玉米籽粒大小和粒重相关蛋白及其编码基因和应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种玉米籽粒大小和粒重相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：

1、玉米(zea mays l.)是最主要的粮食、饲料和经济能源作物之一，其生产安全对国家粮食安全有着极其重要的作用。随着世界人口的持续增加，人类对粮食的需求将与日俱增。但在当前耕地面积持续减少的形势下，提高单产水平成为解决玉米供需矛盾的根本途径。籽粒是玉米生产过程中的主要收获目标，而不断增加籽粒产量是玉米高产育种的最终目标。粒重是基本的玉米产量三要素之一(粒重、穗粒数、亩穗数)。因此，寻找与玉米籽粒粒重和大小相关蛋白及其编码基因，用于籽粒形成遗传基础研究或种质改良分子设计，对培育玉米新品种具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是如何提高植物的产量，例如如何提高玉米的产量。

2、为解决上述技术问题，本发明提供蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，所述应用可为下述d1)-d4)中任一种：

3、d1)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物籽粒大小和/或粒重中的应用；

4、d2)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物籽粒大小和/或粒重的产品中的应用；

5、d3)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育高产植物的产品中的应用；

6、d4)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；

7、所述蛋白质可为如下a1)、a2)或a3)：

8、a1)氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质；

9、a2)seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

10、a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质。

11、上述蛋白质可来源于玉米。

12、其中，seq id no.1由469个氨基酸残基组成。

13、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

14、所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag蛋白标签、his蛋白标签、mbp蛋白标签、ha蛋白标签、myc蛋白标签、gst蛋白标签和/或sumo蛋白标签等。

15、进一步地，所述的应用中，所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为生物材料，所述生物材料可为下述b1)至b9)中的任一种：

16、b1)编码上述蛋白质的核酸分子；

17、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

18、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

19、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

20、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

21、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；

22、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官；

23、b8)抑制或降低上述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低上述蛋白质的活性的核酸分子；

24、b9)含有b8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

25、当所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为b1)至b7)的生物材料时，所述调控植物籽粒大小和/或粒重可为降低所述植物的籽粒大小和/或粒重，如降低拟南芥的籽粒大小和/或粒重。当所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为b8)或b9)任一种的生物材料时，所述调控植物籽粒大小和/或粒重可为提高所述植物的籽粒大小和/或粒重，如增加玉米的籽粒大小和/或粒重。

26、进一步地，上述的应用中b1)所述核酸分子可为如下b1)至b3)任一项所示的dna分子：

27、b1)编码链的编码序列是seq id no.2所示的dna分子；

28、b2)编码链的核苷酸序列是seq id no.2所示的dna分子；

29、b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％以上同一性，且编码上述蛋白质的dna分子；

30、上述应用b8)所述核酸分子为表达靶向上述蛋白编码基因的grna的dna分子或为靶向上述蛋白编码基因的grna。

31、上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

32、上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

33、上述应用中，所述表达靶向上述蛋白编码基因的grna的dna分子可为下述任一种：

34、g1)编码链的编码序列如seq id no.4第437-542位所示的dna分子；和/或，

35、g2)编码链的编码序列如seq id no.5第437-542位所示的dna分子；和/或，

36、g3)编码链的编码序列如seq id no.6第437-542位所示的dna分子；和/或，

37、靶向上述蛋白编码基因的grna可为上述g1)、g2)或g3)编码的rna分子。

38、进一步地，上述grna的靶标序列可为：seq id no.3第82-101位所示的核苷酸(即5'-gagcatgcaaccgtcgtgcc-3')，和/或seq id no.3第179-198位所示的核苷酸(即5'-catagggcttccgcctcgtg-3')，和/或seq id no.3第259-278位所示的核苷酸(即5'-taacgaccgtgccgccaagg-3')。

39、进一步地，所述的应用中，所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为b8)或b9)所述的生物材料，所述调控植物籽粒大小和/或粒重可为提高所述植物的籽粒大小和/或粒重。

40、进一步地，上述的应用中所述植物可为下述p1)-p5)任一种：

41、p1)单子叶植物；

42、p2)禾本目植物；

43、p3)禾本科植物；

44、p4)玉蜀黍属植物；

45、p5)玉米。

46、进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为b1)至b7)任一种的生物材料，所述调控植物籽粒大小和/或粒重可为降低所述植物的籽粒大小和/或粒重。

47、进一步地，上述的应用中，所述植物可为下述e1)-e5)任一种：

48、e1)双子叶植物；

49、e2)罂粟目植物；

50、e3)十字花科植物；

51、e4)鼠耳芥属植物

52、e5)拟南芥。

53、上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

54、上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

55、所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

56、所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活,包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

57、上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过crispr-cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

58、本发明还提供提高玉米籽粒大小和/或粒重的方法，所述方法可包括通过敲除玉米中上述蛋白质的编码基因来提高玉米籽粒大小和/或者粒重。

59、上述的方法中，所述玉米可包括玉米自交系。

60、上述的方法中，所述敲除可利用crispr/cas9系统进行。

61、所述crispr/cas9系统可包括表达靶向上述的蛋白质的编码基因的sgrna的载体。

62、进一步地，所述的方法中，敲除玉米中上述蛋白质的编码基因可为将玉米中的编码链的编码序列是seq id no.2所示的dna分子进行下述f1)或f2)至少一种突变：

63、f1)将玉米中的编码链的编码序列是seq id no.2所示的dna分子突变为zm00001d025992/+1bp,-94bp基因，所述zm00001d025992/+1bp,-94bp基因的编码链的编码序列如seq id no.8所示。

64、f2)将玉米中的编码链的编码序列是seq id no.2所示的dna分子突变为zm00001d025992/+1bp,-93bp基因，所述zm00001d025992/+1bp,-93bp基因的编码链的编码序列如seq id no.9所示。

65、本发明还提供上述方法在创制玉米突变体植株和/或玉米育种中的应用。

66、基于crispr-cas9系统的敲除实验成功获得了上述蛋白编码基因的敲除转基因植株，收获转基因阳性植株自交获得的籽粒与野生型表型鉴定和比较的结果表明敲除zm00001d025992基因可增加玉米自交系的籽粒大小和/或粒重，而在拟南芥中过表达zm00001d025992基因导致相比于野生型植株，转基因阳性拟南芥籽粒变小，重量变轻，从而证明基因zm00001d025992在籽粒大小和粒重表型中具有重要的生物学功能。

67、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

68、(1)对本发明zm00001d025992蛋白的编码基因进行基因敲除后，玉米籽粒大小和粒重显著增加。

69、(2)基于crispr-cas9技术，本发明提供了一个新的靶基因，现有技术中没有对其进行相应基因敲除的技术教导。

70、(3)本发明为创制玉米突变体植株和/或玉米育种提供了更精准、高效、省时、省力、安全，无外源dna插入的技术方法，实现了对籽粒大小和粒重性状的精准改良，可以促进商业化玉米育种进程，克服传统育种的短板，缩短育种周期同时不影响其他性状。