双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建

双生病毒dna1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建
技术领域
1.本发明涉及农业昆虫与害虫防治，具体是涉及双生病毒dna1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建。


背景技术：

2.粉虱，属半翅目粉虱科，主要种类有烟粉虱、柑桔粉虱和温室白粉虱等。在世界范围内广泛分布，其危害作物的方式为：
①
群集于叶背并通过其针状的刺吸式口器刺入植物的组织吸取叶片汁液，同时分泌大量蜜露诱发煤污病，影响植物的光合作用，影响植物的生长；
②
传播病毒，粉虱可传播的病毒达上百种，使植物染病减产。目前粉虱类昆虫的防治仍然以化学防治为主，由此带来的抗药性和环境污染等问题十分突出，而且该类昆虫危害植物部位为叶片背面，加大了触杀性药剂防治的难度。
3.随着技术研究手段的不断提高，分子生物学技术在病虫害防治的作用逐步提高，提升病虫害防治能力和水平同时，能够克服传统防治方法的弊端。病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, vigs)是干扰基因表达的一种简单而有效的方法。vigs也已成功应用于昆虫基因沉默，比如说trv载体已被用于沉默鳞翅目草食动物棉铃虫细胞色素p450基因，以及从烟粉虱(bemisia tabaci)的cypb、hsp70。vigs载体用于昆虫基因功能研究进行害虫防治的案例很多，但目前还未有关于vigs效果传播的研究。
4.由于烟粉虱传播的双生病毒侵染范围广泛，因此成为基因沉默载体的研究热点，2mdna1沉默载体是双生病毒tbcsv的dna1组分，是由烟粉虱传双生病毒卫星分子改造而来的载体，该病毒对番茄可系统侵染，在韧皮部特异表达，可以在植物中产生有效的基因沉默，在应用于植物介导的烟粉虱基因沉默时有其独特的优势，然而目前能否应用2mdna1沉默载体来沉默粉虱基因，并且粉虱能否传播vigs效果，从而实现对粉虱的防治作用尚不清楚。


技术实现要素：

5.为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的提出双生病毒dna1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建方法，将vigs载体2mdna1通过粉虱进行vigs效果的水平传播，避免农杆菌注射法获取大量vigs番茄时需要大批量培养相关菌株的麻烦与转基因育种时间和金钱成本，提供通过少批量栽种处理过的vigs番茄苗而达到防治粉虱类昆虫的田间应用方法。
6.本方案的目的是通过以下技术方案实现的，双生病毒dna1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建，其技术要点为：包括以下步骤：（1）2mdna1沉默表达载体构建
①ꢀ
获取粉虱基因靶标片段btbiob的pcr纯化产物
②ꢀ
所述靶靶标片段biob的pcr纯化产物、2mdna1载体分别进行双酶切，获得含有bamhi和xbai两个粘性末端的靶标基因biob片段、2mdna1载体片段；
③
所述含有bamhi和xbai两个粘性末端的靶标基因biob片段与2mdna1载体片段连接，获得2mdna1-biob连接产物；
④ꢀ
所述2mdna1-biob连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌dh5α；热击处理后进行2mdna1特异性检测，获得2mdna1-biob重组沉默表达载体，浓度调整为30-40 ng/μl；
⑤ꢀ
所述2mdna1-biob重组沉默表达载体电击转化eha105农杆菌感受态细胞；获得含2mdna1-biob沉默表达载体的农杆菌（2）2mdna1介导的粉虱基因沉默体系构建
①ꢀ
所述含2mdna1-biob沉默表达载体的农杆菌按照农杆菌侵染法接种健康植株后，通过2mdna1特异性检测，获得携带2mdna1沉默载体的vigs植株；
②ꢀ
在携带2mdna1沉默载体的vigs植株上饲养粉虱；获得具有2mdna1-biob沉默表达载体的粉虱，所述基因沉默的粉虱生物素合成基因biob表达被抑制，所述基因沉默的粉虱生物素含量降低。
7.（3） 2mdna1介导的粉虱基因沉默体系的水平传播所述具有2mdna1-biob沉默表达载体的粉虱接种健康植株，使健康植株获得了2mdna1沉默载体，获得携带2mdna1沉默载体的vigs植株，所述携带2mdna1沉默载体的vigs植株用于粉虱的防治。
8.进一步的，所述双生病毒dna1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建适用于烟粉虱、温室白粉虱。
9.进一步的，所述粉虱基因靶标片段btbiob具有seq id no：1所示的核苷酸序列；所述粉虱基因靶标片段btbiob获取的方法为：以粉虱cdna为模板，用引入了bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物，扩增目的基因有效片段；所述bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物为p-biob-f和p-biob-r，所述p-biob-f具有seq id no：2所示的核苷酸序列，所述p-biob-r具有seq id no：3所示的核苷酸序列；所述靶标基因片段长度为100-1000 bp，测序验证后用promega公司的纯化试剂盒纯化，获得靶标片段biob的pcr纯化产物。
