HER2mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用的制作方法

her2 mrna及环状rna多重荧光定量pcr检测引物探针及其应用
技术领域
1.本发明属于基因分子检测领域，具体涉及一种her2 mrna及环状rna多重荧光定量pcr检测引物探针及应用方法。


背景技术：

2.自2012年以来，随着高通量测序以及生物信息学技术的不断进步，研究者在多种生物体中陆续发现了大量存在的环状rna(circular rna，circrna)分子，环状rna广泛存在于真核生物中并在个体发育以及多种疾病的发生发展过程中扮演重要的生物学功能。中国科学院与科睿唯安联合发布的《研究前沿》报告和《研究前沿热度指数》，“环状rna作为新的疾病标志物”成为生物科学领域新兴前沿方向的top1，这也是环状rna连续三年进入前沿研究报告的名单，且三次均为榜单中的top1热点方向，这在生命科学与医学领域乃至所有学科方向中都非常罕见，足见环状rna的研究热度和意义。环状rna是一类不具有5＇末端帽子和3＇末端以共价键形成环状结构的rna分子，环状rna由于形成闭合的环状结构，使其能够耐受rna外切酶切割，比线性的mrna分子稳定性强，多数由外显子环化形成，大部分环状rna长度分布在200
‑
2000bp区间。人类的环状rna数据库circbase中收录了来自多种组织类型及细胞类型的环状rna数目达到10万个，其中一部分环状rna分子具有较高的丰度以及进化上的序列保守性，提示环状rna应该具有比较重要的生物学功能。在人类疾病的发生过程中往往有一些环状rna表达异常，提示环状circrna可能参与了这些疾病的发生发展。近年来，越来越多的研究证实，circrnas以多种方式发挥其生物学功能，环状rna可以通过吸附小分子microrna扮演分子海绵的方式对基因进行翻译水平的表达调；环状rna和蛋白质互作，可以调控蛋白质的细胞定位或稳定性，从而影响信号通路的激活或者抑制；含有内含子序列的环状rna往往定位于细胞核内，在细胞核内的环状rna可以通过与rna聚合酶互作影响dna到rna的转录调控，激活目标基因的转录；近年来最新的研究报道环状rna还可以作为模板翻译新的蛋白质或者多肽翻译发挥重要的生物功能。
3.根据国际癌症研究机构(iarc)汇总的2020年全球癌症发病率和死亡率数据，《ca：a cancer journal for clinicians》杂志发布了全球肿瘤的现状，对全球癌症疾病负担进行了更新，2020年全球约有1930万新发癌症病例和近1000万癌症死亡。女性乳腺癌超过肺癌成为全球发病人数最多的肿瘤，2020年近230万新发乳腺癌病例。目前针对乳腺癌的治疗方案中，以人表皮生长因子受体2(her2)为靶点的药物较多。her2是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。her2靶向治疗可以极大的改善her2阳性乳腺癌患者的预后。her2的表达情况作为预后和预测生物标志物，15％～30％乳腺癌和10％～30％胃/食管癌会发生her2基因扩增或过表达，her2的过度表达也可见于其他肿瘤如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈部；根据美国临床肿瘤学会(asco)、美国病理学家协会(cap)推出的her2检测指南，目前有两种方法被批准用于her2检测：免疫组化(ihc)和荧光
原位杂交(fish)，ihc分析乳腺肿瘤组织的her2表达所有侵袭性乳腺癌患者的her2状态均应在1个或更多的检测结果的基础上确定。对于her2蛋白质表达水平，应通过经过验证的ihc方案进行初始检测，her2表达的评分方法是基于细胞膜染色模式，根据染色的强度分为her2阳性3级别、2级别和0或1+阴性级别。ihc鉴别为疑似阳性的乳腺癌样本应接受fish的进一步验证，验证其在核酸水平是否为发生阳性扩增。对于her2基因表达阳性的肿瘤患者陆续有一些靶点药物被开发出来，fda在1998年，批准“曲妥珠”可以用于有her2过量表达的乳腺癌的治疗。曲妥珠，它的英文名叫“trastuzumab”中文商品名叫“赫赛汀”，曲妥珠是一种抗体的药物，它针对性地结合到her2蛋白在细胞膜外的第4个功能域；2010年，fda批准曲妥珠可以联合化疗药物(顺铂、氟尿嘧啶)，用于治疗有her2过量表达的胃癌、和胃食管交界癌；2013年11月，fda批准帕妥珠可以联合曲妥珠、紫杉萜等，用于有her2阳性的乳腺癌的治疗。帕妥珠的英文名是“pertuzumab”；帕妥珠是一个完全人源化的单克隆抗体，它可以结合到her2蛋白在细胞膜外的第二个功能域。这个功能域的功能，是让her2能够与egfr基因家族的各种蛋白单体形成二聚体。
