一种CDH23基因突变体及其检测的试剂盒与应用

一种cdh23基因突变体及其检测的试剂盒与应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种cdh23基因突变体及其检测的试剂盒与应用。


背景技术：

2.遗传性聋可分为综合征性耳聋和非综合征性耳聋，其中约80％的非综合征型耳聋为常染色体隐性遗传。伴随耳聋遗传病因学及分子生物学技术的快速发展，至今已有超过100个基因座与常染色体隐性耳聋相关联。由不同致病基因导致的非综合征型耳聋在发病年龄、听力损失程度、进行性等方面存在明显差异。确定耳聋发病的致病基因有助于为患者选取合适的听力干预手段，更好地提高耳聋患者的生活质量。虽然一些常见基因得到了深入的认识，并使得耳聋分子病因学诊断成为可能。但由于遗传性耳聋具有很强的遗传异质性，目前仍有大量的致病基因未被鉴定，所以这方面的研究还有很大的空间，仍需要加强基因鉴定方面的研究。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种cdh23基因突变体及其检测的试剂盒与应用，该cdh23基因突变体可以用于筛查常染色体隐性耳聋致病突变携带者；也可用于常染色体隐性耳聋患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，并且快速、准确、高效、简便、早期诊断率高，检测结果可以为常染色体隐性耳聋的早期诊断、鉴别诊断及药物治疗提供科学依据。
4.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种cdh23基因突变体，与野生型cdh23基因的核苷酸序列相比，所述cdh23基因突变体的核苷酸具有下列突变：c.3890g>t和/或c.6649a>g；所述野生型cdh23基因具有序列表seq.id.no.5的核苷酸序列；与野生型cdh23基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述cdh23基因突变体的多肽具有下列突变：p.cys1297phe和/或p.lys2217glu。所述野生型cdh23基因具有序列表seq.id.no.6的氨基酸序列。
5.通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了感音神经性耳聋疾病新的致病基因突变位点(cdh23基因的c.3890g>t、c.6649a>g突变)。
6.本发明提出了一种编码cdh23基因突变体的核酸。所述核酸与与野生型cdh23基因的核苷酸序列(seq.id.no.5)相比，具有选自下列的至少一种突变：c.3890g>t、c.6649a>g。即相对于野生型cdh23基因，本发明的cdh23基因具有错义突变c.6649a>g或c.3890g>t的至少一种。根据本发明的实施例，发明人确定了cdh23基因的新突变体，该突变体与感音神经性耳聋疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患感音神经性耳聋疾病。
7.本发明提出了一种多肽，该多肽与野生型cdh23基因表达的多肽的氨基酸序列(seq.id.no.6)相比具有p.cys1297phe突变和/或p.lys2217glu突变，通过检测生物样品中
是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患感音神经性耳聋疾病。该多肽是由上述核苷酸编码的，上述c.3890g>t突变编码的蛋白为p.cys1297phe，而c.6649a>g突变编码的蛋白为p.lys2217glu。
8.本发明提出了一种筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品的方法，该方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核苷酸序列；所述核酸样本的核苷酸序列与野生型cdh23基因的核苷酸序列(seq.id.no.5)相比，具有选自c.3890g>t、c.6649a>g的至少一种突变是所述生物样品易患感音神经性耳聋疾病的指示。
9.优选地，所述生物样品为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。
10.优选地，所述核酸样本为全基因组dna。
11.优选地，所述感音神经性耳聋疾病是常染色体隐性遗传疾病。
12.通过根据筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品的方法，可以有效地筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品。
13.本发明还提供了一种检测上述cdh23基因突变体的试剂盒，所述试剂盒中包括检测所述cdh23基因突变体的试剂为核酸探针或特异性引物；
14.当所述cdh23基因突变体为c.3890g>t突变时，检测所述cdh23基因突变体的试剂为引物对1，所述引物对包括引物a和引物b；当所述cdh23基因突变体为c.6649a>g突变时，检测所述cdh23基因突变体的试剂为引物对2，所述引物对包括引物c和引物d；
15.所述引物a具有序列表seq.id.no.1的核苷酸序列；
