1.本发明涉及一种用于土壤修复的农用微生物菌剂及其制备方法，属于微生物技术领域。
背景技术：
2.土壤作为陆地生态系统重要组成部分，是人类和动物居住不可替代的环境因子，也是食物安全与人体健康的基本保障，在保护环境和维持生态平衡中具有重要作用。随着世界人口的不断增长和工业化进程的加快，以及人们对环境的不合理利用，导致污染土壤的面积不断扩大，严重威胁人们的生产生活。为了实现土壤的可持续利用，保障人类获得充足且安全的食品，迫切需要研究并提出经济、高效、可行的污染土壤修复技术。实践证明，微生物菌剂的施用为农作物的生长提供了丰富的营养元素，其中的有益菌分泌赤霉素、生长素等活性物质，刺激、调节、促进作物的生长发育，有利于农作物增产。一些有益菌（如芽孢杆菌）还具有分泌抗生素类物质和多种活性酶的功能，能抑制或杀死致病菌，降低病害发生及增强作物的抗逆性，如可增强农作物的抗旱、耐寒、抗倒伏、防病及抗盐碱能力，同时还能有效预防作物生理性病害的发生。微生物菌剂施加在土壤中能够促进土壤中难溶性养分的溶解和释放，提高土壤养分的供应能力，增加土壤有机质，活化土壤中的潜在养分，改善土壤中养分的供应状况。目前关于微生物菌剂的制备工艺，存在制备过程复杂的问题，更关键的是微生物的存活率不高，促生效果不明显，制约了微生物菌剂的应用。
技术实现要素：
3.本发明的目的是针对现有技术存在微生物存活率不高的缺陷，提出一种用于土壤修复的农用微生物菌剂及其制备方法，以提升微生物菌剂中有效活菌数。
4.本发明通过以下技术方案解决技术问题：首先提供一种用于土壤修复的农用微生物菌剂，所述农用微生物菌剂由芽孢杆菌菌种与保护剂组成的菌悬液、与菌悬液混合的载体组成并制成固态微生物菌剂，所述芽孢杆菌菌种与保护剂的混合比例范围是100： 2-4，所述菌悬液与载体的混合比例范围是5-7：1，所得农用微生物菌剂中芽孢杆菌有效活菌数为3.66亿/g。
5.本发明进一步提供用于土壤修复的农用微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：第一步、筛选菌种，对根际土壤中菌种筛选并鉴定获得芽孢杆菌菌株;第二步、培养菌种，将芽孢杆菌菌株接种到培养基中培养得到芽孢杆菌菌液；第三步、制备菌悬液，将芽孢杆菌菌液与保护剂混合制备成菌悬液；第四步、添加载体，将菌悬液与载体按比例混合得到混合物；第五步、真空冷冻干燥，将第四步所得混合物预先冷冻，抽真空后制得固态芽孢杆菌微生物菌剂，且所述农用微生物菌剂中芽孢杆菌有效活菌数为3.66亿/g。
6.上述方法的所述第一步中，所述芽孢杆菌菌种自菊芋根际土壤中筛选得到，筛选步骤为取菊芋根际土壤，加入0.09%灭菌生理盐水，恒温摇床振荡培养，制备土壤悬液，利用
灭菌生理盐水依次10-3-10-5
梯度稀释，充分混匀，吸取10-3-10-5
梯度稀释液涂布至lb平板，28℃培养，挑选不同生长形态的单个典型菌落，经lb平板划线纯化，得到单个菌种，最后用80%甘油与菌种1:1混合后保存于-70℃冰箱备用。鉴定方法为获得的菌液经dna提取、pcr扩增，使用的引物为细菌通用引物：27f（5-agagtttgatcctggctcag-3）以及1429r（5-ggttaccttgttacgactt-3）。利用16s rdna序列测序进行菌种鉴定，最终确定芽孢杆菌菌株。
7.所述第二步中，将芽孢杆菌菌种以3%的接种量接种到lb液体培养基中，调节ph为7，在30℃条件下200r/min震荡培养48h获得芽孢杆菌菌液。
8.所述第三步中的保护剂为4%海藻糖。
9.所述第四步中的载体为水稻秸秆,所述水稻秸秆经研磨，过30目筛，121℃灭菌30min，置于105℃烘箱中烘干。所述载体与菌悬液的比例为1:5。
10.所述第五步中真空冷冻干燥条件为-50℃，真空50pa。