4.三阴型乳腺癌是乳腺癌中的一种特殊的类型，因为缺乏雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)以及her2的表达，该类乳腺癌一直没有特异的靶向治疗手段，相对于其他类型的乳腺癌，三阴型乳腺癌治疗效果较差，复发相对更快，生存期也更短。对于晚期不可手术的三阴型乳腺癌患者，化疗常常为唯一的治疗手段。因此，寻找三阴型乳腺癌的特异治疗靶点对于提高三阴型乳腺癌患者的疗效至关重要。2020年有研究研究报道发现，约30％的三阴型乳腺癌患者，存在环状rna circ
‑
her2
‑
676nt(circrna id:hsa_circ_0007766)的高表达。通过进一步研究发现环状rna circ
‑
her2
‑
676n翻译的功能性新蛋白很可能是三阴性乳腺癌复发和转移的主要因素，研究结果提示表达环化rna circ
‑
her2
‑
676n的三阴型乳腺癌患者，可通过单克隆抗体pertuzumab治疗来改善预后。据统计，2020年全球新发乳腺癌超过230万例，死亡约70万例。三阴型乳腺癌约占所有乳腺癌的10％
‑
15％，初步推测，全球每年新发三阴型乳腺癌约23
‑
35万例。该研究已在前期的细胞实验和动物实验取得成功，若在后期临床实验进一步证实有效，有望每年改善全球约10万例三阴型乳腺癌患者的预后。环状rna数据库circbase提示her2基因产生两个较高丰度的环状rna，除了环状rna circ
‑
her2
‑
676n，有研究者报道另外一个环状rna circ
‑
her2
‑
565nt(circrna id:hsa_circ_0043469)也和乳腺癌的发生发展有密切关联。
5.目前已经有使用荧光定量pcr以及数字定量pcr的方法对her2基因的表达进行定量检测，为肿瘤的临床治疗提供诊断及辅助用药指导；最近几年的研究显示，不光是her2的mrna和肿瘤的发生有关联，her2产生的环状rna和肿瘤的发病发展也有密切的关联，那么对her2基因的mrna以及环状rna的合并同时检测，在一个反应体系中检测线性mrna和环状rna的表达量，将会全面获得her2的mrna以及环状rna在肿瘤细胞中的表达信息。本项目通过采用多重荧光定量pcr同时对her2基因的mrna以及两个环状rna的检测，将为肿瘤的精准全面检测以及辅助用药指导提供一种更理想的检测方案。


技术实现要素：

6.为了解决以上现有技术中未有使用多重荧光定量pcr方法来同时检测her2 mrna及环状rna的记载，本发明以her2 mrna及环状rna为研究对象，建立了多重荧光pcr检测方
法。
7.本发明提供了一种her2 mrna及环状rna多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针。
8.本发明还提供了一种her2 mrna及环状rna多重荧光定量pcr检测试剂盒。该试剂盒具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，且能实时检测dna扩增反应，具有很高的可行性与应用前景。
9.本发明的另一个目的是提供上述检测引物对及特异性探针或检测试剂盒的应用。
10.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
11.本发明的第一个目的是提供一种her2基因的mrna及环状rna多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针，所述环状rna包括环状rna circ
‑
her2
‑
676nt和环状rna circ
‑
her2
‑
565nt；
12.可根据ncbi数据库检测获得her2基因的mrna序列信息，序列链接可参考https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_001005862；