16.所述引物b具有序列表seq.id.no.2的核苷酸序列；
17.所述引物c具有序列表seq.id.no.3的核苷酸序列；
18.所述引物d具有序列表seq.id.no.4的核苷酸序列。
19.本发明还提供了上述的试剂盒的应用，所述试剂盒用于筛选易患感音神经性耳聋疾病。
20.优选地，所述感音神经性耳聋疾病为常染色体隐性遗传疾病。
21.对于本发明提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及cdh23基因的cdna序列，实际上可以包括/或不包括该序列以及其互补序列。例如，提及野生型cdh23基因的核苷酸序列(seq.id.no.5)，实际可以包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
22.本发明中的基因序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及cdh23基因的cdna序列，实际也包括相应的rna序列。
23.本发明与现有技术相比具有以下优点：
24.本发明的cdh23基因突变体可以用于筛查常染色体隐性耳聋致病突变携带者；也可用于常染色体隐性耳聋患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，并且快速、准确、高效、简便、早期诊断率高，检测结果可以为常染色体隐性耳聋的早期诊断、鉴别诊断及药物治疗提供科学依据。
25.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
26.图1是本发明实施例2的感音神经性耳聋患者家系的家系图谱。
27.图2是本发明实施例3的sanger法测序图。
具体实施方式
28.实施例1
29.本实施例的cdh23基因突变体，与野生型cdh23基因的核苷酸序列相比，所述cdh23基因突变体的核苷酸具有下列突变：c.3890g>t和/或c.6649a>g；所述野生型cdh23基因具有序列表seq.id.no.5的核苷酸序列；上述错义突变c.3890g>t为相对于野生型cdh23基因的cdna的第3890位由g突变成t，c.6649a>g为相对于野生型cdh23基因的cdna的第6649位由a突变成g。
30.本实施例确定了cdh23基因的新突变体，该突变体与感音神经性耳聋疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患感音神经性耳聋疾病。
31.该编码cdh23突变体的核酸，是通过全外显子测序、家系分析联合sanger测序验证的方法进行致病突变检测和验证。最终确定了cdh23基因上两个突变位点，且该突变位点在现有技术中并未被提到。
32.与野生型cdh23基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述cdh23基因突变体的多肽具有下列突变：p.cys1297phe和/或p.lys2217glu，所述野生型cdh23基因具有序列表seq.id.no.6的氨基酸序列。
33.本实施例提出了一种编码cdh23基因突变体的核酸。所述核酸与与野生型cdh23基因的核苷酸序列(seq.id.no.5)相比，具有选自下列的至少一种突变：c.3890g>t、c.6649a>g。即相对于野生型cdh23基因，本实施例的cdh23基因具有错义突变c.6649a>g或c.3890g>t的至少一种。本实施例确定了cdh23基因的新突变体，该突变体与感音神经性耳聋疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患感音神经性耳聋疾病。
34.本实施例提出了一种多肽，该多肽与野生型cdh23基因表达的多肽的氨基酸序列(seq.id.no.6)相比具有p.cys1297phe突变和/或p.lys2217glu突变，该多肽是由上述核苷酸编码的，上述c.3890g>t突变编码的蛋白为p.cys1297phe，而c.6649a>g突变编码的蛋白为p.lys2217glu。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患感音神经性耳聋疾病。
35.本实施例提出了一种筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品的方法，该方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核苷酸序列；所述核酸样本的核苷酸序列与野生型cdh23基因的核苷酸序列(seq.id.no.5)相比，具有选自c.3890g>t、c.6649a>g的至少一种突变是所述生物样品易患感音神经性耳聋疾病的指示；所述生物样品为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种；所述核酸样本为全基因组dna。
36.首先，从所述生物样品提取核酸样本。根据本实施例的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品cdh23是否存在突变的核酸样本即可。根据本实施例的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少