11.在菌种的培养方法中，需注意接种量，接种量太少会导致菌体延迟期太长，容易出现染杂菌的状况；接种量太多可以缩短繁殖到高峰的时间，但是菌体生长过快，培养基粘度增加，造成溶解氧不足或营养机质缺乏，本发明通过筛选培养发现3%的接种量最合适，有利于促进培养基中菌种的生长繁殖速度，保证其产生大量芽孢。
12.本发明提供了一种用于土壤修复的农用微生物菌剂及其制备方法，具体的是通过筛选培养芽孢杆菌菌种，促使其产生大量芽孢，保证微生物菌剂中芽孢杆菌的有效活菌数，并加入保护剂、载体保证菌种活性，测得农用微生物菌剂中芽孢杆菌有效活菌数为3.66亿/g，符合农用微生物菌剂的使用标准，且高于现有技术中产品的有效活菌数，其有益效果是：解决了现有技术中微生物菌剂有效活菌数不高的问题。菌悬液与载体混合干燥的过程中，使用的载体为水稻秸秆，该载体可以有效保护芽孢杆菌菌种的芽孢，保证其活性的同时，实现了水稻资源的合理化应用，减少了资源的浪费，降低了固态微生物菌剂的使用成本，提高了芽孢杆菌微生物菌剂的使用效益。
具体实施方式
13.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
14.下面结合实施例1-3对本发明的固态芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法进行详细说明。
15.实施例1本实施例提供了一种用于土壤修复的蜡状芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法。包括如下步骤：s1、菌种筛选鉴定：称取根际土壤5 g，加入到45 ml 0.09%的灭菌生理盐水中，在恒温摇床28℃，180 rpm振荡30 min制成土壤悬液。精确吸取100 μl土壤悬液于900 μl灭菌生理盐水中，依次进行梯度稀释，充分混匀，吸取10-3-10-5
三个梯度各100 μl涂布至lb平板，重复3次，28℃培养2-3天。将不同形态的单个典型菌落挑取，经lb平板划线纯化3-4次后，80%甘油与菌种1:1混合保存于-70℃冰箱。获得的菌液经dna提取，pcr扩增，过程中使用
的引物为细菌通用引物：27f（5-agagtttgatcctggctcag-3），以及1429r（5-ggttaccttgttacgactt-3）。反应体系（50
µ
l）：超纯水21
ꢀµ
l，引物上下游各2
ꢀµ
l，taq mix 酶25
ꢀµ
l。扩展反应程序：
①
95℃预变性5 min，
②
95℃变性15 s，
③
58℃退火15 s，
④
72℃延伸1.5 min，
⑤
72℃继续延伸5 min，步骤2-4进行35个循环。pcr扩增的产物利用2.5%的琼脂糖凝胶电泳上检验，将亮度好、单一性高的特异性条带(1500 bp 左右)进行切胶回收，连接 peasy克隆载体(transgen code:cb101-01)转入大肠杆菌，使用引物m13f/m13r验证转化效果，并且选取阳性克隆交由擎科测序公司进行测序。测序回来的结果放入genbank 数据库中来获取同源性高的菌株，利用megalign软件对分离菌株和比较菌株的16s rdna部分序列进行比对分析，确定为蜡状芽孢杆菌。
16.s2、菌种培养：将蜡状芽孢杆菌菌种以3%的接种量接种到lb液体培养基中，调节ph为7，在30℃条件下200r/min震荡培养48h左右获得菌液；s3、菌悬液制备：以获得蜡状芽孢杆菌菌液总体积的4%投加海藻糖作为保护剂，充分混合制备菌悬液。保护剂在冻干时使溶液呈过冷状态，降低了溶液结冰的速度，避免细胞在冷冻或加热时由于盐类浓缩，使细胞脱水而导致细胞发生渗透压性休克、细胞壁和细胞膜的塌陷、蛋白质变性等不良后果。