10.进一步的，所述靶标片段biob的pcr纯化产物、2mdna1载体双酶切均采用takara 公司的quickcut限制性内切酶试剂盒；反应条件均为：30℃，1hour；37℃，1hour；70℃，10min使酶失活。
11.进一步的，所述含有bamhi和xbai粘性末端的biob靶标基因片段和2mdna1载体片段连接采用t4 dna ligase试剂盒，把靶标基因biob片段：2mdna1载体片段体积比为6.5 μl：1.5 μl，混匀后4℃过夜连接，获得2mdna1-biob连接产物。
12.进一步的，所述2mdna1特异性检测的引物为dna1f和dna1r ，所述dna1f具有seq id no：4所示的核苷酸序列，所述dna1r具有seq id no：5所示的核苷酸序列。
13.进一步的，所述步骤（2）2mdna1介导的粉虱基因沉默体系构建中，所述粉虱为烟粉虱，所述vigs植株为vigs番茄植株；所述在携带2mdna1沉默载体的vigs植株上饲养粉虱的方法为：取羽化1d的烟粉虱，在vigs番茄植株上饲喂3-5 d，获得2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱。
14.进一步的，所述步骤（3）2mdna1介导的粉虱基因沉默体系的水平传播中，所述粉虱
为烟粉虱，所述健康植株为番茄，所述具有2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱接种健康植株方法为：将装有烟粉虱的接种容器固定于健康番茄植株下部叶片，每株30-40头2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱，取食14d。
15.本发明的有益效果：（1）本方法通过粉虱取食vigs植株后生物素合成基因biob表达被抑制，然后生物素合成基因biob表达被抑制的粉虱再取食健康植株，使植株成为vigs植株，再被其他健康粉虱取食后，健康粉虱也成为生物素合成基因biob表达被抑制的粉虱，如此往复，形成基因沉默效果通过粉虱在植株间进行水平传播的效果，起到田间防治的作用。
16.（2）添加用生物素下降防治粉虱的优异性为：烟粉虱取食vigs植物韧皮部汁液，粉虱体内不能正常合成生物素，导致其体内生物素下降，死亡率极高，产卵量显著下降，种群数量被显著抑制，以此达到田间防治效果。
附图说明
[0017] 图1 为羽化1 d烟粉虱取食携带2mdna1沉默载体的vigs番茄3 d后生物素合成基因biob表达情况，图中2mdna1为取食携带2mdna1空载体番茄的烟粉虱，所述2mdna1-biob为取食携带2mdna1-biob番茄的烟粉虱；图2为羽化1 d烟粉虱取食携带2mdna1沉默载体的vigs番茄3 d后生物素含量变化，图中2mdna1为取食携带2mdna1空载体番茄的烟粉虱，所述2mdna1-biob为取食携带2mdna1-biob番茄的烟粉虱；图3：携带2mdna1-biob载体的烟粉虱使健康番茄感染载体的比例，通过2mdna1引物检测，证明健康番茄中具有2mdna1-biob载体。ck为未处理的番茄，ck+为2mdna1质粒pcr，1-8为通过烟粉虱水平传播载体的方式获得的番茄；图4为羽化1 d烟粉虱取食通过烟粉虱感染2mdna1-biob载体的番茄后的基因表达。
具体实施方式
[0018]
双生病毒dna1分子诱导的烟粉虱基因沉默体系的构建方法1．2mdna1沉默表达载体构建1.1 烟粉虱基因靶标片段的获取所述基因靶标片段btbiob具有seq id no：1所示的核苷酸序列：atggctttga gatggtcgct ggaggaggct ttgcgagtgt tcaaattacc gatggcagacttgatgtatc aggcccagtc tacccaccgg gccaacttca accctaacga aatgcaaatcagcacgcttc tgagcatcaa gacgggcgct tgcccagaaa actgctcgta ctgtccccagtcagcctact acaaaacgga gatcaagaag gagcctctga tggatttagc ggaggttgttgccgccgcga aggcagccaa agagggtgga agtacccgtt tctgcatggg tgctgcttggcgtggaccca ctgacaggaa tctcccgttg gtctgtgata tggtcaaaga ggtgaagaagttgggtctag agacttgcgt tacattagga cttctgaagg accgccacgc ggtacaactaaaagaggccg gactggactt ctacaaccac aacatcgaca cgtcgccgga gtactacaagaagatcatct cgacgaggac tttcgaggat cgaatccgga ccctggagca cgtgcgcaac