一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品的效率。根据本实施例的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中cdh23是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组dna，也可以是该全基因组中包含cdh23编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总rna，也可以是从生物样品中提取的mrna。根据本实施例的一个实施例，所述核酸样本为全基因组dna。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品的效率。另外，根据本实施例的实施例，针对采用rna作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取rna样本，优选rna样本为mrna；以及基于所得到的rna样本，通过反转录反应，获得cdna样本，所得到的cdna样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用rna作为核酸样本筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品的效率。
37.通过根据筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品的方法，可以有效地筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品。
38.上述的感音神经性耳聋疾病是常染色体隐性遗传疾病。当在cdh23基因突变体中同时出现c.3890g>t和c.6649a>g突变时，检测生物样品都患有的常染色体隐性遗传型感音神经性耳聋；携带其中任何一种突变不致病，但后代换感音神经性耳聋的几率大大增加。通过检测具有2个突变位点的cdh23基因突变体在生物样品中是否存在，可以准确有效地预测生物体是否患常染色体隐性遗传型感音神经性耳聋。
39.需要说明的是，根据本实施例实施例的“筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。
40.本实施例还提供了一种检测上述cdh23基因突变体的试剂盒，所述试剂盒中包括检测所述cdh23基因突变体的试剂为核酸探针或特异性引物；
41.当所述cdh23基因突变体为c.3890g>t突变时，检测所述cdh23基因突变体的试剂为引物对1，所述引物对包括引物a和引物b；当所述cdh23基因突变体为c.6649a>g突变时，检测所述cdh23基因突变体的试剂为引物对2，所述引物对包括引物c和引物d；
42.所述引物a具有序列表seq.id.no.1的核苷酸序列；
43.所述引物b具有序列表seq.id.no.2的核苷酸序列；
44.所述引物c具有序列表seq.id.no.3的核苷酸序列；
45.所述引物d具有序列表seq.id.no.4的核苷酸序列。
46.利用根据本实施例的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患感音神经性耳聋疾病的生物样品。本实施例中使用的术语“检测所述cdh23基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测cdh23编码基因的试剂，也可以是检测cdh23突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。
47.本实施例还提供了上述的试剂盒的应用，所述试剂盒用于筛选易患感音神经性耳聋疾病。
48.所述易患感音神经性耳聋疾病是常染色体隐性遗传疾病。
49.对于本实施例提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及cdh23基因的cdna序列，实际上可以
包括/或不包括该序列以及其互补序列。例如，提及野生型cdh23基因的核苷酸序列(seq.id.no.5)，实际可以包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
50.本实施例中的基因序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及cdh23基因的cdna序列，实际也包括相应的rna序列。
51.实施例2
52.本实施例为确定感音神经性耳聋疾病的致病基因。
53.收集到一个2代的中国感音神经性耳聋患者家系，以及该家系外的100名正常人的基因。图1显示了感音神经性耳聋患者家系的家系图谱。其中，
□
表示正常男性，
○
表示正常女性，
●
表示女性患者。该家系共有5名成员，其中第二代两个女儿为感音神经性耳聋患者，第一代的父母为正常成员。
54.dna提取
55.分别采取2名家系内患者、2名家系内正常人及家系外100名正常人外周静脉血，利用qiamp bloodkit(qiagen，hilden，germany)抽提外周血白细胞的基因组dna，并利用qubitfluorometer和琼脂糖凝胶电泳测量dna的浓度及纯度，所得的每个标本基因组dna od
260
/od
280
均位于1.7
‑
2.0之间，浓度不少于50纳克/微升，总量不少于3微克。