17.保持菌液总体积与保护剂的比例在100：4，可以避免细胞在冻干时暴露区域及细胞通透性过大，最终达到降低死亡率的目的；s4、载体添加：将水稻秸秆研磨，过30目筛，121℃灭菌30min，置于105℃烘箱中烘干，菌悬液与载体按5:1比例混合；s5、真空冷冻干燥：将菌悬液与载体混合物-20℃预先冷冻，-50℃，真空50pa的条件下抽真空，细胞内外的游离水便会在冻结状态下直接升华为气体从而将物料中的水分除去，达到冷冻干燥的目的，进而制得固态蜡状芽孢杆菌微生物菌剂。
18.s6、有效活菌数：通过稀释平板法测得蜡状芽孢杆菌微生物菌剂中芽孢杆菌有效活菌数为3.66亿/g。
19.实施例2本实施例提供了一种用于土壤修复的蜡状芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法。包括如下步骤：s1、菌种筛选鉴定：称取根际土壤5 g，加入到45 ml 0.09%的灭菌生理盐水中，在恒温摇床28℃，180 rpm振荡30 min制成土壤悬液。精确吸取100 μl土壤悬液于900 μl灭菌生理盐水中，依次进行梯度稀释，充分混匀，吸取10-3-10-5
三个梯度各100 μl涂布至lb平板，重复3次，28℃培养2-3天。将不同形态的单个典型菌落挑取，经lb平板划线纯化3-4次后，80%甘油与菌种1:1混合保存于-70℃冰箱。获得的菌液经dna提取，pcr扩增，过程中使用的引物为细菌通用引物：27f（5-agagtttgatcctggctcag-3），以及1429r（5-ggttaccttgttacgactt-3）。反应体系（50
µ
l）：超纯水21
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l，引物上下游各2
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l，taq mix 酶25
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l。扩展反应程序：
①
95℃预变性5 min，
②
95℃变性15 s，
③
58℃退火15 s，
④
72℃延伸1.5 min，
⑤
72℃继续延伸5 min，步骤2-4进行35个循环。pcr扩增的产物利用2.5%的琼脂糖凝胶电泳上检验，将亮度好、单一性高的特异性条带(1500 bp 左右)进行切胶回收，连接 peasy克隆载体(transgen code:cb101-01)转入大肠杆菌，使用引物m13f/m13r验证转化效果，并且选取阳性克隆交由擎科测序公司进行测序。测序回来的结果放入genbank 数据库
中来获取同源性高的菌株，利用megalign软件对分离菌株和比较菌株的16s rdna部分序列进行比对分析，确定为蜡状芽孢杆菌。
20.s2、菌种培养：将蜡状芽孢杆菌菌种以3%的接种量接种到lb液体培养基中，调节ph为7，在30℃条件下200r/min震荡培养48h左右获得菌液；s3、菌悬液制备：以获得蜡状芽孢杆菌菌液总体积的3%投加海藻糖作为保护剂，充分混合制备菌悬液。
21.保持菌液总体积与保护剂的比例在100：3，避免细胞的通透性受影响；s4、载体添加：将水稻秸秆研磨，过30目筛，121℃灭菌30min，置于105℃烘箱中烘干，菌悬液与载体按6:1比例混合；s5、真空冷冻干燥：将菌悬液与载体混合物-20℃预先冷冻，-55℃，真空50pa的条件下抽真空，细胞内外的游离水便会在冻结状态下直接升华为气体从而将物料中的水分除去，达到冷冻干燥的目的，进而制得固态蜡状芽孢杆菌微生物菌剂。
22.s6、有效活菌数：通过稀释平板法测得蜡状芽孢杆菌微生物菌剂中芽孢杆菌有效活菌数为3.6亿/g。
