。在一些实施方案中，目的来源包含生物体，诸如动物或人。在一些实施方案中，生物样本包含生物组织或液体。在一些实施方案中，生物样本可以是或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样本；含有细胞的体液；游离漂浮核酸；痰液；唾液；尿液；脑脊液腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；皮肤拭子；口服拭子；鼻拭子；洗涤物(washings)或灌洗物，诸如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；吸出物；刮屑；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；粪便，其他体液，分泌物和/或排泄物；和/或其中的细胞等。在一些实施方案中，生物样本是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样本是通过任何合适的手段直接从目的来源获得的“初级样本”。例如，在一些实施方案中，通过选自以下的方法获得初级生物样本：活组织检查(例如，细针抽吸或组织活组织检查)、手术组织、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)的收集等。
40.生物标志物检测
41.定性和定量地检测和/或测定c9核酸、nptx2核酸、bex2核酸的表达水平的方法包括但不限于，包括常规pcr、qpcr和数字pcr的聚合酶链式反应(pcr)、原位杂交(例如但不限于荧光原位杂交(“fish”))、凝胶电泳、测序和序列分析、微阵列分析和本领域已知的其它技术。
42.在某些实施方式中，检测方法可以是实时pcr(rt
‑
pcr)、定量pcr、荧光pcr、rt
‑
msp(rt甲基化特异性聚合酶链式反应)、dna的picogreentm(molecular probes，eugene，or)检测、放射免疫测定或dna的直接放射性标记。例如但不限于，可以将核酸生物标志物反转录成cdna，然后进行聚合酶链式反应(rt
‑
pcr)；或者，如在美国专利号为5,322,770中所述的，单一酶可用于两个步骤，或者如r.l.marshall等人，pcr methods and applications 4：80
‑
84(1994)所述，可以将生物标志物反转录成cdna，然后进行对称缺口连接酶链式反应(rt
‑
aglcr)。
43.在某些实施方式中，实时定量聚合酶链式反应(qrt
‑
pcr)用于评价生物标志物的mrna水平。生物标志物和对照mrna的水平可以在待评价的结直肠癌患者癌组织或对奥沙利铂治疗敏感的结直肠癌患者癌组织中定量。在某些实施方式中，一种或多种生物标志物的水平可以在生物样品中定量。
44.在某些实施方式中，可以使用原位杂交可视化，其中放射性标记的反义rna探针与生物样品例如活检样品的薄切片杂交、洗涤、用rna酶切割并暴露于敏感性乳剂用于放射自显影。样品可以用苏木精染色以显示样品的组织学组成，并且用合适的滤光器的暗场成像显示显影的乳剂。也可以使用非放射性标记比如地高辛。
45.在某些非限制性实施方式中，可以通过荧光原位杂交(fish)进行核酸生物标志物表达的评价。fish是可以直接鉴定细胞中dna或rna的特定区域的技术，因此使得能够目测测定组织样品中的生物标志物表达。fish是一种可以相对快速和灵敏、并且也可以自动化的直接的原位技术。当单独通过fish难以测定生物标志物的表达水平时，可以将免疫组织化学与fish方法相结合。
46.在某些实施方式中，可以在dna阵列、芯片或微阵列上检测核酸生物标志物的表达。将生物标志物对应的寡核苷酸固定在芯片上，然后将芯片与从受试者获得的生物样品例如肿瘤组织样品的标记核酸杂交。包含生物标志物转录物的样品获得阳性杂交信号。制备dna阵列的方法及其应用是本领域公知的。(参见，例如美国专利号6,618,6796、6,379,897、6,664,377、6,451,536、548,257；美国专利申请号20030157485和schena等人1995science20：467
‑
470；gerhold等人1999trends in biochem.sci.24，168
‑
173；和lennon等人2000drug discovery today 5：59
‑
65，其全部内容引入本文以供参考)。也可以进行基因表达的连续分析(sage)(参见，例如美国专利申请号20030215858)。
