一种麻黄草分子身份证及其应用

1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种麻黄草分子身份证及其应 用。


背景技术：

2.麻黄草为麻黄科麻黄属(ephedra)多年生草本状小灌木的统称。麻黄属内 共有约67种，中国分布约15种，包括草麻黄(e.sinica)、木贼麻黄(e.equisetina)、 中麻黄(e.intermedia)、山岭麻黄(e.gerardiana)、丽江麻黄(e.likiangensis) 等。麻黄草具有发汗散寒、宣肺平喘等功效，已被广泛应用于风寒感冒、胸闷喘 咳、风水浮肿等症的临床治疗。因此，有必要开发一种能准确识别麻黄草，并可 用于检测混合材料、复方制剂及粗提加工品中是否含有麻黄草成分的鉴定方法。
3.本领域技术人员熟知的分子身份证是通过提取生物的dna遗传信息来建 立的分辨不同生物的一个凭证，因为不同的生物所带有的遗传信息不同，因此分 子身份证将作为区分不同生物的有效凭证。然而，尽管分子身份证技术已经成熟， 但本领域技术人员理解，并不是所有的物种都能确定地筛选出普适性好、特异性 强的分子身份证。由于麻黄草分布的地理环境差别很大、种类繁多，据悉，人们 还未能找到一种适用于中国境内10种以上的麻黄草、且能与其他成分准确区分 开的麻黄草分子身份证。
4.另外，麻黄草是地球上古老的植物，据考古学家分析，3800年前古人就可 能食用麻黄，分析中就用到了麻黄的鉴定技术，但这些技术非常复杂，因为陈年 的标本中往往仅存痕量的dna，人们很难找到一种灵敏而特异的麻黄草分子身 份证，使其用于从陈年标本的dna中准确鉴定麻黄草。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的在于，提供一种可广泛适用于中国境内13个种以上的麻 黄草的通用分子身份证。
6.本发明的另一个目的在于提供一种麻黄草的鉴定方法，尤其是可用于鉴定 陈年样本中麻黄草的方法。所述方法同样可用于检测混合材料、复方制剂及粗提 加工品中是否含有麻黄草成分。
7.在一种情况下，陈年是指几十年或上百年，例如超过100年。
8.人们容易理解，比起常规的dna降解严重的材料，陈年样品已仅剩痕量dna， 所以，在陈年样品中鉴定麻黄草的难度更高。
9.为此，本发明首先提供一种麻黄草的最佳分子身份证，其在属水平上普适性 好、特异性好，能在陈年样品中准确鉴定麻黄草。
10.在具体实施例中，本发明麻黄草分子身份证为seq id no.1所示的核苷酸序 列。
11.本发明还提供一种用于检测麻黄草成分的试剂盒，包含本发明的分子身份 证。
12.优选的，试剂盒中还包含如seq id no.2(mh
‑
1f)及seq id no.3(mh
‑ꢀ
1r)所示的引物序列。
13.优选的，试剂盒还包含dna聚合酶、dntp、mgcl2、缓冲液、染料、水、 使用说明书中的一种或几种。
14.本发明还提供一种麻黄草的鉴定方法，所述鉴定方法包括检测待测样品基 因组dna中是否存在上述麻黄草分子身份证。
15.在一种实施例中，所述鉴定方法包括如下步骤：
16.1)提取待测样本中的dna，获得样本中的全基因组dna；
17.2)以步骤1)所得的全基因组dna为模板，经pcr扩增，获得含有所述麻黄 草分子身份证区域的短序列片段；
18.3)对扩增产物进行测序，去除测序低质量区后拼接获得完整的扩增片段，检 测测序结果中是否存在所述麻黄草分子身份证。
19.本发明还提供了一种利用所述方法在检测粗提加工物、中成药及混合样本 中有无麻黄草成分的应用。
20.本发明还提供了上述麻黄草分子身份证，或鉴定方法，或试剂盒在麻黄草鉴 定中的应用。
21.与现有技术相比，本发明的优势在于：
22.1)、本发明的分子身份证在麻黄草属水平的适用性最为广泛。
23.2)、本发明的分子身份证可用于陈年样品中麻黄草的鉴定。
24.3)、本发明的分子身份证可实现对混合样品、粗提加工品及复方制剂中否含 有麻黄草材料进行准确检测。
25.4)、毫无疑问，本发明的麻黄草分子身份证也能适用于新鲜的麻黄草、合成 的麻黄草、麻黄草原植物、麻黄草药材、麻黄草种子、麻黄草种苗、或麻黄草粉 末的快速、准确鉴定。
26.可以看出，本发明并不是简单地使用分子身份证技术来鉴别麻黄草，而是利 用分子身份证技术深度挖掘和筛选到一种特殊的麻黄草分子身份证：能够广泛 适用于中国境内13个种以上的麻黄草鉴别；能鉴定特殊条件下的麻黄属植物，尤 其是陈年样本麻黄草，以及鉴定中药等混合物中的麻黄草。
27.具体而言，本发明提供如下技术方案：
28.麻黄草分子身份证，其含有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