23.实施例3本实施例提供了一种用于土壤修复的蜡状芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法。包括如下步骤：s1、菌种筛选鉴定：称取根际土壤5 g，加入到45 ml 0.09%的灭菌生理盐水中，在恒温摇床28℃，180 rpm振荡30 min制成土壤悬液。精确吸取100 μl土壤悬液于900 μl灭菌生理盐水中，依次进行梯度稀释，充分混匀，吸取10-3-10-5
三个梯度各100 μl涂布至lb平板，重复3次，28℃培养2-3天。将不同形态的单个典型菌落挑取，经lb平板划线纯化3-4次后，80%甘油与菌种1:1混合保存于-70℃冰箱。获得的菌液经dna提取，pcr扩增，过程中使用的引物为细菌通用引物：27f（5-agagtttgatcctggctcag-3），以及1429r（5-ggttaccttgttacgactt-3）。反应体系（50
µ
l）：超纯水21
ꢀµ
l，引物上下游各2
ꢀµ
l，taq mix 酶25
ꢀµ
l。扩展反应程序：
①
95℃预变性5 min，
②
95℃变性15 s，
③
58℃退火15 s，
④
72℃延伸1.5 min，
⑤
72℃继续延伸5 min，步骤2-4进行35个循环。pcr扩增的产物利用2.5%的琼脂糖凝胶电泳上检验，将亮度好、单一性高的特异性条带(1500 bp 左右)进行切胶回收，连接 peasy克隆载体(transgen code:cb101-01)转入大肠杆菌，使用引物m13f/m13r验证转化效果，并且选取阳性克隆交由擎科测序公司进行测序。测序回来的结果放入genbank 数据库中来获取同源性高的菌株，利用megalign软件对分离菌株和比较菌株的16s rdna部分序列进行比对分析，确定为蜡状芽孢杆菌。
24.s2、菌种培养：将蜡状芽孢杆菌菌种以3%的接种量接种到lb液体培养基中，调节ph为7，在30℃条件下200r/min震荡培养48h左右获得菌液；s3、菌悬液制备：以获得蜡状芽孢杆菌菌液总体积的2%投加海藻糖作为保护剂，保持菌液总体积与保护剂的比例在100：2，充分混合制备菌悬液。
25.s4、载体添加：将水稻秸秆研磨，过30目筛，121℃灭菌30min，置于105℃烘箱中烘干，菌悬液与载体按7:1比例混合；s5、真空冷冻干燥：将菌悬液与载体混合物-20℃预先冷冻，-60℃，真空50pa的条件下抽真空，细胞内外的游离水便会在冻结状态下直接升华为气体从而将物料中的水分除
去，达到冷冻干燥的目的，进而制得固态蜡状芽孢杆菌微生物菌剂。
26.s6、有效活菌数：通过稀释平板法测得蜡状芽孢杆菌微生物菌剂中芽孢杆菌有效活菌数为3.6亿/g。
27.本实施例提供了一种用于土壤修复的农用微生物菌剂的应用：将本实施例的蜡状芽孢杆菌菌剂与有机肥料配施。
28.本实施例步骤1中蜡状芽孢杆菌可产生细胞蛋白酶、抗菌物质等，抑制有害微生物的繁殖，优化微生物群落结构，降解土壤中难溶的营养成分，改善土壤生态环境。
29.蜡状芽孢杆菌（bacillus cereus strain yr1），筛选自菊芋根际土壤。
30.以实施例的产品在大麦上的应用为例对实施例的产品效果进行验证。
31.在大麦上使用实施例的蜡状芽孢杆菌菌剂，考察其对于大麦的生长发育及土壤性质的影响，为进一步推广微生物菌剂的应用提供科学依据。
32.1、试验时间及地点试验时间：2020年8月12日-2020年11月8日。
33.试验地点：江苏省南京市玄武区卫岗一号。
34.2、材料与方法2.1、供试土壤：土壤类型为滨海盐渍土，砂质土壤，土壤有机质含量低，养分贫瘠。
35.2.2、供试肥料：当地常规施用肥料、实施例的蜡状芽孢杆菌菌剂、菊糖。
36.2.3、供试品种：大麦。
37.2.4、试验方法2.4.1、试验设计：试验采用盆栽试验的方式，布置3个处理，3次重复，具体处理如下：处理1：常规施肥处理2：常规施肥+蜡状芽孢杆菌菌剂处理3：常规施肥+蜡状芽孢杆菌菌剂+菊糖2.4.2、施肥方法：