47.在某些实施方式中，为了监测核酸生物标志物mrna的表达水平，可以从待测生物样品中提取mrna、逆转录并可以产生荧光标记的cdna探针。然后将标记的cdna探针应用于能够与生物标志物杂交的微阵列，允许探针与微阵列杂交并扫描载玻片以测量荧光强度。该强度与杂交强度和生物标志物的表达水平相关。
48.用于检测核酸生物标志物的探针的类型包括cdna、核糖核酸探针、合成的寡核苷酸和基因组探针。使用的探针的类型通常由具体情况决定，例如，比如核糖核酸探针用于原位杂交，而cdna用于rna印迹法。在某些非限制性实施方式中，探针针对具体生物标志物rna独特的核苷酸区域。探针可以所需的一样短，以差异性识别具体生物标志物mrna转录物，并且可以短至例如15个碱基。也可以使用至少17个碱基、18个碱基和20个碱基的探针。在某些实施方式中，引物和探针在严格条件下与具有对应于靶基因的核苷酸序列的核酸片段特异性杂交。本文使用的术语“严格条件”是指只有在序列之间存在至少95％或至少97％的同一性时才会发生杂交。
49.探针标记的形式可以是任何合适的形式，比如使用例如
32
p和
35
s的放射性同位素、或荧光团。可以通过使用适当的标记的碱基来实现用放射性同位素的标记，无论所述探针是化学合成还是生物合成的。
50.用于检测和/或测定蛋白质生物标志物例如c9蛋白、nptx2蛋白、bex2蛋白的水平的方法，对本领域技术人员而言是熟知的，并且包括但不限于质谱技术、一维或二维凝胶分析系统、色谱、酶联免疫吸附试验(elisa)、放射免疫测定法(ria)、酶免疫测定法(eia)、蛋
白质印迹、免疫沉淀和免疫组织化学。这些方法使用抗体或抗体等同物来检测蛋白质，或使用生物物理技术。也可以使用抗体阵列或蛋白质芯片。
51.在某些非限制性实施方式中，用于测量蛋白质生物标志物表达的检测方法包括以下步骤：将生物样品例如组织样品与选择性结合生物标志物的抗体或其变体(例如，片段)接触，以及检测抗体或其变体是否结合样品。该方法还可以包括将样品与第二抗体例如标记的抗体接触。该方法还可以包括例如一个或多个洗涤步骤，以除去一种或多种试剂。
52.在某些非限制性实施方式中，蛋白质印迹可用于检测和定量生物标志物蛋白质表达水平。细胞或组织可以在裂解缓冲液中匀浆以形成裂解物，然后进行sds
‑
page并印迹至膜，比如硝酸纤维素滤膜。然后将抗体(未标记的)与膜接触，并通过二次免疫试剂例如标记的蛋白a或抗免疫球蛋白(合适的标记包括
125
i、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)来分析。也可以使用色谱检测。在某些实施方式中，可以使用增强的化学发光系统(例如，来自perkinelmerlife sciences,boston,mass.)，用抗生物标志物的抗体进行免疫检测。然后可以将膜剥离，并用对照蛋白特异性的对照抗体再印迹。
53.免疫组织化学可用于检测例如在活检样品中的生物标志物的表达和/或存在。可以将合适的抗体与例如细胞薄层接触，接着洗涤以除去未结合的抗体，然后与标记的第二抗体接触。可以通过荧光标志物、比如过氧化物酶的酶类、抗生物素蛋白或放射性标记进行标记。该试验可以使用显微镜可视地评分，并且可以对结果进行定量。基于机器或自动成像系统也可用于测量生物标志物的免疫染色结果。
54.适合用于免疫组织化学的各种自动化的样品处理、扫描和分析系统在本领域中是可获得的。这样的系统可以包括自动化的染色(参见，例如benchmark系统，ventanamedical systems，inc.)和显微镜扫描、计算机化的图像分析、连续切片比较(以对样品的方向和大小中的变量进行控制)、数字报告生成，以及样品(比如放置组织切片的载玻片)的存档和跟踪。细胞成像系统是商业上可获得的，其将常规光学显微镜与数字图像处理系统相结合以对细胞和组织包括免疫染色的样品进行定量分析。参见，例如cas
‑
200系统(becton，dickinson&co.)。
55.针对生物标志物的标记抗体也可以用于成像目的，例如，以检测受试者的细胞中生物标志物的存在。合适的标记包括放射性同位素，碘(
125
i、
121
i)、碳(
14
c)、硫(
35
s)、氚(3h)、铟(
112
in)和锝(99mtc)，荧光标记比如荧光素和罗丹明，以及生物素。可以使用不同的酶比如过氧化物酶、碱性磷酸酶或不同的色原体比如dab、aec或fast red来显现免疫酶相互作用。标记的抗体或抗体片段将优先聚集在包含生物标志物的细胞的位置处。然后可以使用已知的技术检测标记的抗体或其变体，例如抗体片段。