gccgggatca aggtctgctg cggcgggatc ctcgggatgg gcgagaacac cgaggaccggatcaagatgc tcctggtgtt ggcgaacctg gaggagcctc ctgaatcagt cccgatcaatcagctgattc cgatccctgg gactccactc gccgatgcgg atcccgtcga gggcaccgacttcgtgcgga ccatcgctct cacccgggtc atgatgccca aggcctacat ccgtctctccgccggccggg agaacatgtc cgaggagatg cagacgctct gttttttggc gggagtcaactctatcttct acggcgagaa gctcctcacg gccaagaact tccagccgag caaggacgatcagttactca gtaagctcgg cttcaagaag atggagatcg atgagacgcc ggccagcagtcagtgtaagg aggcggccat tgggtga所述烟粉虱基因靶标片段获取的方法为：以烟粉虱cdna为模板，用引入了bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物，扩增目的基因有效片段；所述bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物为：p-biob-f（seq id no：2）:cgggatcctcgggatgggcg；p-biob-r（seq id no：3）:gctctagatcacccaatggccgcctc）；所述靶标基因片段长度为100-1000 bp，测序验证后用promega公司的纯化试剂盒纯化，获得靶标片段biob的pcr纯化产物；可参考：ren fr, sun x, wang ty, yao yl, huang yz, zhang x, et al. biotin provisioning by horizontally transferred genes from bacteria confers animal fitness benefits. isme j. 2020; 14(10):2542-53。
[0019]
1.2 靶标片段pcr纯化产物与2mdna1载体双酶切采用takara 公司的quickcut试剂盒；所述靶标片段pcr纯化产物与2mdna1载体反应条件：分别30℃，1hour；37℃，1hour；70℃，10min使酶失活；获得含有bamhi和xbai两个粘性末端的靶标基因biob片段和2mdna1载体片段。
[0020]
1.3 靶标基因biob片段与2mdna1载体片段连接使用t4 dna ligase（promega公司的酶）将含有bamhi和xbai粘性末端的biob靶标基因片段，和2mdna1载体片段按照t4 dna ligase配套的说明书，把靶标基因biob片段：2mdna1载体片段体积比为6.5 μl：1.5 μl，混匀后4℃过夜连接，获得2mdna1-biob连接产物。
[0021]
1.4 2mdna1-biob连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌dh5α具体操作步骤如下：（1）取一管-80℃冰箱保存的大肠杆菌dh5α感受态细胞（购买于takara公司），置冰上融化；（2）在超净工作台中，取一无菌的2ml离心管，加入10 μl2mdna1-biob连接产物、50 μl感受态细胞，轻弹混匀，冰浴10-30 min；（3）42 ℃热击60-90 s后迅速置冰上冷却5 min；（4）加入940 μl lb液体培养基（无抗生素），于37 ℃、200 rpm摇床中振荡培养1 h；（5）8,000 rpm离心1 min，留下200 μl沉淀，重悬菌液后分别取适量均匀涂布于lb-kana平板（x-gal（20 μl）、iptg（10 μl），37 ℃倒置培养过夜；
（6）用无菌小号枪头挑取白色单菌落于lb-kana液体培养基中，37 ℃条件下，摇床230 rpm培养8-10 h 后做相关检测。
[0022]
参考的文献：huang, c.j., xie, y., & zhou, x.p. (2010). efficient virus
‐
induced gene silencing in plants using a modified geminivirus dna1 component. plant biotechnol j, 7(3), 254-265；黄昌军（2009）双生病毒dna1分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用。
[0023]
转化后大肠杆菌菌液pcr进行 2mdna1特异性检测：引物dna1f（seq id no：4）:gtatgagcctttaatggcc；引物dna1r（seq id no：5）:gagactcttcctcttgcc；验证正确的菌株即含有2mdna1-biob重组质粒，在大肠杆菌dh5α中大量培养复制，通过天根公司的质粒小提试剂盒提取菌体的重组质粒，即为2mdna1-biob重组沉默表达载体，将重组质粒的浓度调整到30-40 ng/μl；后用于下一步电击转化。
[0024]
