与鸭生长性状相关的InDel分子标记及其应用、引物对、试剂盒

与鸭生长性状相关的indel分子标记及其应用、引物对、试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种与鸭生长性状相关的indel分子标记及其应用、引物对、试剂盒，属于分子标记的技术领域。


背景技术：

2.我国是世界上水禽遗传资源非常丰富的国家之一，水禽遗传资源不仅数量众多，而且种质特性各异。基于地方品种的不同特点，培育出了部分专用型品种。但总体来说，水禽种业发展仍面临不少的问题，主要为缺乏由国际竞争力的标志性品种，肉鸭因生长速度慢、饲料转录率低等问题，其种源主要从国外引进。我国现今已经成为世界肉鸭生产和消费的第一大国，因此，培育具有我国自主知识产权的快大型肉鸭具有重要意义。生长性状一直是肉用畜禽遗传改良的关键经济性状之一。传统育种中通常根据个体测定、同胞测定或者后裔测定的表型性状留种，但传统育种方法无法进行早期选种，增大了世代间隔，降低了选择反应。因此，开发新的效应大的分子标记，借助分子标记辅助选择加快育种进程是肉鸭种质资源改良的可行方案。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种与鸭生长性状相关的indel分子标记，能够加快肉鸭的育种进程。
4.本发明还提供了上述鸭生长性状相关的indel分子标记的应用以及、用于检测上述鸭生长性状相关的indel分子标记的引物对以及用于检测上述与鸭生长性状相关的indel分子标记基因型的试剂盒。
5.为了实现以上目的，本发明的与鸭生长性状相关的indel分子标记所采用的技术方案是：
6.一种与鸭生长性状相关的indel分子标记，位于鸭第28号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如seq id no.1所示，或者插入或缺失片段的核苷酸序列为如seq id no.1所示核苷酸序列中任选的连续子序列。
7.本发明的与鸭生长性状相关的indel分子标记位于igf2bp1基因的promoter区，不受鸭的性别、生活习性和环境等因素的影响，通过鉴定该分子标记在鸭基因组中存在的类型，可以在早期通过分子筛选来判断鸭的屠体性状，对鸭个体进行早期选择留种，在降低饲养成本的同时，改良生长性状，加速肉鸭的选育进程。
8.所述igf2bp1基因全称胰岛素样生长因子2结合蛋白，具有调节细胞增殖、分化、形态发生及代谢的作用，其作用机制通常为调控靶基因mrna的定位、稳定性及翻译。
9.本发明的与鸭生长性状相关的indel分子标记的所在染色体编号信息基于gcf_015476345.1_zju1.0_genomic.fna版本的鸭基因组数据。需要说明是在gcf_015476345.1_zju1.0_genomic.fna版本的鸭基因组数据中，鸭基因组chr28:113032-113510位置的长度
为478bp的核苷酸序列为基因组拼接错误。该chr28:113032-113510位置存在如seq id no.1所示片段的插入或缺失。本发明的如seq id no.1所示片段的位置信息如图1所示。
10.可以理解的是，本发明中所述连续子序列的长度小于如seq id no.1所示片段。所述连续子序列的核苷酸序列不同于鸭第28号染色体中除如seq id no.1所示片段外的其他任意片段的核苷酸序列。进一步地，所述连续子序列的长度不小于30bp。
11.本发明的与鸭生长性状相关的indel分子标记的应用所采用的技术方案为：
12.一种上述的与鸭生长性状相关的indel分子标记在鉴定鸭屠体性状中的应用。
13.所述鸭屠体性状为宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛种、腿肌重、胸肌重、皮脂重、皮脂厚中的一种或任意组合。
14.所述生长性状包括体重，例如初生重、1周体重、2周体重、3周体重、4周体重、5周体重、6周体重、7周体重或8周体重。
15.一种上述的与鸭生长性状相关的indel分子标记在鸭育种中的应用。
16.本发明的与鸭生长性状相关的indel分子标记的应用，在降低肉鸭的饲养成本的同时，改良生长性状，加速肉鸭的选育进程。
17.优选的，上述与鸭生长性状相关的indel分子标记在鸭育种中的应用，判断如seq id no.1所示片段或如seq id no.1所示核苷酸序列中任选的连续子序列片段插入或缺失，选择如seq id no.1所示片段或如seq id no.1所示核苷酸序列中任选的连续子序列片段插入的纯合型鸭个体留种。进一步优选的，上述与鸭生长性状相关的indel分子标记在鸭育种中的应用，包括以下步骤：提取鸭的基因组dna，利用上述的indel分子标记的正、反向引物对提取的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr产物，检测pcr产物，根据检测结果判断如seq id no.1所示片段或如seq id no.1所示核苷酸序列中任选的连续子序列片段插入或缺失，选择如seq id no.1所示片段或如seq id no.1所示核苷酸序列中任选的连续子序列片段插入的纯合型鸭个体留种。