56.抗体包括与待检测的生物标志物足够有力并特异性结合的、无论天然或合成的、全长或其片段、单克隆或多克隆的任何抗体。抗体可以具有至多约10
‑6m、10
‑7m、10
‑8m、10
‑9m、10
‑
10
m、10
‑
11
m和10
‑
12
m的k
d
。短语“特异性结合”是指，例如抗体与表位或抗原或抗原决定簇的结合，其结合方式为可以用相同或相似的表位、抗原或抗原决定簇的第二制备物置换或竞争该结合。
57.可以使用的抗体及其衍生物包括多克隆或单克隆抗体、合成的和工程化的抗体、嵌合的、人的、人源化的、灵长类化的(cdr移植)、镶嵌化的(veneered)或单链抗体、相产生的抗体(phase produced antibody)(例如，来自噬菌体展示文库)、以及抗体的功能性结合
片段。例如，可以使用能够结合生物标志物或其部分的抗体片段，其包括但不限于fv、fab、fab’和f(ab’)2片段。这样的片段可以通过酶剪切或通过重组技术产生
58.在某些非限制性实施方式中，使用除抗体之外的特异性结合多肽的试剂，比如肽。可以通过本领域已知的任何方法，例如肽噬菌体展示文库，来鉴定特异性结合的肽。通常，可以使用能够检测生物标志物多肽的一种试剂，从而检测生物标志物的存在和/或进行定量。
59.此外，可以使用质谱比如maldi/tof(飞行时间)、seldi/tof、液相色谱
‑
质谱(lc
‑
ms)、气相色谱
‑
质谱(gc
‑
ms)、高效液相色谱
‑
质谱(hplc
‑
ms)、毛细管电泳
‑
质谱、核磁共振光谱或串联质谱(例如ms/ms、ms/ms/ms、esi
‑
ms/ms等)来检测生物标志物。
60.质谱方法是本领域公知的，并且已经用于定量和/或鉴定生物分子，比如蛋白质(参见，例如li等人(2000)tibtech 18：151
‑
160；rowley等人(2000)methods20：383
‑
397；和kuster和mann(1998)curr.opin.structural biol.8：393
‑
400)。而且，已经开发了允许对分离的蛋白质进行至少部分从头测序的质谱技术。chait等人，science 262：89
‑
92(1993)；keough等人，proc.natl.acad.sci.usa.96：7131
‑
6(1999)；综述见bergman，exs88：133
‑
44(2000)。
61.检测生物标志物或其它物质的存在通常包括检测信号强度。这可以依次反映结合于底物的多肽的数量和特性。例如，在某些实施方式中，可以比较(例如，可视化地或通过计算机分析)来自第一样品和第二样品的光谱的峰值的信号强度，以测定具体生物标志物的相对量。软件程序比如biomarker wizard程序(ciphergen biosystems,inc.，fremont，calif.)可用于帮助分析质谱。
62.用于测定样品中的核酸和/或蛋白质生物标志物表达的其它方法描述于例如美国专利号6,271,002；美国专利号6,218,122；美国专利号6,218,114；和美国专利号6,004,755；和wang等人，j.clin.oncol.，22(9)：1564
‑
1671(2004)；和schena等人，science，270：467
‑
470(1995)；所有这些的全部内容引入本文以供参考。
63.试剂盒
64.在某些非限制性实施方式中，本发明提供了用于预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的试剂盒，其包含用于检测前述部分所示生物标志物的试剂。所述试剂盒还包括描述使用试剂盒以测定奥沙利铂是否可能在结直肠癌中产生抗癌效果的说明书或支持材料，和/或提及描述其的网站或出版物。
65.试剂盒的类型包括但不限于包装的生物标志物特异性的探针和引物组(例如taqman探针/引物组)、阵列/微阵列、生物标志物特异性的抗体、生物标志物特异性的珠，其还包含一个或多个探针、引物或用于检测本发明的一种或多种生物标志物的其它试剂。
66.在某些非限制性实施方式中，本发明提供了用于预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的试剂盒，其包含用于检测核酸生物标志物的存在的工具。