29.本发明中，所述麻黄草分子身份证为seq id no.1所示的核苷酸序列。
30.本发明基于its2序列对麻黄属物种有一定鉴别能力的情况下，筛选麻黄属 物种在该序列区域内的保守片段并在ncbi(national center for biotechnologyinformation)序列数据库中进行blast分析，得到如seq id no.1所示的核苷 酸序列。
31.本发明还提供一种麻黄草的鉴定方法，所述鉴定方法包括检测待测样品基 因组dna中是否存在上述麻黄草分子身份证。
32.优选，所述方法包括如下步骤：
33.1)提取待测样本中的dna，获得样本中的全基因组dna；
34.2)以步骤1)所得的全基因组dna为模板，经pcr扩增，获得含有所述麻黄 草分子身份证区域的短序列片段；
35.2)对扩增产物进行测序，去除测序低质量区后拼接获得完整的扩增片段，检 测测
序结果中是否存在所述麻黄草分子身份证。
36.根据本发明的一个优选实施方案，pcr扩增所使用的正向引物为seq idno.2所示的核苷酸序列，反向引物为seq id no.3所示的核苷酸序列。
37.mh
‑
1f：5
′‑
tcatcgagtctttgaacgc
‑3′
(seq id no.2)；
38.mh
‑
1r：5
′‑
atgcgaaggtcccctttt
‑3′
(seq id no.3)。
39.本发明还提供了一种利用所述方法在检测粗提加工物、中成药及混合样本 中有无麻黄草成分的应用。
40.一种用于检测麻黄草成分的试剂盒，包含如seq id no.2及seq id no.3所 述的引物序列。
41.优选地，所述试剂盒还包含dna聚合酶、dntp、mgcl2、缓冲液、染料、 水、使用说明书中的一种或几种。
42.上述麻黄草分子身份证，或鉴定方法，或试剂盒在麻黄草鉴定中的应用。
43.综上，本发明的麻黄草分子身份证，或鉴定方法，或试剂盒不仅能够实现13 种麻黄草的属水平鉴定，同时还能准确鉴定陈年样本中的麻黄草成分，并可用于 检测混合材料、复方制剂及粗提加工品中是否含有麻黄草成分。
44.而且，与现有技术相比，本发明所提供的方法适用性更广，可用于dna降解 严重的材料的鉴定，可检测所有能提取出dna的麻黄草样品，同时可实现对混 合样品、粗提加工品及复方制剂中否含有麻黄草材料进行准确检测；且本发明所 提供的属水平的分子身份证有效地避免了为不同麻黄属物种分别建立一种鉴别 方法带来的繁琐工作，极大地提高了鉴定效率。
附图说明
45.图1为实施例1中seq id no.4序列在ncbi中的blast结果。
46.图2为实施例1中seq id no.5序列在ncbi中的blast结果。
47.图3为实施例1中seq id no.6序列在ncbi中的blast结果。
48.图4为实施例1中seq id no.7序列在ncbi中的blast结果。
49.图5为实施例1中seq id no.8序列在ncbi中的blast结果。
50.图6为实施例1中seq id no.9序列在ncbi中的blast结果。
51.图7为麻黄草分子身份证序列(seq id no.1)在ncbi中的blast结果。
52.图8为实施例2中中成药的测序结果中麻黄草分子身份证检索结果。
具体实施方式
53.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是 以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行 限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明 进行各种修改和替换。
54.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
55.实施例1.麻黄草分子身份证开发与验证
56.1)从ncbi中下载得到包含60个麻黄属物种的224条its2序列，通过筛 选麻黄属物种在its2区域中的序列保守区，得到一段长度为55bp的相对保守 片段(seq id no.4)。进
一步截取该段序列内不同长度的序列片段并在ncbi (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)序列数据库中进行blast分析，以确定可作为麻黄 草分子身份证的最佳序列片段(表1)。blast比对结果显示，当序列片段较长 时，序列在麻黄属内的保守性下降，单条序列无法涵盖属内所有物种(图1
‑