13.所述her2 mrna的核苷酸序列如seq id no.1所示；gttctttattctactctccgctgaagtccacacagtttaaattaaagttcccggatttttgtgggcgcctgccccgcccctcgtccccctgctgtgtccatatatcgaggcgatagggttaagggaaggcggacgcctgatgggttaatgagcaaactgaagtgttttccatgatcttttttgagtcgcaattgaagtaccacctcccgagggtgattgcttccccatgcggggtagaacctttgctgtcctgttcaccactctacctccagcacagaatttggcttatgcctactcaatgtgaagatgatgaggatgaaaacctttgtgatgatccacttccacttaatgaatggtggcaaagcaaagctatattcaagaccacatgcaaagctactccctgagcaaagagtcacagataaaacgggggcaccagtagaatggccaggacaaacgcagtgcagcacagagactcagaccctggcagccatgcctgcgcaggcagtgatgagagtgacatgtactgttgtggacatgcacaaaagtgagtgtgcaccggcacagacatgaagctgcggctccctgccagtcccgagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaaggacatcttccacaagaacaaccagctggctctcacactgatagacaccaaccgctctcgggcctgccacccctgttctccgatgtgtaagggctcccgctgctggggagagagttctgaggattgtcagagcctgacgcgcactgtctgtgccggtggctgtgcccgctgcaaggggccactgcccactgactgctgccatgagcagtgtgctgccggctgcacgggccccaagcactctgactgcctggcctgcctccacttcaaccacagtggcatctgtgagctgcactgcccagccctggtcacctacaacacagacacgtttgagtccatgcccaatcccgagggccggtatacattcggcgccagctgtgtgactgcctgtccctacaactacctttctacggacgtgggatcctgcaccctcgtctgccccctgcacaaccaagaggtgacagcagaggatggaacacagcggtgtgagaagtgcagcaagccctgtgcccgagtgtgctatggtctgggcatggagcacttgcgagaggtgagggcagttaccagtgccaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggac
cagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcactgctggggtccagggcccacccagtgtgtcaactgcagccagttccttcggggccaggagtgcgtggaggaatgccgagtactgcaggggctccccagggagtatgtgaatgccaggcactgtttgccgtgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggaggctgaccagtgtgtggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgccccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatctggaagtttccagatgaggagggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcctgtgtggacctggatgacaagggctgccccgccgagcagagagccagccctctgacgtccatcatctctgcggtggttggcattctgctggtcgtggtcttgggggtggtctttgggatcctcatcaagcgacggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagaccatgtccgggaaaaccgcggacgcctgggctcccaggacctgctgaactggtgtatgcagattgccaaggggatgagctacctggaggatgtgcggctcgtacacagggacttggccgctcggaacgtgctggtcaagagtcccaaccatgtcaaaattacagacttcgggctggctcggctgctggacattgacgagacagagtaccatgcagatgggggcaaggtgcccatcaagtggatggcgctggagtccattctccgccggcggttcacccaccagagtgatgtgtggagttatggtgtgactgtgtgggagctgatgacttttggggccaaaccttacgatgggatcccagcccgggagatccctgacctgctggaaaagggggagcggctgccccagccccccatctgcaccattgatgtctacatgatcatggtcaaatgttggatgattgactctgaatgtcggccaagattccgggagttggtgtctgaattctcccgcatggccagggacccccagcgctttgtggtcatccagaatgaggacttgggcccagccagtcccttggacagcaccttctaccgctcactgctggaggacgatgacatgggggacctggtggatgctgaggagtatctggtaccccagcagggcttcttctgtccagaccctgccccgggcgctgggggcatggtccaccacaggcaccgcagctcatctaccaggagtggcggtggggacctgacactagggctggagccctctgaagaggaggcccccaggtctccactggcaccctccgaaggggctggctccgatgtatttgatggtgacctgggaatgggggcagccaaggggctgcaaagcctccccacacatgaccccagccctctacagcggtacagtgaggaccccacagtacccctgccctctgagactgatggctacgttgcccccctgacctgcagcccccagcctgaatatgtgaaccagccagatgttcggccccagcccccttcgccccgagagggccctctgcctgctgcccgacctgctggtgccactctggaaaggcccaagactctctccccagggaagaatggggtcgtcaaagacgtttttgcctttgggggtgccgtggagaaccccgagtacttgacaccccagggaggagctgcccctcagccccaccctcctcctgccttcagcccagccttcgacaacctctattactgggaccaggacccaccagagcggggggctccacccagcaccttcaaagggacacctacggcagagaacccagagtacctgggtctggacgtgccagtgtgaaccagaaggccaagtccgcagaagccctgatgtgtcctcagggagcagggaaggcctgacttctgctggcatcaagaggtgggagggccctccgaccacttccaggggaacctgccatgccaggaacctgtcctaaggaaccttccttcctgcttgagttcccagatggctggaaggggtccagcctcgttggaagaggaacagcactggggagtctttgtggattctgaggccctgcccaatgagactctagggtccagtggatgccacagcccagcttggccctttccttccagatcctgggtactgaaagccttagggaagctggcctgagaggggaagcggccctaagggagtgtctaagaacaaaagcgacccattcagagactgtccctgaaacctagtactgccccccatgaggaaggaacagcaatggtgtcagtatccaggctttgtacagagtgcttttctgtttagtttttactttttttgttttgtttttttaaagatgaaataaagacccagggggagaatgggtgttgtatggggaggcaagtgtggggggtccttctccacacccactttgtccatttgcaaatatattttggaaaaca(seq id no.1)可根据circbase(参见
链接http://circrna.org/)数据库检测获得her2基因产生的两个最高丰度的环状rna，人circ
‑
her2
‑
676nt(circrna id:hsa_circ_0007766)和人circ
‑
her2
‑
565nt(circrna id:hsa_circ_0043469)；
14.所述circ
‑
her2
‑
676nt的核苷酸序列如seq id no.2所示；