67.在具体的非限制性实施方式中，试剂盒可包含适合于聚合酶链式反应(pcr)或核酸测序的一对寡核苷酸引物，用于检测待鉴定的核酸生物标志物。一对引物可包含与上述生物标志物互补的核苷酸序列，并且具有足够长度以与所述生物标志物选择性杂交。或者，互补核苷酸可选择性地与生物标志物位置5’和/或3’足够接近的特定区域杂交，以进行pcr和/或测序。试剂盒中可包含多种生物标志物特异性的引物，以同时检测多于一种生物标志
物。试剂盒还可以包含一种或多种聚合酶、逆转录酶和核苷酸碱基，其中核苷酸碱基还可以被可检测地标记。
68.在某些非限制性实施方式中，引物的长度可以是至少约10个核苷酸或至少约15个核苷酸或至少约20个核苷酸，和/或至多约200个核苷酸或至多约150个核苷酸或至多约100个核苷酸或至多约75个核苷酸或至多约50个核苷酸。
69.在另一个非限制性实施方式中，寡核苷酸引物可固定在固体表面、基板或支持物上，例如固定在核酸微阵列上，其中每个寡核苷酸引物与固体表面或支持物结合的位置是已知的和可鉴定的。寡核苷酸可以固定到基板，比如玻璃、塑料、纸、尼龙或其它类型的膜、滤器、芯片、珠或任何其它合适的固体支持物上。多核苷酸可以直接在基板上合成，或者分离于基板合成，然后固定在基板上。使用已知的方法制备阵列。
70.在具体的非限制性实施方式中，试剂盒可包含至少一种适于原位杂交或原位荧光杂交的核酸探针，用于检测待鉴定的生物标志物。此类试剂盒通常包含一种或多种对各种生物标志物具有特异性的寡核苷酸探针。用于测试多种生物标志物的工具可任选地包含在单一试剂盒中。
71.在某些实施方式中，试剂盒可包括容器(包括适用于在本方法的自动化实施中使用的微量滴定板)，每个容器具有方法中使用的各种试剂(通常为浓缩形式)一种或多种，包括例如，预制的微阵列、缓冲液、适当的三磷酸核苷(例如datp、dctp、dgtp和dttp，或ratp、rctp、rgtp和utp)、逆转录酶、dna聚合酶、rna聚合酶、以及一个或多个本发明的探针和引物(例如，适当长度的连接到与rna聚合酶反应的启动子的聚(t)或随机引物)。
72.在非限制性实施方式中，本发明提供用于预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的试剂盒，其包含用于检测蛋白质生物标志物水平的工具。
73.在非限制性实施方式中，试剂盒可包含至少一种抗体或其抗原结合片段，用于待鉴定的生物标志物的免疫检测。可以使用如本领域技术人员通常已知的常规的免疫技术制备特异性靶向生物标志物的多克隆和单克隆抗体。试剂盒的免疫检测试剂可包括与给定抗体或抗原本身相关的或连接的可检测标记。此类可检测标记包括例如化学发光或荧光的分子(若丹明、荧光素、绿色荧光蛋白、荧光素酶、cy3、cy5或rox)、放射性标记(3h、
35
s、
32
p、
14
c或
131
i)或酶(碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)。
74.在另一个非限制性实施方式中，可提供一种或多种生物标志物特异性的抗体结合于固体支持物，比如柱基质、阵列或微量滴定板的孔。或者，支持物可以作为试剂盒的单独元件提供。
75.在某些非限制性实施方式中，当试剂盒中的测量工具使用阵列时，上述生物标志物的组可构成呈现在微阵列上的生物标志物的种类的至少10％或至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％。
76.在某些非限制性实施方式中，本公开的试剂盒可包含用于检测样品中生物标志物表达水平的一种或多种探针、引物、抗体或其他检测试剂。例如，试剂盒可以包含用于检测生物样品中生物标志物的蛋白质表达水平的抗体或其片段。
77.在某些非限制性实施方式中，本公开的试剂盒可包含用于检测样品中c9表达水平的一种或多种探针、引物、抗体或其它检测试剂。例如，试剂盒可以包含用于检测生物样品中c9的蛋白质表达水平的抗体或其片段。
78.在某些非限制性实施方式中，本公开的试剂盒可包含用于检测样品中nptx2表达水平的一种或多种探针、引物、抗体或其它检测试剂。例如，试剂盒可以包含用于检测生物样品中nptx2的蛋白质表达水平的抗体或其片段。
79.在某些非限制性实施方式中，本公开的试剂盒可包含用于检测样品中bex2的表达水平的一种或多种探针、引物、抗体或其它检测试剂。例如，试剂盒可以包含用于检测生物样品中bex2的蛋白质表达水平的抗体或其片段。
80.试剂盒还可包含用于允许在癌症样品中的生物标志物水平与参考对照样品中的生物标志物水平之间进行比较的工具。例如但不限于，本公开的试剂盒包含一种或多种用于检测参考蛋白或mrna的探针、引物、抗体或其它检测试剂，其可以用于将样品中一种或多种生物标志物的表达水平归一化以允许比较。参考蛋白例如管家蛋白的非限制性实例包括α