18.优选的，pcr扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸5min。
19.优选的，提取鸭的基因组dna的方法包括以下步骤：对待测鸭个体翅静脉采血，血液放入抗凝管，利用酚仿抽提法提取dna。
20.本发明的用于检测与鸭生长性状相关的indel分子标记的引物对所采用的技术方案为：
21.一种用于检测上述的与鸭生长性状相关的indel分子标记的引物对。
22.所述引物对包括正向引物和反向引物，优选的，正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
23.本发明的与鸭生长性状相关的indel分子标记的引物对，可以缩短育种周期，提高检测效率。
24.本发明的用于检测与鸭生长性状相关的indel分子标记基因型的试剂盒所采用的技术方案为：
25.用于检测与鸭生长性状相关的indel分子标记基因型的试剂盒包括上述的引物对。
26.在鸭基因组chr28存在长度为7105bp的如seq id no.1所示片段或如seq id no.1
所示核苷酸序列中任选的连续子序列片段插入的为插入型(i型)，野生型(w型)在该染色体不存在插入。采用本发明的试剂盒，可以更好地鉴定出indel分子标记基因型为ii型的如seq id no.1所示片段或如seq id no.1所示核苷酸序列中任选的连续子序列片段插入的纯合型鸭个体。
27.为了更好地鉴定鸭的indel分子标记基因型，优选的，用于检测上述的与鸭生长性状相关的indel分子标记基因型的试剂盒，还包括核苷酸序列如seq id no.4所示的反向引物。
28.优选的，所述试剂盒还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶中的一种或几种。
附图说明
29.图1为本发明的如seq id no.1所示片段在28号染色体上的位置信息示意图；
30.图2为具体实施方式中igf2bp1启动子区三种基因型电泳图；
31.图3为具体实施方式中鸭igf2bp1启动子区插入型的分布频率比较图；
32.图4为具体实施方式中得到的igf2bp1启动子区利用等位基因特异性pcr检测结果图；
33.图5为具体实施方式中pcr测序揭示等位基因分布频率示意图。
具体实施方式
34.以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
35.本发明的发明人利用全基因组重测数据，通过比较分析基因组深度和覆盖度的方法鉴定基因组调控区结构变异，发现igf2bp1基因的promoter区存在插入变异(插入型和野生型)(如图2所示)，发现插入型和野生型在地方鸭和商品鸭品种中存在显著的频率差异(如图3所示)。
36.具体地，对不同鸭品种igf2bp1基因promoter区进行检测，通过在插入位点两侧设计引物进行pcr测序以对该结构变异进行了基因分型，共发现2个等位基因，插入型(i型)：在chr28存在插入，插入长度为7105bp，野生型(w型)在该位置不存在插入(见图2)。图2中，ytg为插入型、wg为杂合子、wt为野生型。
37.发明人利用pcr技术鉴定两种等位基因，根据引物设计的物理位置和扩增组合，用487f和1347r引物组合鉴定i等位基因；用487f和1649r引物组合鉴定w等位基因；引物序列如表1。
38.表1igf2bp1启动子两种等位基因特异性引物
39.引物id引物序列(5'
‑‑
3')487fcatctggaatgctctaccaaggg1347rcaataacttaggctcaggcgagg1649rctgtgctctgtcctacagcgagt
40.采用以下pcr反应体系对各个体的基因组进行pcr扩增：
41.①2×
rapid taq pcr master mix 10μl,487f 0.5μl,1347r 0.5μl,待测鸭dna模板1μl,ddh2o 8μl；
42.②2×
rapid taq pcr master mix 10μl,487f 0.5μl,1649r 0.5μl,待测鸭dna模
板1μl,ddh2o 8μl。
43.pcr扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
