可视化检测基因表达的试剂盒及其应用

本发明涉及微生物分子遗传学研究，具体来说，涉及一种可视化检测基因表达情况的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、基因表达报告系统是分子遗传学研究中常用的有效策略，在微生物、植物和动物的遗传和代谢研究中发挥着重要作用。一个好的报告系统应该具有特异性强、灵敏度高以及适用范围广等特点，对复杂基因的表达可进行快速、可视化表征。然而，现有基因表达报告系统存在着多种问题，限制了它们在更多场景、更广范围内的应用。以天然抗生素重要来源的链霉菌为例，近年来，适用于链霉菌的报告系统陆续被开发出来，并被广泛应用(kieser t,bibb mj,buttner mj,et al.,practical streptomyces genetics[m].johninnes foundation norwich,2000.)，比如用抗生素抗性基因作为报告基因的报告系统(ward jm,janssen gr,kieser t,et al.construction and characterisation of aseries of multi-copy promoter-probe plasmid vectors for streptomyces usingthe aminoglycoside phosphotransferase gene from tn5 as indicator[j].molecularand general genetics,1986,203:468-478.)、用绿色荧光蛋白(gfp)编码基因作为报告基因的报告系统(bai c,zhang y,zhao x,et al.exploiting a precise design ofuniversal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbialnatural products in streptomyces[j].proceedings of the national academy ofsciences of the united states of america,2015,112:12181-12186.)、用儿茶酚双加氧酶编码基因xyle作为报告基因的报告系统(ingram c,brawner m,youngman p,etal.xyle functions as an efficient reporter gene in streptomyces spp.:use forthe study of galp1,a catabolite-controlled promoter[j].journal ofbacteriology,1989,171:6617-6624.)以及用靛蓝素(indigoidine)的生物合成基因作为报告基因的报告系统(li p,li j,guo z,et al.an efficient blue-white screeningbased gene inactivation system for streptomyces[j].applied microbiology andbiotechnology,2015,99:1923-1933.)等。然而，由于链霉菌具有复杂的发育分化周期、丰富多样的表型和形态，在固体培养基上会产生基质菌丝、气生菌丝和含色素的孢子等(flardh k,buttner mj.streptomyces morphogenetics:dissecting differentiationin a filamentous bacterium[j].nature reviews microbiology,2009,7:36-49.)，特别是链霉菌自身通常可以产生丰富多样的次级代谢产物(selim msm,abdelhamid sa,mohamed ss.secondary metabolites and biodiversity of actinomycetes[j].journalof genetic engineering and biotechnology,2021,19:72.)，具有很强的背景干扰，使报告系统的检测灵敏度和准确性下降，导致很多报告系统在链霉菌中难以发挥很好的效果，因此，进一步开发背景干净、灵敏度高、特异性强，且更适用于链霉菌及其他微生物或高等动植物的新型报告系统是非常必要的。

技术实现思路

1、ahl信号分子及其受体构成典型的革兰氏阴性菌群感效应信号系统，ahl作为该受体的配体化合物，大多数都能在极低浓度(通常在纳摩尔浓度级别)与其受体蛋白相结合，激活靶基因的表达，进而调控各种不同的生理过程，比如生物发光、生物膜的形成、抗生素的产生和毒力因子的表达等，是一种灵敏度很高的信号系统。不同微生物使用不同的合酶合成ahl类化合物，其酰基侧链长度和还原状态的差异导致受体对其结合能力的差异。

2、基于上述革兰氏阴性菌ahl及其受体的调控机制，本发明人构建了一种适用于链霉菌的基因表达报告系统，具体包括将ahl合酶基因如紫色色杆菌cv31532中的cvii作为报告基因(seq id no.1)，将目的基因的启动子与cvii连接，构建在适合的质粒上，并将构建的质粒导入链霉菌，获得目的基因的报告菌株；通过ahl检测菌株的表型或代谢变化，比如紫色色杆菌cv026中深紫色的色素-紫色杆菌素的产生情况检测报告菌株中的ahl，即cvii的表达情况，进而表征目的基因启动子的活性以及该基因的表达情况，为一种新型的链霉菌可视化报告系统—vrs-bahl(visualization reporter system based on ahl)(原理见图1)。本系统不需要外源添加特殊底物。本系统是利用ahl合酶基因cvii作为报告基因，如果cvii被驱动表达，其编码的蛋白cvii催化合成以c6-hsl为主的ahl，进而激活检测菌cv026合成紫色杆菌素。而且cvii催化合成ahl所需的底物s-腺苷甲硫氨酸和酰基载体蛋白在大多数微生物包括链霉菌中均普遍存在。本发明还证明了vrs-bahl在链霉菌中应用的可行性，以及在基因表达调控关系研究和隐性基因簇激活筛选中的应用。具体来说，本发明所述报告系统的构建、验证及应用涉及如下技术步骤：