‑
或β
‑
微管蛋白、肌动蛋白、丝切蛋白、黏着斑蛋白和gadph。
81.在某些非限制性实施方式中，试剂盒还可以包括使用试剂盒检测目的生物标志物的说明书。
82.药物
83.本发明提供了生物标志物在制备提高结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性的药物中的应用，所述的生物标志物包括c9、nptx2和/或bex2。
84.在某些非限制性实施方式中，所述的药物包括c9抑制剂、nptx2促进剂和/或bex2抑制剂。
85.本发明所述的抑制剂的非限制性市里包括抑制和/或降低生物标志物的表达和/或活性的化合物、分子、化学品、多肽、蛋白质。非限制性实例包括特异性抑制生物标志物的表达或活性的核酶、反义寡核苷酸、shrna分子和sirna分子。生物标志物抑制剂的一个非限制性实例包括与生物标志物核酸序列的至少一部分同源的反义、shrna或sirna核酸序列，其中所述部分相对于生物标志物核酸序列的同源性为至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约98％，其中百分比的同源性可以通过例如blast或fasta软件测定。在某些非限制性实施方式中，互补部分可以构成至少10个核苷酸或至少15个核苷酸或至少20个核苷酸或至少25个核苷酸或至少30个核苷酸，并且反义核酸、shrna或sirna分子的长度可以至多15或至多20或至多25或至多30或至多35或至多40或至多45或至多50或至多75或至多100个核苷酸。反义、shrna或sirna分子可以包含dna或非典型或非天然存在的残基，例如但不限于硫代磷酸酯残基。
86.本发明中所述的促进剂是指任何可提高所述生物标志物或其表达产物稳定性、上调所述生物标志物的表达、增加所述生物标志物的有效作用时间或促进所述生物标志物的转录的物质。
87.在某些非限制性实施方式中，所述的药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂。
88.本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物中
可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。
89.本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
90.本发明的药物的施用途径不受限制，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
91.本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。
92.以下所举实例是为了对本发明的的某些优选实施方案和本发明的某些方面进行描述，并不应解释为限定本发明的范围。以下实例结合附表和附图对本发明所述实施方案做进一步的详细说明。
93.实施例1差异表达基因
94.本发明从geo数据库下载gse28702，gse28702数据集样本量为folfox敏感组：folfox耐药组＝42:41.
95.使用r包“limma”(版本3.36.5)对gse28702数据集进行差异表达分析，得到50个差异表达基因，筛选标准为：pvalue<0.05，|logfc|>0.5。本发明中所涉及的差异表达基因c9、nptx2、bex2的表达水平如表1、图1
‑
3所示，与folfox耐药组相比，nptx2在folfox敏感组中表达上调，c9、bex2在folfox敏感组中表达下调。
96.表1差异表达基因
97.基因logfctp.valueup/downc9
‑
0.601
‑
2.1900.031downnptx20.6562.9700.004upbex2
‑
0.574
‑
3.5400.001down
98.实施例2诊断效能
99.使用r包“proc”(版本1.15.0)绘制受试者工作曲线(roc)，分析auc值、敏感性和特异性，结果见表2和图4
‑
10。
100.表2生物标志物/生物标志物组合诊断效能数据
101.[0102][0103]
以上结果证明，本发明所涉及的生物标志物在预测结直肠癌患者对奥沙利铂治疗敏感性中具有很好的诊断效能，且生物标志物组合的诊断效能优于单个生物标志物。
[0104]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。