①
常规施肥：500g土中混施17.5g的有机肥；在发芽后35天、60天时两次追肥。
②
蜡状芽孢杆菌菌剂：除常规施肥外，每500g土中加入2.5g菌剂，充分混匀，并进行两次追肥。
③
蜡状芽孢杆菌菌剂+菊糖：除常规施肥和蜡状芽胞杆菌菌剂外，每500g土中加入5g菊糖，充分混匀，并进行两次追肥。
38.大麦从8月12日开始播种，11月8日采收完毕。在生长期间，各处理除蜡状芽孢杆菌菌剂和菊糖施用不同外，其余施用肥料种类、施用量、浇水次数等都一致。
39.3、结果与分析3.1、微生物菌剂对农艺性状的影响由表1可知，微生物菌剂处理（处理2和处理3）对大麦的生长有不同程度的影响。与对照相比（处理1），施用微生物菌剂（处理2和处理3），大麦的株高、根长、总重及地上部鲜重等显著增加（p＜0.05），说明施用蜡状芽孢杆菌菌剂能够促进大麦的生长，提高大麦品质。加入菊糖后（处理3），菊糖为微生物提供了丰富的营养物质，增加了微生物的数量，加速了微生物的促生效果，大麦的株高、根长等呈现增加的趋势。
40.表1 微生物菌剂对大麦农艺性状的影响
处理株高（cm）根长（cm）茎粗（mm）总重（g）地上部鲜重（g）
处理116.97
±
0.07b12.33
±
0.06b0.87
±
0.01b4.42
±
0.06b2.03
±
0.03c处理225.50
±
0.05a18.67
±
0.04a1.17
±
0.03a6.21
±
0.01a2.97
±
0.03b处理327.33
±
0.09a23.03
±
0.04a1.18
±
0.07a6.54
±
0.02a3.68
±
0.08a
3.2、微生物菌剂对土壤理化性质的影响由表2可知，施用微生物菌剂处理（处理2和处理3），大麦土壤有机质、全n、全p、全k、碱解氮、有效磷、速效钾都呈现增加的趋势，明显高于对照组（处理1），土壤盐分和ph呈现下降趋势，说明微生物菌剂的处理促进了一些难溶性有机物质的溶解，提高了土壤有效养分的含量，改善了土壤性质，达到了修复土壤的目的。
41.表2 微生物菌剂对土壤理化性质的影响供试土壤处理1处理2处理3盐分(g/kg)2.20
±
0.04a0.37
±
0.01b0.35
±
0.01bph7.86
±
0.02a7.76
±
0.03a7.71
±
0.02a有机质(g/kg)4.50
±
0.08b6.90
±
0.05a7.21
±
0.05a全氮(g/kg)0.31
±
0.01b0.51
±
0.01a0.58
±
0.02a全磷(g/kg)0.61
±
0.01a0.72
±
0.03a0.78
±
0.03a全钾(g/kg)8.31
±
0.09b12.48
±
0.06a12.79
±
0.04a碱解氮(mg/kg)5.25
±
0.07b18.67
±
0.09a19.03
±
0.02a有效磷(mg/kg)12.52
±
0.06b27.68
±
0.07a29.10
±
0.09a速效钾(mg/kg)133.9
±
0.13a137.90
±
0.16a138.42
±
0.09a4、总结综上所述，处理1＜处理2＜处理3，在常规施肥的基础上施加蜡状芽孢杆菌菌剂能够促进大麦的生长，提高大麦的品质和产量，同时在微生物的作用下，土壤性质发生了改变，有效养分浓度增加，盐分和ph值降低，在土壤修复过程中具有重要的作用，可大规模推广使用。此外菊糖的添加，为土壤微生物的生长繁殖提供了丰富的营养物质，可以增加微生物数量，优化微生物的群落结构，从而提升了微生物菌剂的促生效果。
42.除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。