3、1)vrs-bahl在链霉菌中的可行性测定：将卡那霉素抗性基因kanr插入到pij10500(pullan st,chandra g,bibb mj,et al.genome-wide analysis of the role of glnrin streptomyces venezuelae provides new insights into global nitrogenregulation in actinomycetes[j].bmc genomics,2011,12:175.)，获得具有卡那霉素抗性基因标记的整合型质粒pij10500k。所述卡那霉素抗性基因kanr的序列如seq id no.2所示。用强启动子phrdb驱动ahl合酶基因cvii，将其连到质粒pij10500k上，构建得质粒pphrdb-cvii，用于cvii的组成型表达。所述强启动子phrdb的序列如seq id no.3所示。将质粒pij10500k和pphrdb-cvii分别导入圈卷产色链霉菌(streptomyces ansochromogenes)7100(wang w,zhang j,liu x,et al.identification of a butenolide signaling systemthat regulates nikkomycin biosynthesis in streptomyces[j].journal ofbiological chemistry,2018,293:20029-20040.)、龙胜链霉菌(s.longshengensis)cgmcc4.1101(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)、维吉尼亚链霉菌(s.virginiae)cgmcc 4.1530(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)、委内瑞拉链霉菌(s.venezuelae)atcc 10712(stuttard c.temperate phages ofstreptomyces venezuelae:lysogeny and host specificity shown by phage sv1 andsv2[j].journal of general microbiology,1982,128:115-121.)、天蓝色链霉菌(s.coelicolor)a3(2)(kieser t,bibb mj,buttner mj,et al.,practical streptomycesgenetics[m].john innes foundation norwich,2000.)、变铅青链霉菌(s.lividans)tk23(kieser t,bibb mj,buttner mj,et al.,practical streptomyces genetics[m].johninnes foundation norwich,2000.)和灰色链霉菌(s.griseus)ifo 13350(kato jy,miyahisa i,mashiko m,et al.a single target is sufficient to account for thebiological effects of the a-factor receptor protein of streptomyces griseus[j].journal of bacteriology,2004,186:2206-2211.)，使其整合到这些菌株的基因组上，导入pij10500k的菌株作为阴性对照菌株nc，导入pphrdb-cvii的菌株为报告基因即ahl合酶基因cvii组成型表达的阳性对照菌株hcvii；用四种不同的培养基(ms，mym，tsb和yeme)分别培养上述链霉菌衍生菌株3天后，通过双层平板法，用ahl指示菌cv026对各菌株的ahl产生情况进行检测，即检测其诱导cv026合成紫色杆菌素的情况。结果表明，七种链霉菌的阳性对照菌株与其对应的阴性对照菌株相比，均能显著激活cv026中紫色杆菌素的产生，即报告基因cvii能在链霉菌中高效表达，且产物ahl能被指示菌cv026灵敏地检测(nm浓度的ahl就能激活紫色杆菌素的大量产生，本发明中具体表现为图2中紫色杆菌素圈的产生，对于定性实验或者大多数对比实验，可直接肉眼观察紫色杆菌素圈的大小，是简单直接的常用判断方法；必要时可拍照后再通过imagej等图片处理测量软件测量紫色杆菌素圈的直径或者面积来精确定量)，而阴性对照菌株完全没有激活作用(图2)，说明上述基因表达报告系统vrs-bahl在链霉菌中应用时具有良好的可行性，且背景干净。背景干净指链霉菌菌株自身或者培养基中没有ahl或其显著的功能类似物产生，不会干扰cv026对报告基因cvii表达情况的检测。此外，本发明可用报告基因还可以是紫色色杆菌cv12472中的cvii-12472、铜绿假单胞菌中的lasi、铜绿假单胞菌中的rhli、费氏弧菌中的luxi或豌豆根瘤菌中的rhii等ahl合酶基因，这些基因合成的产物是侧链长度或还原状态等不同的ahl类信号分子；本发明可用的ahl检测菌还可以是紫色色杆菌δcvii-12472(基于紫色色杆菌cv12472的ahl信号系统构建)、大肠杆菌报告菌株ej532-4(基于紫色色杆菌cv31532的ahl信号系统在大肠杆菌中构建)或根癌农杆菌nt1(基于根癌农杆菌的ahl信号系统构建)等，这些ahl检测菌在各自识别的ahl存在时可以表现出不同的代谢或表型变化。