图 5)；而序列过短时，其特异性降低，比对结果中会匹配到其它属物种(图6)。 最终得到一段属内保守且属间特异的长度为23bp的麻黄属分子身份证序列： gtccggtccgcctcggcggtgcg(seq id no.1)。该分子身份证在ncbi中 的blast结果如图7所示，该序列100％匹配到的仅有麻黄属物种，表明该段序 列可作为麻黄草属水平的最佳分子身份证。
57.表1.不同长度序列片段在ncbi中的blast结果
[0058][0059]
实施例2.最佳分子身份证对13种陈年麻黄草进行鉴定
[0060]
在标本馆中收集陈年麻黄属植物样本82份，共13种，样品信息如表2所示。 分别取样约30mg，在球磨仪中(德国retsch)以30hz研磨2min后，用天根生化 科技(北京)有限公司的植物基因组dna提取试剂盒提取总dna。
[0061]
表2.麻黄属植物样品信息
[0062]
[0063]
[0064][0065]
3)pcr扩增
[0066]
正、反向引物序列分别为mh
‑
1f：5
′‑
tcatcgagtctttgaacgc
‑3′
(seqid no.2)；mh
‑
1r：5
′‑
atgcgaaggtcccctttt
‑3′
(seq id no.3)；引物由北 京诺赛基因组研究中心有限公司合成，并用无菌去离子水溶解并稀释至 2.5μmol/l。
[0067]
25μl反应体系：2
×
pcr master mix 12.5μl，正、方向引物各1.0μl(2.5 μmol/l)，模板dna 2.0μl(40～60ng)，加灭菌双蒸水至25μl，进行pcr扩增。
[0068]
pcr反应程序：在pcr仪上按照以下程序进行扩增反应：94℃ 5min；94℃ 45s，56℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。
[0069]
4)测序
[0070]
pcr产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序，测序引物同本发明 的pcr引物mh
‑
1f和mh
‑
1r。为确保dna条形码序列的可靠性，需要进行 正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得dna条形码序列。
[0071]
5)序列拼接
[0072]
本实施例采用应用软件codoncode aligner 5.2.0(codoncode co.，usa)进 行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的 低质量部分，并
对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼 接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内 有多于2个碱基的q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内 碱基q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。
[0073]
6)序列比对
[0074]
利用mega
‑
x软件对测序并拼接后得到的麻黄草样品序列以及从genbank 中下载到的麻黄属植物的its2序列进行比对，麻黄草分子身份证序列区域比对 结果表明这段分子身份证属内保守。麻黄草样品中均检测到了本发明的分子身 份证序列，且无变异位点。
[0075]
实施例3.中成药中麻黄草成分的检测
[0076]
1)以含麻黄草成分的中成药为待测样品(表3)，采用与实施例1相同的 方法进行鉴定，对中成药样品进行dna的提取、pcr扩增及测序，通过检测测 序结果中麻黄属分子身份证的有无来检测中成药中的麻黄草成分。
[0077]
2)结果表明，利用本发明提供的麻黄属分子身份证可成功实现对中成药中 麻黄草成分的鉴定，如图8。即使是对于组分非常复杂的样本，如zcy
‑
07，本 发明提供的方法依然适用。说明本发明所提供的分子身份证及鉴定方法可成功 用于中成药等混合加工品中麻黄草成分的检测。说明本发明所提供的分子身份 证及鉴定方法可成功用于dna降解严重的中成药等混合加工品中麻黄草成分 的检测。
[0078]
表3.含麻黄草成分中成药
[0079][0080][0081]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显 而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于 本发明要求保护的范围。