15.gatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaaggacatcttccacaagaacaaccagctggctctcacactgatagacaccaaccgctctcgggcctgccacccctgttctccgatgtgtaagggctcccgctgctggggagagagttctgaggattgtcagagcctgacgcgcactgtctgtgccggtggctgtgcccgctgcaaggggccactgcccactgactgctgccatgagcagtgtgctgccggctgcacgggccccaagcactctgactgcctggcctgcctccacttcaaccacagtggcatctgtgagctgcactgcccagccctggtcacctacaacacagacacgtttgagtccatgcccaatcccgagggccggtatacattcggcgccagctgtgtgactgcctgtccct(seq id no.2)
16.所述circ
‑
her2
‑
565nt的核苷酸序列如seq id no.3所示。
17.gaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagaccatgtccgggaaaaccgcggacgcctgggctcccaggacctgctgaactggtgtatgcagattgccaaggggatgagctacctggaggatgtgcggctcgtacacagggacttggccgctcggaacgtgctggtcaagagtcccaaccatgtcaaaattacagacttcgggctggctcggctgctggacattgacgagacagagtaccatgcagatgggggcaaggtgcccatcaagtggatggcgctggagtccattctccgccggcggttcacccaccagagtgatgtgtggagttatggtgtgactgtgtgggagctgatgacttttggggccaaaccttacgatgggatcccagcccgggagatccctgacctgctggaaaagggggagcggctgccccagccccccatctgcaccattgatgtctacatgatcatggtcaaat(seq id no.3)
18.优选的，her2 mrna的特异检测引物对及特异性探针为：
19.her2
‑
mrna
‑
f：5
’‑
gccctggtcacctacaacac
‑3’
；
20.her2
‑
mrna
‑
r：5
’‑
atcctctgctgtcacctctt
‑3’
；
21.her2
‑
mrna
‑
probe：5
’‑
acacagctggcgccgaatgta
‑3’
；
22.环状rna circ
‑
her2
‑
676nt的特异检测引物对及特异性探针为：
23.circ
‑
her2
‑
676nt
‑
f：5
’‑
gtgactgcctgtccctgata
‑3’
；
24.circ
‑
her2
‑
676nt
‑
r：5
’‑
tcgcacaatccgcagcctct
‑3’
；
25.circ
‑
her2
‑
676nt
‑
probe：5
’‑
ctacgtgctcatcgctcacaac
‑3’
；
26.环状rna circ
‑
her2
‑
565nt的特异检测引物对及特异性探针为：
27.circ
‑
her2
‑
565nt
‑
f：5
’‑
agatccctgacctgctggaa
‑3’
；
28.circ
‑
her2
‑
565nt
‑
r：5
’‑
cagccatcacgtatgcttca
‑3’
；
29.circ
‑
her2
‑
565nt
‑
probe：5
’‑
cagccccccatctgcaccat
‑3’
。
30.优选的，所述her2 mrna特异性探针、circ
‑
her2
‑
676nt特异性探针和circ
‑
her2
‑
565nt特异性探针的5’端带有荧光基团，3’端带有淬灭基团；
31.优选地，所述荧光基团为fam、hex、tet、joe、ned、vic、cy3、cy5、rox或tamra中的任意一种或至少两种的组合，其中，
32.her2 mrna特异性探针的荧光基团优选为cy5；
33.circ
‑
her2
‑
676nt特异性探针的荧光基团优选为vic；
34.circ
‑
her2
‑
565nt特异性探针的荧光基团优选为fam；
35.优选地，所述淬灭基团选自mgb、bhq
‑
1、bhq
‑
2、bhq
‑
3或phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合，其中，
36.her2 mrna特异性探针的淬灭基团优选为bhq2；
37.circ
‑
her2
‑