4、2)vrs-bahl在链霉菌基因表达调控关系研究中的应用：xu等人利用β-葡萄糖醛酸酶编码基因gusa作为报告基因，通过天蓝色链霉菌m1146异源宿主报告系统的方式证明，圈卷产色链霉菌7100中的蛋白ovmz和ovmw可以协同激活基因ovmoi的启动子(xu j,zhang j,zhuo j,et al.activation and mechanism of a cryptic oviedomycin gene clustervia the disruption of a global regulatory gene,adpa,in streptomycesansochromogenes[j].journal of biological chemistry,2017,292:19708-19720.)。本研究用cvii代替gusa作为报告基因，连接启动子povmoi(序列如seq id no.4所示)，通过质粒pij10500k导入天蓝色链霉菌m1146中，获得报告菌株m1146ovm-cvii，并通过pkc1139质粒在该菌株中同时高表达ovmz和ovmw；在双层平板法检测中，与m1146ovm-cvii和其中导入质粒pkc1139的阴性对照菌株m1146ovm-cvii-nc相比，只有ovmz和ovmw同时高表达的菌株m1146ovm-cvii-hzw能诱导cv026产生显著的紫色杆菌素(图3)，与上述gusa报告系统的研究结果一致。进一步，我们在圈卷产色链霉菌7100中也进行了类似的报告系统检测，其结果与天蓝色链霉菌m1146中的一致，即ovmz和ovmw同时高表达能激活ovmoi的启动子(图3)。该结果充分说明vrs-bahl可应用于链霉菌的基因表达调控关系研究。

5、3)vrs-bahl在链霉菌隐性基因簇激活筛选中的应用：lu等人通过对圈卷产色链霉菌7100中全局性调控基因wlba的破坏激活了新型泰乐菌素类似物compound 1，2和3的产生(lu c,liao g,zhang j,et al.identification of novel tylosin analoguesgenerated by a wbla disruption mutant of streptomyces ansochromogenes[j].microbial cell factories,2015,14:173.)，后续研究鉴定了其对应基因簇(li y,yu h,guan h,et al.activation of cryptic antibiotic biosynthetic gene clustersguided by rna-seq data from both streptomyces ansochromogenes andδwbla[j].antibiotics(basel),2021,10.)，该簇与安哥拉霉素(angolamycin)生物合成基因簇(schell u,haydock sf,kaja al,et al.engineered biosynthesis of hybridmacrolide polyketides containing d-angolosamine and d-mycaminose moieties[j].organic&biomolecular chemistry,2008,6:3315-3327)同源性较高，此处我们将该簇命名为ang，本研究利用vrs-bahl对其表达进行表征。选择ang基因簇内关键结构基因ctg1_1275(此处我们将其命名为ang1)启动子pang1(序列如seq id no.5所示)驱动cvii，通过质粒pij10500k导入到圈卷产色链霉菌7100中，得到报告菌株7100ang-cvii，在不同培养基(ms，mym，tsb和yeme)上进行培养后，采用双层平板法对报告基因的表达进行检测。结果表明，7100ang-cvii在tsb培养基上培养时能够激活cv026中紫色杆菌素的生物合成(图4)。随后，通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography，hplc)对圈卷产色链霉菌7100野生型在上述四种培养基上的产物进行了分析，并与泰乐菌素类似物compound 2标准品进行比较，发现只有在tsb培养基上，圈卷产色链霉菌7100野生型才能产生compound2，即所选的4种培养基中只有在tsb培养基上基因簇ang才能表达，其他三种不行，说明这种更换培养基的方式可以激活ang基因簇的表达(图4)。因此vrs-bahl可方便快捷地检测特定基因簇的表达，可望用于链霉菌隐性次级代谢产物生物合成基因簇激活的筛选。

6、4)vrs-bahl可采用的不同检测方法研究：考虑到链霉菌研究通常采用多种培养条件或方式，在使用vrs-bahl时，需要用不同的方式对cvii的表达情况进行检测或表征，因此，除了双层平板法，我们还进行了琼脂块法、牛津杯法、共培养法和大肠杆菌报告菌株快速检测法测定该系统的可用性，前三种方法都是基于c6-hsl能诱导cv026产生紫色杆菌素，第四种方法则是基于c6-hsl能快速诱导其大肠杆菌报告菌株ej532-4产生生物发光(liux,wang w,li j,et al.a widespread response of gram-negative bacterial acyl-homoserine lactone receptors to gram-positive streptomyces gamma-butyrolactone signaling molecules[j].science china life sciences,2021,64:1575-1589.)。我们发现vrs-bahl在四种检测方法中均可应用(图5)，进一步说明，vrs-bahl在链霉菌中具有广泛的普适性。