56.捕获测序
57.使用agilent sureselect human all exon v6 dna kit全外显子捕获平台，结合illumina hiseq 4000的高通量测序技术，对两位患者及其表型正常的父母进行了全外显子组捕获测序，捕获范围包括全基因组外显子区域(约占全基因组1％)，捕获区域总长可达50m，测序数据量10
‑
12gb，100
×
有效测序深度。主要步骤包括打断、文库制备和上机测序。
58.测序数据下机后，使用内部定制流程进行变异检测、注释以及数据库比对，根据人群频率、软件预测结果、家系分析等手段，确定候选致病位点。
59.结果在两名患者的cdh23基因上发现复合杂合c.3890g>t/c.6649a>g突变。家系分析显示，患者的父亲和母亲分别为c.3890g>t突变和c.6649a>g杂合携带者。
60.实施例3
61.用sanger法测序验证感音神经性耳聋疾病的致病基因。
62.分别对实施例2中的2名患者(图1中ⅱ:1、ⅱ:2)、2名家系内正常人(图1中ⅰ:1、ⅰ:2)以及100位家系外正常人基因进行检测，针对该cdh23基因复合杂合突变位点所在序列设计引物，通过pcr扩增，产物纯化，测序的方法获得有关序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，以及突变是否与表型在家系内呈共分离来验证相关性。具体方法步骤如下：
63.1)dna提取：
64.分别采取2名家系内患者、2名家系内正常人及家系外100名正常人外周静脉血提取基因组dna、测定dna含量和纯度。
65.2)引物设计及pcr反应
66.引物设计参考人类基因组序列数据库grch37/hg19，具体见下。
67.a)引物序列：
68.针对cdh23基因的c.3890g>t突变，所用到的特异性引物序列如下：
69.上游引物：引物a具有序列表seq.id.no.1的核苷酸序列；
70.下游引物：引物b具有序列表seq.id.no.2的核苷酸序列；
71.针对cdh23基因的c.6649a>g突变，所用到的特异性引物序列如下：
72.上游引物：引物c具有序列表seq.id.no.3的核苷酸序列；
73.下游引物：引物d具有序列表seq.id.no.4的核苷酸序列。
74.b)pcr反应体系：
75.表1 cdh23基因的pcr反应体系
[0076][0077]
c)pcr反应条件：
[0078]
表2 cdh23基因pcr扩增产物的测序反应过程
[0079][0080][0081]
3)将步骤2中获得的获自2例患者、2名家系内正常人的pcr扩增产物直接进行dna测序。
[0082]
在患者家族成员中对cdh23基因突变位点所在编码序列及侧翼序列进行突变排查，患者ⅱ:1、ⅱ:2均有c.6649a>g和c.3890g>t复合杂合突变，ⅰ:1、ⅰ:2均为携带者，即ⅰ:1仅有c.6649a>g突变(图2d)；ⅰ:2仅有c.3890g>t(图2b)，图2a、图2c分别为家系外正常人的c.3890g>t和c.6649a>g野生型突变基因作为对照，图2中箭头所指为突变位点。
[0083]
本发明的cdh23基因中的新的复合杂合突变c.3890g>t(p.cys1297phe)和c.6649a>g(p.lys2217glu)错义突变，可判断此家族中未发病的成员患病的可能性，同时可用于该家族后代患病几率的评估与诊断。
[0084]
研究证实cdh23基因突变可以引起常染色体隐性耳聋。我们的研究表明：cdh23c.6649a>g和c.3890g>t是引起常染色体隐性遗传性耳聋的突变，当在cdh23基因突变体中同时出现c.3890g>t和c.6649a>g突变时，检测生物样品都患有的常染色体隐性遗传型感音神经性耳聋；携带其中任何一种突变不致病，但后代换感音神经性耳聋的几率大大增加。通过检测具有2个突变位点的cdh23基因突变体在生物样品中是否存在，可以准确有效地预测生物体是否患常染色体隐性遗传型感音神经性耳聋。
[0085]
本发明公开了耳聋基因(cdh23)的新突变，首次证实了其为常染色体隐性遗传性耳聋的分子病因，在100例中国正常听力人群中进行该位点的筛查，均为阴性。本研究丰富
了耳聋基因突变谱，为开展遗传性耳聋分子诊断提供了基因学依据。
[0086]
实施例4
[0087]
本实施例为检测实施例1中的cdh23基因突变体的试剂盒，其中含有检测突变的c.6649a>g和c.3890g>t的引物对：
[0088]
针对cdh23基因的c.3890g>t突变，所用到的特异性引物序列如下：
[0089]
上游引物：引物a具有序列表seq.id.no.1的核苷酸序列；
[0090]
下游引物：引物b具有序列表seq.id.no.2的核苷酸序列；
[0091]
针对cdh23基因的c.6649a>g突变，所用到的特异性引物序列如下：
[0092]
上游引物：引物c具有序列表seq.id.no.3的核苷酸序列；
[0093]
下游引物：引物d具有序列表seq.id.no.4的核苷酸序列。
[0094]
提取待测者dna，以所提取的dna为模板与上述引物进行pcr反应，对pcr产物纯化，将纯化的产物测序。观察测序所得到的序列是否有c.6649a>g和c.3890g>t突变。
[0095]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。