一种鉴定茄子单性结实基因突变体的引物对及方法

本发明涉及生物，具体涉及一种鉴别茄子单性结实基因突变体方法。

背景技术：

1、茄子(solanum melongena l.)是我国主要设施蔬菜作物之一，优良品种是其产业发展的重要支撑，种质资源创新是茄子育种研究的首要任务。单性结实作为一个非常优良的农艺性状，对于茄子培育优质品种和适宜保护地的栽培品种及解决果实耐贮运、耐老化等方面均有较高的应用价值，因此，获得茄子单性结实种质，并研究单性结实基因，可以提高茄子果实产量，并可改善果实品质。

2、ems诱变育种是作物种质创新的重要手段，利用反向遗传学手段tilling(targeting induced local lesions in genomes)筛选ems突变体，是研究基因功能与获得优良种质资源的有效手段之一。

3、本项目在实验室前期构建的茄子ems突变体库基础上，以含有2000个m2株系的茄子ems突变体为基础，采用tilling技术，以果实发育关键基因arf7为目标基因，开展适于茄子突变体筛选的技术研究，建立一套基于tilling技术的茄子突变体筛选方法，筛选出目标基因arf7突变体。研究结果对功能基因组学和茄子种质创新具有非常重要的意义，对其它作物也具有重要的借鉴作用。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明探索了利用tilling技术进行茄子ems突变体筛选的方法，以得到一种茄子arf7基因突变的单性结实突变体。

2、技术方案

3、本发明提供了一种鉴别茄子arf7基因，包括以下步骤：从6个品种中选出普通栽培种ep26(作为野生型)及与数据库有单碱基差异的非洲红茄(作为突变体)的一段arf7序列并以此序列设计引物。将ep26和非洲红茄的dna按不同比例进行混合，使用light cycler480仪器进行hrm不同mg2+梯度检测实验，得到最佳分辨检测体系，可以检测含突变体基因的茄子植株。

4、提取茄子突变体库2000个单株dna，按8个单株dna为一组混池进行混合，利用得到的检测体系，检测含突变体单株的混池，再对含突变体混池中所有单株进行检测，得到突变体单株。

5、有益效果

6、本发明提供了一种基于茄子的tilling技术体系鉴定茄子单性结实突变体的方法。这种方法可以鉴别茄子ems突变体库中单性结实目的基因arf7的突变体，并可利用这个体系鉴定茄子突变体库中单性结实突变体。

7、本发明要解决的技术问题是：提供一种鉴别茄子单性结实基因arf7的引物及检测体系。通过hrm快速、准确的筛选出包含smearf7基因突变的材料，加快茄子单性结实新品种选育。

8、本发明的技术方案是：通过pcr扩增6个茄子品种arf7片段seq id no 7，找到与茄子数据库及其它品种有差异的品种作为突变体，与茄子数据库一致的一个品种作为野生型，构建hrm突变体筛选体系。所述arf7片段的扩增引物对的引物1为seq id no.1 所示序列，引物2为seq id no.2所示序列，seq id no.1：5’ccaacccaacaaggtc 3’； seq id no.2：5’tgaggtggcatgaaact 3’。

9、所述茄子hrm突变体筛选体系构建。通过上述找到的差异品种，设计arf7基因不同长度大小150，206，320bp的引物，将上述得到的突变体与野生型按不同比例dna混池，及设计不同浓度mg2+梯度的hrm反应体系进行检测，找到可以区分单性结实基因差异位点的hrm突变体检测体系。

10、所述单性结实基因突变体的检测。提取茄子突变体库所有m2株系dna混池(混合8个单株)，利用上述得到的突变体筛选体系对提取的dna混池进行筛选，得到有差异的 dna混池，再对有差异的混池进行单株检测，得到单性结实基因arf7突变单株。

技术特征：

1.一种鉴定茄子单性结实突变体后代基因型的引物对，其特征在于：所述引物对的引物1为seq id no.1所示序列，引物2为seq id no.2所示序列，seq id no.1：5’ccaacccaacaaggtc 3’；seq id no.2：5’tgaggtggcatgaaact 3’。使用与茄子数据库arf7片段(seq idno.7)有差异非洲红茄做为突变体，与茄子数据库一致的ep26做为野生型，使用上述目的基因有差异的序列设计引物。

2.如权利要求1所述的一种鉴定茄子单性结实突变体杂交后代基因型的引物对的检测方法，其特征在于：根据权利要求1中所述的引物对及设计另外两对不同大小(150bp，206bp)引物对，以被检测茄子的dna为模板进行扩增，dna模板按不同比例混样，分别为突变体，1：1(野生型：突变体)，3：1，7：1，15：1，野生型；扩增产物根据hrm曲线可区分野生型和突变体。所述引物对引物3为seq id no.3所示序列，引物4为seq id no.4所示序列，seq idno 3：5’cgaccagcttcaga agttacc 3’；seq id no.4：5’aaaagctgggc ctgaacatg 3’。所述引物对引物5为seq id no.5所示序列，引物6为seq id no.6所示序列，seq id no.5：5’agaagttaccaaccacca 3’；seq id no.6：5’cagctgattttgaaatgat 3’。

3.根据权利要求2所述的一种鉴定茄子单性结实突变体后代基因型的检测方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)采用ctab法提取烟草样品苗期叶片基因组dna；(2)以所述基因组dna为模板，利用上述引物对引物3和引物对4进行pcr扩增；(3)pcr扩增产物利用hrm检测仪器lightcycle进行突变位点扫描；(4)根据hrm曲线结果，判断茄子待检样品的基因型；以未经ems处理的野生型茄子dna为阴性对照，当待测样品的hrm曲线与阴性对照一致时，则为野生型材料；如果hrm荧光曲线峰值δf≥0.05，则为突变体。

技术总结
本发明公开了一种鉴定茄子单性结实基因的方法，主要包括:不同品种茄子基因组DNA提取、单性结实基因的PCR片段克隆测序、单性结实基因检测引物的设计、茄子HRM筛选体系的建立、HRM(高分辨率熔解曲线)反应体系等步骤。最后利用LightCycler 480的Gene Scanning 1.5version软件进行高分辨率熔解曲线分析。通过该方法能科学高效准确地检测出茄子单性结实基因。

技术研发人员：刘松瑜,周晓慧,杨艳,刘军,庄勇
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12