荔枝转基因体系的构建方法及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种荔枝转基因体系的构建方法及其应用。


背景技术：

2.荔枝（litchi chinensissonn.）是原产于我国的重要经济常绿果树。荔枝营养丰富，具有优良的果实品质，因而备受消费者的喜爱。但是荔枝不耐贮运，并且稳产性不高，所以急需建立荔枝转基因体系，促进品种的选育和品种改良的进程。但目前的研究中，尚未报道荔枝实生苗上成功构建转基因体系。


技术实现要素：

3.本发明的一个目的在于提供一种荔枝转基因体系的构建方法。
4.在一些实施方式中，所述荔枝转基因体系的构建方法包括以下步骤：步骤a：荔枝种子消毒后于无菌培养基中培养获得荔枝实生苗；步骤b：活化农杆菌得到侵染用农杆菌菌液，所述农杆菌中携带有目的基因；步骤c：使用所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗；步骤d：恢复培养后荔枝实生苗上获得到转基因根。
5.在一些实施方式中，所述无菌培养基为1/2 ms培养基。
6.在一些实施方式中，所述荔枝实生苗是指苗期为20-30天的荔枝实生苗；优选地，所述荔枝实生苗是指苗期为25天的荔枝实生苗。
7.在一些实施方式中，所述农杆菌为ar.qual发根农杆菌。
8.在一些实施方式中，所述农杆菌中含有筛选质粒；优选地，所述筛选质粒中含有报告基因ruby；更优选地，所述报告基因ruby由35s启动子引导表达。
9.报告基因ruby中包括甜菜碱生物合成基因 cyp76ad1、doda和葡萄糖基转移酶，这三个基因通过2a 肽相连。当其表达时可以产生甜菜碱生物合成所需的所有酶，可用于来追踪基因表达或可视化转基因。关于报告基因ruby的描述详见：he, yubing , zhang, tao , sun, hui , zhan, huadong , & zhao, yunde. a reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. horticulture research, 2020, 7(1)。本发明中通过在农杆菌中转入含有报告基因ruby的筛选质粒，可以非常简便直观地确认转基因是否成成功。
10.在一些实施方式中，所述步骤b具体为：将含有目的基因的农杆菌加入ty液体培养基，于28℃振荡培养2小时，离心重悬后，将菌液涂布在含有链霉素、卡那霉素的ty固体培养基上，28℃培养2天，挑单菌落于含有链霉素、卡那霉素和乙酰丁香酮的ty液体培养基中，28℃、220 rmp振荡培养得到侵染用农杆菌菌液。
11.在一些实施方式中，所述农杆菌菌液的od
600
值为0.5-0.7；优选地，所述农杆菌菌液的od
600
值为0.6。
12.在一些实施方式中，所述步骤c具体为：使用注射器吸取所述农杆菌菌液创伤侵染
荔枝实生苗的茎，然后避光静置。
13.在一些实施方式中，所述步骤c具体为：使用注射器吸取所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗的茎，然后避光静置30-45min，然后再次使用注射器吸取所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗的茎上同一伤口，然后避光静置1-2h。
14.在一些实施方式中，步骤d中恢复培养的环境条件为：温度24-26℃，暗培养8 h，光照培养16 h。
15.在一些实施方式中，步骤d中恢复培养的时间为2-3周。
16.本发明的另一个目的在于提供上述荔枝转基因体系的构建方法在荔枝品种选育及荔枝品种改良中的应用。
17.本发明的有益效果是：通过本发明的构建方法在荔枝实生苗上成功构建了荔枝转基因体系，在荔枝的转基因技术和基因功能验证具有重要的应用价值，为荔枝的品种选育和品种改良提供的研究工具。
附图说明
18.图1在荔枝实生苗茎上侵染发根农杆菌；图2ar.qual发根农杆菌侵染荔枝实生苗诱导的转基因根；图3含有pro35s:ruby质粒的ar.qual发根农杆菌侵染荔枝实生苗诱导的转基因根；图4含有pro35s:ruby质粒的ar.qual发根农杆菌侵染荔枝实生苗。
具体实施方式
19.以下结合附图和具体实施方式对本发明进行更全面的说明，但本发明的实施方式并不局限于此。
20.实施例1荔枝实生苗的获得一、荔枝种子的消毒方法：在市场上购买荔枝，首先将成熟的荔枝种子剥去果肉，用清水洗干净，去除多余的果肉。在超菌工作台上，将洗干净的种子置于75 %的酒精中浸泡2 min，用无菌水（利用高压灭菌锅121 ℃，15 min）冲洗一遍，再将种子置于3% naclo3（将购买的naclo3, 用无菌水稀释至浓度为2%） 30 min，用无菌水冲洗4-5遍，然后将种子播种于1/2 ms（1/2 ms基础培养基（coolaber），7 g/l琼脂粉，ph=5.7）培养基的培养瓶中，每一个培养瓶中放置一个种子。此消毒方法能达到荔枝种子污染率为0。
21.二、荔枝种子的培养：将培养瓶置于培生化养箱中，其培养条件为：温度24℃，黑暗培养8 h，光照培养16 h。
22.实施例2农杆菌的培养一、cauliflower mosaic virus (camv) 35s 启动子（后续缩写为pro35s）的克隆：利用primer premier 5.0软件设计pro35s全长序列的上下游引物如下：35s-f：catggagtcaaagattcaaatagag（seq id no.：1），35s-r：agtcccccgtgttctctccaaatg（seq id no.：）2，利用apexhf hs dna polymerase fs master mix（艾科瑞生物）进行pro35s全长序列的扩增。pcr反应体系为：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，退火温度55℃、30 s，72℃延