676nt特异性探针的淬灭基团优选为bhq1；
38.circ
‑
her2
‑
565nt特异性探针的淬灭基团优选为tamra。
39.本发明的第二个目的是提供一种用于同时检测her2基因的mrna及环状rna的检测试剂盒；所述试剂盒包括上述方案中所述的her2基因的mrna及环状rna多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针。
40.本发明的第三个目的是提供一种上述方案中所述的her2基因的mrna及环状rna多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针或上述方案所述的检测试剂盒在检测her2基因的mrna及环状rna单一表达或混合表达中的应用。
41.优选的，提取细胞来源样品中的rna，去除提取rna中的残留基因组dna，将所述rna反转录为cdna，利用上述方案中所述her2基因的mrna及环状rna多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针对所述her2基因的mrna及环状rna的cdna进行扩增。
42.优选的，进行扩展时使用的荧光定量pcr反应体系总体积为20μl，其中：2
×
qpcr mix 10μl；浓度为10μm的三对上下游引物各加0.4μl；三条浓度为10μm的特异性探针各加0.1μl；稀释5倍后的cdna各加1μl；加灭菌水至总体积为20μl。
43.优选的，扩增反应条件为：扩增程序为95℃3min，95℃10s，60℃10s，60℃31s，40个循环。
44.优选的，采用trizol法提取细胞来源样品中的总rna；采用dna酶消化法去除提取的rna中基因组dna的残留；用逆转录试剂盒将rna逆转录成cdna；
45.所述trizol法提取细胞来源样品中的总rna为：按照80万个左右细胞加入1ml trizol，冰上吹打裂解5min，然后加入200μl三氯甲烷，涡旋振荡15秒，冰上放置15min，4℃，12000g离心10min，用枪头将上清液体取400μl到新的离心管中，加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；4℃条件下，12000g离心10min，用枪头将上清去掉保留沉淀；加入1ml 75％冰冷的乙醇，轻轻颠倒，然后4℃条件下12000g离心5min，弃去上清；室温晾干沉淀后，加入20μl depc水溶解rna；
46.所述采用dna酶消化法去除提取的rna中基因组dna的残留为：反应液总体积为10μl，具体包括总rna 6μl、dnase酶ⅰ1.5μl、10
×
buffer1μl和无酶水1.5μl，反应液中于37℃消化1个小时后，85℃5min灭活dna消化酶；
47.所述用逆转录试剂盒将rna逆转录成cdna为：在总rna 2μg、随机引物0.5μl的反应体系和条件下，首先将rna和随机引物混合后，65℃5min变性，然后马上放在冰上；然后加入2
×
逆转录反应液10μl，无酶水补足至20μl，设置反应条件如下25℃10min，37℃10min，42℃10min，85℃5min。
48.本发明的又一个目的是提供一种如上述方案中所述的her2基因的mrna及环状rna多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针或上述方案中所述的检测试剂盒用于制备辅助
临床诊断、肿瘤相关靶向药物选择或乳腺癌诊断试剂和/或药物中的应用。
49.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
50.本发明建立的多重荧光定量pcr特异检测引物对及特异性探针在一个反应体系中检测线性mrna和环状rna的表达量，具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，具有很高的可行性与应用前景。通过采用多重荧光定量pcr同时对her2基因的mrna以及两个环状rna的检测，将为肿瘤的精准全面检测以及辅助用药指导提供一种更理想的检测方案。
附图说明
51.图1为her2 mrna荧光定量标准品梯度检测扩增曲线图；
52.图2为her2 mrna荧光定量标准品梯度检测标准曲线图；
53.图3为环状rna circ
‑
her2
‑
676nt荧光定量标准品梯度检测扩增曲线图；
54.图4为环状rna circ
‑
her2
‑
676nt荧光定量标准品梯度检测标准曲线图；
55.图5为环状rna circ
‑
her2
‑
565nt荧光定量标准品梯度检测扩增曲线图；
56.图6为环状rna circ
‑