44.琼脂糖凝胶电泳结果检测：取同一个样品两个pcr反应产物各5μl，进行1.5％(质量比)琼脂糖凝胶电泳。pcr检测结果见图4，图4中m为dm2000 marker，从下至上maker条带大小分别为：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp。由图4可以看出w等位基因条带大小为707bp，i等位基因条带大小为882bp。ww基因型显示一条带为707bp；iw基因型显示707bp和882bp两条带；ii基因型显示882bp一条带。
45.采用上述方法对不同鸭品种igf2bp1基因promoter区进行检测，发现野生型等位基因w主要存在于家鸭野生祖先绿头鸭及地方家鸭(荆江麻鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、山麻鸭和连城白鸭)，而i等位基因主要存在于肉用商业品种(樱桃谷鸭、奥白星鸭和北京鸭)，分布频率如图5。
46.实施例1
47.本实施例的与鸭生长性状相关的indel分子标记位于鸭第28号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。
48.实施例2
49.本实施例的检测实施例1中与鸭生长性状相关的indel分子标记的引物对，包括正向引物和反向引物，序列如下：
50.seq id no.2：487f：5
’‑
catctggaatgctctaccaaggg-3’，
51.seq id no.3：1347r：5
’‑
caataacttaggctcaggcgagg-3’。
52.实施例3
53.本实施例的检测实施例1的与鸭生长性状相关的indel分子标记基因型的试剂盒，包括核苷酸序列如seq id no.2(487f:5
’‑
catctggaatgctctaccaaggg-3’)所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.3(1347r:5
’‑
caataacttaggctcaggcgagg-3’)所示反向引物和核苷酸序列如seq id no.4(1649r:5
’‑
ctgtgctctgtcctacagcgagt-3’)所示的反向引物，还包括dntps、pcr反应缓冲液和dna聚合酶。
54.实施例4
55.本实施例的鸭生长性状相关的indel分子标记在鸭育种中的应用，包括以下步骤：
56.1)对某待测鸭f2代资源群的383个个体(其中公鸭210只，母鸭173只)进行翅静脉采血，血液放入抗凝管，利用酚仿抽提法提取dna，并稀释到60ng/μl；
57.2)利用表1中的引物487f(seq id no.2)、引物1347r(seq id no.3)和引物1649r(seq id no.4)采用以下pcr反应体系对提取的基因组dna进行pcr扩增，得到pcr产物；
58.pcr反应体系为：
59.①2×
rapid taq pcr master mix 10μl,487f 0.5μl,1347r 0.5μl,待测鸭dna模板1μl,ddh2o 8μl；
60.②2×
rapid taq pcr master mix 10μl,487f 0.5μl,1649r 0.5μl,待测鸭dna模板1μl,ddh2o 8μl。
61.pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，62℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
62.3)利用1.5％(质量比)琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，筛选出pcr产物中仅含有一条882bp的条带的鸭个体(即ii基因型个体)留种。
63.采用实施例3的方法最终确定对待测鸭f2代资源群的80个个体(其中公鸭41只，母鸭39只)留种。
64.步骤3)中对ii基因型个体筛选留种的同时，对其他个体的分子标记基因型(iw基因型、ww基因型)进行鉴定。为了对效果验证，对上述实施例3中某待测鸭f2代资源群的383个个体公母混养，并于出生后记录各个体的初生重、1周体重、2周体重、3周体重、4周体重、5周体重、6周体重、7周体重、8周体重，并在8周屠宰后记录各个体的屠前活体重、屠体重、全净膛重、半净膛重、胸肌重、腿肌重、皮脂重、皮脂厚等屠体性能指标，然后基于单点变异一般线性模型、将indel基因型作为固定效应，进行关联分析。当基因型与性状显著关联时，分析结果中p值小于0.05，结果见表2。
65.表2性能指标统计表
[0066][0067][0068]
注：表中p是基因型与对应性状相关关系的显著性水平，p《0.05表示基因型与对应性状显著显著，p《0.01表示基因型与对应性状极显著相关。
[0069]
由表2中数据可知，等位基因i与鸭高生长性状(8周体重、宰前活重、屠体重、半净
膛重、全净膛种、腿肌重、胸肌重、皮脂重、皮脂厚、7周体重、6周体重、5周体重、4周体重、3周体重、2周体重、1周体重和初生重等17个性状)呈显著正相关，等位基因w与鸭低生长性状呈显著正相关。