7、本发明提供以下技术方案：

8、一方面，本发明提供基因表达报告系统，其特征在于，所述系统包括报告基因，所述报告基因选自ahl合酶基因，所述ahl合酶基因选自紫色色杆菌cv31532中的cvii、紫色色杆菌cv12472中的cvii-12472、铜绿假单胞菌中的lasi、铜绿假单胞菌中的rhli、费氏弧菌中的luxi或豌豆根瘤菌中的rhii。

9、在一些实施方案中，所述系统还包括ahl检测菌，所述ahl检测菌选自紫色色杆菌cv026、紫色色杆菌δcvii-12472、大肠杆菌报告菌株ej532-4和根癌农杆菌nt1。

10、在一些实施方案中，所述系统还包括抗性基因，所述抗性基因选自卡那霉素抗性基因kanr、潮霉素抗性基因hygr和安普霉素抗性基因aprr。

11、在一些实施方案中，所述系统还包括启动子。

12、在一些实施方案中，所述启动子选自组成型启动子例如phrdb,perme*和pkaso*，以及目的基因启动子例如povmoi或pang1。

13、在一些实施方案中，所述系统包括基因载体，所述基因载体选自pij10500整合型质粒、pij10500k整合型质粒、pset152整合型质粒和pkc1139游离型质粒。

14、在一些实施方案中，所述系统适用于不产生ahl的细菌、真菌和高等动植物。

15、在一些实施方案中，所述系统适用于链霉菌。

16、在一些实施方案中，所述链霉菌选自圈卷产色链霉菌7100、龙胜链霉菌cgmcc4.1101、维吉尼亚链霉菌cgmcc 4.1530、委内瑞拉链霉菌atcc 10712、天蓝色链霉菌a3(2)、变铅青链霉菌tk23和灰色链霉菌ifo 13350。

17、在一些实施方案中，所述链霉菌的培养基选自ms、mym、tsb和yeme。

18、在一些实施方案中，所述系统的检测方法选自双层平板法、琼脂块法、牛津杯法、共培养法和大肠杆菌报告菌株快速检测法。

19、另一方面，本发明提供上述基因表达报告系统在基因表达调控关系研究和隐性基因簇激活筛选中的应用。

20、另一方面，本发明提供上述基因表达报告系统在筛选目的基因簇高表达的菌株中的应用。

21、另一方面，本发明提供上述基因表达报告系统的使用方法，其特征在于，包括：

22、(1)将ahl合酶基因cvii作为报告基因，将目的基因的启动子与cvii连接，构建在质粒上；

23、(2)将构建的质粒导入链霉菌，获得目的基因的报告菌株；

24、(3)通过ahl检测菌株cv026中深紫色的色素-紫色杆菌素的产生情况检测报告菌株中的ahl，即cvii的表达情况，进而表征目的基因启动子的活性以及目的基因的表达情况。

25、另一方面，本发明提供用于检测基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括载体，所述载体上连接有报告基因，所述报告基因选自ahl合酶基因，所述ahl合酶基因选自紫色色杆菌cv31532中的cvii、紫色色杆菌cv12472中的cvii-12472、铜绿假单胞菌中的lasi、铜绿假单胞菌中的rhli、费氏弧菌中的luxi或豌豆根瘤菌中的rhii。

26、在一些实施方案中，所述试剂盒还包括ahl检测菌，所述ahl检测菌选自紫色色杆菌cv026、紫色色杆菌δcvii-12472、大肠杆菌报告菌株ej532-4和根癌农杆菌nt1。

27、在一些实施方案中，所述载体上还包括抗性基因，所述抗性基因选自卡那霉素抗性基因kanr、潮霉素抗性基因hygr和安普霉素抗性基因aprr。

28、在一些实施方案中，所述载体上还包括启动子，优选地，所述启动子选自组成型启动子例如phrdb,perme*和pkaso*，以及目的基因启动子例如povmoi或pang1。

29、在一些实施方案中，所述载体选自pij10500整合型质粒、pij10500k整合型质粒、pset152整合型质粒和pkc1139游离型质粒。

30、在一些实施方案中，所述试剂盒适用于不产生ahl的细菌、真菌和动物、植物，优选地，所述试剂盒适用于链霉菌。

31、在一些实施方案中，所述链霉菌选自圈卷产色链霉菌7100、龙胜链霉菌cgmcc4.1101、维吉尼亚链霉菌cgmcc 4.1530、委内瑞拉链霉菌atcc 10712、天蓝色链霉菌a3(2)、变铅青链霉菌tk23和灰色链霉菌ifo 13350，任选地，所述链霉菌的培养基选自ms、mym、tsb和yeme。