1.5 2mdna1-biob重组沉默表达载体电击转化农杆菌eha105步骤如下：（1）取上一步10 μl重组质粒加入到200 μl根癌农杆菌感受态细胞中，用无菌枪头抽吸几次轻轻混匀，转入事先清洗并预冷过的电击杯中，盖好盖子置于冰上10 min；（2）准备好电击装置（bio-rad），电压调至2400 v，电脉冲25 μf，电阻400 ω，用擦镜纸把电击杯表面擦干，尤其是电极的部分不能有水，将电击杯放入电转仪的卡槽里，按下电击按钮，直至提示电击结束，出现电击成功的光滑曲线；（3）把电击杯取出放入超净工作台室温静置2 min，加入800 μl不含抗生素的yep液体培养基，反复抽吸几次，使菌均匀分布便于转移到无菌的2 ml离心管中，在28 ℃培养箱中静置1 h，待感受态农杆菌恢复活力后以200 rpm转速振荡培养3-4 h；（4）上述培养液可室温静置半天后再进行后续操作；（5）8000 rpm离心3 min，弃800 μl上清培养基，留下200 μl菌体，充分重悬混匀，根据yep固体培养基的湿润程度（每15 ml培养基含x-gal（20 μl）、iptg（10 μl、硫酸卡那霉素kana 终浓度100 μg/ml、利福平rif 终浓度50 μg/ml）进行蓝白斑筛选），取适量的菌液于yep-kana-rif平板上涂布均匀（涂布后平板表面尽可能比较干燥，便于长出来单克隆，如果未长出来单克隆，可适当降低抗生素浓度后再次重新涂布培养），在培养箱中28℃倒置避光培养48-72；（6）重组农杆菌相关检测参照1.4该步骤获得了含2mdna1-biob沉默表达载体和2mdna1空载体的农杆菌eha105菌株，成功构建了2mdna1-biob沉默表达载体。
[0025]
2．2mdna1介导的烟粉虱基因沉默体系构建2.1 农杆菌侵染法获取vigs番茄通过农杆菌侵染法获取vigs番茄（番茄的品种l402），具体方法如下：（1）将1.5中含2mdna1-biob沉默表达载体和2mdna1空载体的农杆菌eha105菌株按照体积比1：100分别接种在10 ml含kana（100 μg/ml）和rif（50 μg/ml）的yep液体培养基中，在28 ℃、230 rpm摇床中培养约12-16 h至对数生长期；（2）8000 rpm离心5-10 min，弃去所有上清；
assay for biotin determination in insects. insect sci, 28(2), 415-418。
[0029]
2.3 2mdna1介导的粉虱基因沉默体系的水平传播用取食携带2mdna1和2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱接种健康番茄，所述携带2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱导致健康番茄获得了2mdna1相关沉默载体，从而起到防治粉虱作用。具体步骤如下：采用步骤2.1获得的携带沉默载体的vigs番茄植株饲养烟粉虱，具体方法为：取羽化1d的烟粉虱，在vigs番茄上饲喂3-5 d，获得携带2mdna1（对照）和2mdna1-biob（基因沉默处理组）沉默表达载体的烟粉虱，单头烟粉虱提dna利用2mdna1特异性引物（dna1f和dna1r）进行普通pcr检测，经检测取食vigs番茄后所有烟粉虱均携带2mdna1相关沉默载体。按照这种方法可以获得大量携带沉默载体的烟粉虱（对照和处理都有）。
[0030]
取40头携带2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱用夹叶笼固定到3-5片真叶的健康番茄幼苗下部叶片上，每株番茄夹一个夹叶笼，这些烟粉虱持续在健康的番茄上取食14 d，此时番茄大约生长至6-8片真叶，参照2.1方法提取番茄上部幼嫩叶片dna，通过普通pcr检测这些番茄携带载体的情况，携带载体的番茄可用于后续烟粉虱饲养。结果如图3，本步骤获得了烟粉虱水平传播获得的携带2mdna1和2mdna1-biob沉默表达载体的番茄，可用于烟粉虱饲养。
[0031]
2.4 烟粉虱取食2mdna1-biob沉默表达载体水平传播获得的番茄基因表达在2.3中获得的番茄上饲喂羽化1 d的烟粉虱，烟粉虱基因表达参照2.2进行。基因表达结果见图4，烟粉虱取食3 d（对照2mdna1-control，处理组2mdna1-biob），处理组biob基因表达显著下调，下调了90%（p 《 0.001）。
[0032]
2mdna1是一种很有前景的昆虫基因沉默载体，特别是取食植物韧皮部的昆虫。该载体既对靶标害虫有很强的特异性，又降低了对生态系统中其他生物的不安全性，该研究首次证明了由昆虫传播的病毒改造的基因沉默载体又能够通过昆虫在不同植物个体间水平传播，扩大害虫基因沉默的效果，更有助于应用于田间。
[0033]
如果vigs效果可以传播，那么通过携带沉默载体的烟粉虱便可不断获取可用于烟粉虱防治的番茄（沉默表达载体的寄主均可），弥补了vigs技术应用时仅能通过农杆菌侵染法获取的缺陷，放大vigs技术的应用范围和效果，有利于实验室和田间应用。
[0034]
此外，本方法适用于其他粉虱类昆虫，如白粉虱，2mdna1介导的粉虱基因沉默体系的水平传播的植物包括茄科、豆科、十字花科、葫芦科等的重要经济作物和苋科、大戟科、菊科、锦葵科、秋海棠科等多种多样的杂草，但不限于以上作物。