her2
‑
565nt荧光定量标准品梯度检测标准曲线图；
57.图7为多重荧光定量pcr检测her2 mrna的含量；
58.图8为多重荧光定量pcr检测环状rna circ
‑
her2
‑
676nt的含量图；
59.图9为多重荧光定量pcr检测环状rna circ
‑
her2
‑
565nt的含量图。
具体实施方式
60.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
61.所述pcr标准品委托广州艾基公司进行合成；
62.所述核酸测定仪购自德国耶拿公司，型号scandrop 100；
63.所述荧光定量检测试剂2xqpcr反应液南京诺唯赞医疗科技有限公司，型号q222
‑
01；
64.所述乳腺细胞系mcf10a正常细胞、bt549(三阴性乳腺癌细胞)、mda
‑
mb
‑
468(三阴性乳腺癌细胞)、mda
‑
mb
‑
231(三阴性乳腺癌细胞)、mcf
‑
7(her2弱阳性乳腺癌细胞)、bt474(her2强阳乳腺癌细胞)购自广州库基生物公司；
65.所述逆转录试剂盒购自南京诺唯赞医疗科技有限公司，型号ra103。
66.实施例1her2 mrna及环状rna多重荧光定量pcr标准曲线扩增
67.1.1pcr标准品的制备
68.根据荧光定量pcr扩增的详细序列区间信息，通过化学核酸基因合成的策略制备荧光定量pcr的标准品，具体是将标准品序列委托基因合成公司(广州艾基公司)进行合成，然后将序列连接到pmd20t质粒载体上，构建成标准品。标准品序列信息如下：
69.1.1.1用于检测her2 mrna的质粒标准品片段序列如seq id no.4所示，her2
‑
mrna标准品片段序列信息具体如下：
70.gccctggtcacctacaacacagacacgtttgagtccatgcccaatcccgagggccggtatacattcggcgccagctgtgtgactgcctgtccctacaactacctttctacggacgtgggatcctgcaccctcgtctgccccctg
cacaaccaagaggtgacagcagaggat(seq id no.4)
71.1.1.2用于检测环状rna circ
‑
her2
‑
676nt的质粒标准品片段序列如seq id no.5所示，circ
‑
her2
‑
676nt标准品片段序列信息具体如下：
72.gtgactgcctgtccctgatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcga(seq id no.5)
73.1.1.3用于检测检测环状rna circ
‑
her2
‑
565nt的质粒标准品片段序列如seq id no.6所示，circ
‑
her2
‑
565nt标准品片段序列信息具体如下：
74.agatccctgacctgctggaaaagggggagcggctgccccagccccccatctgcaccattgatgtctacatgatcatggtcaaatgaagcatacgtgatggctg(seq id no.6)
75.1.2首先将制备的标准品质粒用核酸测定仪测浓度，然后根据质粒标准品的浓度结合插入质粒片段的碱基数目及质粒骨架的碱基数目计算出标准品的copy数浓度，将每个质粒标准品按照滴度稀释：500万copy/μl、50万copy/μl、5万copy/μl、5000copy/μl、500copy/μl共5个梯度；将对应的探针及引物、标准品和qpcr试剂盒混和后进行荧光定量qpcr测试绘制扩增曲线及标准曲线，检测设计的引物及配套探针是否能很好的有梯度线性关系(每个梯度重复3个孔)。具体多重荧光定量pcr反应体系及反应条件如下：
76.1.2.1多重荧光定量pcr反应体系：三对上下游引物(10μm)各加0.4μl，三条探针(10μm)分别加0.1μl，三个质粒标准品模板各加0.3μl，探针法荧光定量检测试剂2xqpcr反应液(诺唯赞公司)加10μl，加水补足20μl总体积。
77.1.2.2多重荧光定量pcr反应条件：采用abi7500荧光定量pcr仪器，对于每个反应孔同时设置三个荧光通道检测，同时检测cy5\vic\fam荧光信号，pcr反应程序设计为95℃预变性3min，循环内95℃变性10秒，60℃退火及延伸31秒，然后每个循环反应末端检测荧光信号，共计设计40个总反应循环。
78.1.3按照本项目的反应体系和条件进行对标准品的多重荧光定量pcr后，利用定量pcr仪器自带分析软件，分析her2 mrna及环状rna的梯度扩增曲线以及绘制标准曲线。
79.实验结果如图1
‑
6显示，图1
‑