伸1 min，共35个循环；72℃继续延伸2 min。待反应结束后取1μlpcr产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，送至艾基生物公司进行测序。pro35s启动子的序列为：catggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggact（seq id no.：3）。
23.二、构建pro35s:ruby载体：1）pdr5:ruby载体的酶切：选择smai+pst i双酶位点，利用smai+pst i（takara）酶切pdr5:ruby（he et al.,2020）质粒，其酶切体系：1 μl sma i，1 μl pst i，2 μg pdr5:ruby质粒，25 μl0.5
×
t+bsa缓冲液, 加无菌水补充至体系为50 μl，反应体系：37 ℃，2 h。利用fastpure gel dna extraction minikit（vazyme）试剂盒进行酶切产物纯化。
24.2）pro35s:ruby构建：利用clonexpress
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ii one step cloning kit（vazyme），将克隆得到pro35s启动子连接到pruby载体上，控制载体与插入片段摩尔比为1 : 2，进行pro35s:ruby载体构建。
25.pdr5:ruby载体的描述详见：he, yubing , zhang, tao , sun, hui , zhan, huadong , & zhao, yunde. a reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. horticulture research, 2020, 7(1)，可通过向论文作者所在课题组申请获得。
26.三、pro35s:ruby载体的转化：将10 μl的连接产物即pro35s:ruby质粒，转化到100 μl ar.qual感受态（维地生物）中，在冰上静置5 min，液氮5 min，37℃水浴5 min，冰浴5 min。加入700 μl无抗生素的ty液体培养基，于 28℃摇床振荡培养2小时，5000 rpm离心1 min，留取大约100μl的上清，重悬菌液涂布于在含有链霉素（50 mg/l）、卡那霉素（100 mg/l）的ty固体培养基上，在培养箱中28℃培养2天。挑单菌落于含有链霉素（50 μg/ml）、卡那霉素（100 mg/l）和乙酰丁香酮(100 um)的ty液体培养基中，在28℃的摇床中，220 rmp振荡培养至菌液od600值约等于0.6。
27.上述使用的ty液体培养基的配方如下：配方浓度胰蛋白胨tryptone5g/l酵母提取物yeastextract3g/lcacl210mm配制ty固体培养基，则在ty液体培养基的配方中再加入15g/l 琼脂粉。
28.实施例3 侵染实验组在超菌工作台上，将含有pro35s:ruby质粒的ar.qual发根农杆菌菌液（od
600
值约等于0.6）分别通过1 ml注射器，注射到长在培养瓶中的荔枝幼苗的茎上如图1，荔枝幼苗的
苗期为25天，为避免菌液过多低落到培养基上污染培养基和植株，通过注射器先将一小滴菌液悬挂在茎上，然后通过注射器的针口，在悬挂有菌液的那一部分荔枝苗茎上戳出伤口，以便菌液侵染进入荔枝茎中，由于荔枝酚类物质较多，避光静置30 min后，要将菌液摇掉，重新将菌液注射到同一伤口上，在避光静置1-2 h。
29.对照组a将ar.qual发根农杆菌（od
600
值约等于0.6）注射到长在培养瓶中的荔枝幼苗的茎上，操作与实验组相同。
30.对照组b将含有pro35s:ruby质粒的ar.qual发根农杆菌菌液（od
600
值约等于0.6）注射到在基质里栽培的实生苗的茎上，操作与实验组相同。
31.实施例4侵染后荔枝实生苗的培养将生长在组培瓶中的实验组和对照组a的植株，置于生化培养箱中24℃，黑暗培养8 h，光照培养16 h进行培养。而对照组b 即直接栽培在土里的植株，其培养温度和时间与对照组a和实验组的培养条件一致，但是对照组b的培养湿度利用生化培养箱控制为95 %，大约2-3周后，对照组a的荔枝实生苗茎上能够成功诱导出根，但是长出的根为白色的如图2，并且对照组b即在土里栽培的转化了pro35s:ruby质粒的ar.qual发根农杆菌的荔枝实生苗茎上只能诱导出类似的愈伤组织，并且没有颜色变化如图4。只有在实验组即将含有pro35s:ruby质粒的ar.qual发根农杆菌菌液侵染，在培养瓶中生长的荔枝实生苗的茎上便能诱导长出红色的根，由于pro35s:ruby质粒能够成功使甜菜素的基因表达，所以能使根显现出红色如图3所示。
32.生成的红色的根作为标志可简便直观地判断出通过本发明实施例中的方法可以在荔枝实生苗上成功构建了荔枝转基因体系，当需要将目的基因转入荔枝实生苗时，仅需同时将含有目的基因的载体也转化到ar.qual发根农杆菌中，然后通过本发明实施例中的方法进行侵染和培养即可。
33.以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。