32、在一些实施方案中，所述试剂盒采用的检测方法选自双层平板法、琼脂块法、牛津杯法、共培养法和大肠杆菌报告菌株快速检测法。

33、另一方面，本发明提供上述用于检测基因表达的试剂盒在基因表达调控关系研究和隐性基因簇激活筛选中的应用或在筛选目的基因簇高表达菌株中的应用。

34、定义

35、cvii基因：紫色色杆菌cv31532中的ahl合酶基因，负责合成短链的c6-hsl，用来介导自身的群感效应。ahl和hsl可表示同样的意思，即高丝氨酸内酯，本文中泛指时用“ahl”表示，具体指某种ahl时用“hsl”，比如表示cv31532中侧链包含六个碳的ahl时，可用“c6-hsl”，也可以称为“c6-ahl”。

36、cv026：通过对紫色色杆菌cv31532进行转座突变获得的突变株，cv026中的cvii基因和紫色杆菌素生物合成的阻遏基因被破坏，导致ahl无法合成，但是当外源c6-hsl或结构相近的其他ahl存在时，便能激活其紫色杆菌素的产生，因此cv026被广泛应用于c6-hsl或其结构相近的其他ahl的检测。

37、c6-hsl：短链(酰基侧链含有6个碳)的高丝氨酸内酯，是紫色色杆菌cv31532和其他一些革兰氏阴性菌主要的群感效应信号分子。

38、链霉菌的隐性基因簇：链霉菌中很多基因簇中的多数基因(数十个基因不等)在常规实验室条件下不转录或转录程度很低，检测不到对应产物，这些基因簇被称为隐性基因簇。

39、有益效果

40、目前常用的链霉菌基因表达报告系统的表征主要包括检测产生的发光物质、色素和抗生素抗性等，但是由于链霉菌具有复杂的发育分化周期、丰富多样的表型和形态，在固体培养基上会产生基质菌丝、气生菌丝和含色素的孢子等，这对于观测胞内荧光物质产生或者色素分泌造成很大不便，且荧光物质的检测需要特定仪器；特别是链霉菌自身可以产生多种多样的次级代谢产物，对报告基因对应表型的检测形成干扰，导致准确性或者灵敏度低。本发明涉及的vrs-bahl与传统报告系统相比，具有如下有益效果：①本发明使用的报告基因cvii的dna长度较小，仅约600bp,比常用的可直接产生荧光或者色素化合物的报告基因如gfp(约700bp)、xyle(约1000bp)、gusa(约1800bp)和bpsa(约4600bp)等都小，其中gfp常常用2-3个拷贝串联作为报告基因来提高灵敏度，因此，cvii作为报告基因时，其克隆和遗传操作简便；②cvii负责合成产物ahl所需的底物s-腺苷甲硫氨酸和酰基载体蛋白在各种微生物包括链霉菌中均可合成，无需外源添加，增加了其适用性；③vrs-bahl系统中可使用多种方式(如琼脂块法和牛津杯法等)对报告菌株中的ahl产生情况进行检测，具有很大灵活性；④尤其是链霉菌中不存在ahl合酶基因，或其他能合成ahl的酶，也不产生具有显著ahl功能的其他化合物，简单来说就是常规条件下链霉菌均不能激活本发明所用指示菌cv026合成紫色杆菌素，这降低了背景干扰；⑤此外，ahl在纳摩尔浓度级别即可诱导cv026中紫色杆菌素的产生，大大提高了该系统的灵敏度。因此，本发明具有可视化程度高、背景干净、灵敏度高、准确性好以及适用范围广等优点，同时操作简便、无需底物添加和特殊的仪器设备。

41、本发明报告系统所适用宿主细胞不仅局限于上述链霉菌，而且也适用于其他自身不能导致所述ahl检测菌株产生紫色杆菌素的微生物或高等动植物；本发明报告系统的构建不仅局限于上述报告基因cvii及ahl指示菌cv026的组合，而且也适用于其他ahl合酶基因及ahl指示菌。本发明报告系统的构建和检测不局限于使用上述分子遗传学工具和检测手段，而是可以使用其他能实现相同功能的构建方法和检测技术；此外，本发明报告系统的应用不局限于上述基因表达调控关系研究和隐性基因簇激活的筛选，而可用于任何需要检测启动子活性的研究中。