6分别为her2 mrna、环状rna circ
‑
her2
‑
676nt和环状rna circ
‑
her2
‑
565nt荧光定量标准品梯度检测扩增曲线图和标准曲线图；结果显示通过多重荧光pcr对制备的标准品检测，设计的多重荧光pcr能很好的检测梯度稀释的标准样品，梯度关系良好，绘制标准曲线后，结果显示各标准曲线线性关系良好，具体是检测her2 mrna的引物和探针扩增标准品的相关系数r2＝1.000，扩增效率e＝94.008％，斜率s＝
‑
3.474；检测环状rna circ
‑
her2
‑
676nt标准品的引物和探针扩增的相关系数r2＝0.999，扩增效率e＝94.001％，斜率s＝
‑
3.475；检测circ
‑
her2
‑
565nt标准品的引物和探针扩增的相关系数r2＝0.996，扩增效率e＝100.248％，斜率s＝
‑
3.316。
80.实施例2her2 mrna及环状rna多重荧光定量pcr应用方法
81.2.1选用实验室常用的乳腺细胞系mcf10a正常细胞、bt549(三阴性乳腺癌细胞)、mda
‑
mb
‑
468(三阴性乳腺癌细胞)、mda
‑
mb
‑
231(三阴性乳腺癌细胞)、mcf
‑
7(her2弱阳性乳腺癌细胞)、bt474(her2强阳乳腺癌细胞)，按照各个细胞的培养条件(37℃，5％的co2浓度)在实验室中扩大培养细胞，等细胞长到80％密度，用经典的trizol方法提取细胞中的总rna，核酸浓度测定仪测定rna的浓度后，取2μg的rna，用逆转录试剂盒(诺唯赞公司产品)将rna逆转录成cdna，然后将cdna稀释5倍，取1μl稀释后的cdna进行多重荧光定量pcr检测
her2 mrna及环状rna在各个细胞系中的含量。
82.具体实验方法步骤：
83.2.1.1rna提取(trizol方法)
84.按照80万个左右细胞加入1ml trizol，冰上吹打裂解5min，然后加入200μl三氯甲烷，涡旋振荡15秒，冰上放置15min，4℃条件，12000g离心10min，用枪头将上清液体取400μl到新的离心管中，加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；4℃下，12000g离心10min，用枪头将上清去掉保留沉淀；加入1ml 75％冰冷的乙醇，轻轻颠倒，然后4℃条件下12000g离心5min，弃去上清；室温晾干沉淀后，加入20μl depc水溶解rna
85.2.1.2提取rna中残留的基因组dna去除
86.去除提取的rna中基因组dna的残留，采用dna酶消化法，反应体系和条件如下：
87.反应液总体积为10μl，如下组分组成：
88.表1酶消化法反应体系
89.组分组分分量总rna6μl(10微克)dnase酶ⅰ1.5μl10
×
buffer1μl无酶水1.5μl
90.反应液中于37℃消化1个小时后，85℃5min灭活dna消化酶。
91.2.1.3rna逆转录成cdna
92.将rna逆转录成cdna反应体系和条件如下：
93.表2逆转录反应体系
94.组分组分分量总rna2μg随机引物0.5μl
95.首先，将rna和随机引物混合后，65℃5min变性，然后马上放在冰上；
96.然后加入2
×
逆转录反应液10μl，无酶水补足至20μl，设置反应条件如下25℃10min，37℃10min，42℃10min，85℃5min。
97.2.1.4多重荧光定量pcr检测
98.参考本项目前期绘制标准扩增曲线反应体系和条件检测细胞样品的多重荧光定量pcr反应体系及反应条件如下：
99.多重荧光定量pcr反应体系：三对上下游引物(10um)各加0.4μl，三条探针(10um)分别加0.1μl，稀释5倍后的cdna 1μl，探针法荧光定量检测试剂2xqpcr反应液(诺唯赞公司)加10μl，加水补足20μl总体积。
100.2.1.5多重荧光定量pcr检测her2 mrna及环状rna在多个细胞系中的含量
101.根据本项目前期绘制的标准曲线及多重荧光定量pcr检测的各个细胞系的ct值，根据标准曲线以及稀释的倍数计算her2 mrna及环状rna在各个细胞系中的含量，结果以纵坐标(拷贝/纳克)表示。
102.检测结果如下如图7
‑
9所示，图7
‑
9为多重荧光定量pcr检测her2 mrna、环状rna circ
‑
her2
‑
676nt和rna circ
‑
her2
‑
565nt的含量图，结果显示本项目设计的多重荧光定量
pcr方法能有效检测细胞来源的样品中的her2 mrna以及环状rna的含量。
103.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。