一种检测胎儿FGA基因突变的试剂和试剂盒的制作方法

一种检测胎儿fga基因突变的试剂和试剂盒
技术领域
1.本发明涉及胎儿fga基因突变检测领域，特别是涉及一种检测胎儿fga基因突变的试剂和试剂盒。


背景技术：

2.研究显示，先天性无纤维蛋白原血症和fga基因上的突变相关，fga基因在孕妇中几乎不表达，仅仅在胎儿中表达。因此，对胎儿fga基因进行检测，是早期诊断和预测先天性无纤维蛋白原血症的重要方法和途径。
3.目前针对胎儿的基因检测技术，主要是例如基于全基因组测序的唐氏儿筛查。但是，该技术主要是针对染色体异常进行检测，对于单基因突变，如fga基因突变，无法检测。并且，利用全基因组测序仅仅对某个单基因突变进行检测，也存在检测成本高的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种新的检测胎儿fga基因突变的试剂和试剂盒。
5.本发明具体采用了以下技术方案：
6.本发明公开了一种检测胎儿fga基因突变的试剂，其包括六组fga基因特异性引物，六组引物的引物序列依序为seq id no.1和seq id no.12所示序列，其中seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6以此类推，两两组合为一组pcr扩增引物，用于对胎儿fga基因进行扩增。
7.研究显示，孕妇血液中含有胎儿的游离核酸；但是，由于孕妇血液中的胎儿游离核酸含量很低，目前尚未有能够准确有效的检测这些核酸的技术手段。即便有研究报道声称可以从孕妇血液中检测胎儿游离核酸，其检测灵敏度和特异性都较差，难以满足临床使用需求。因此，本发明创造性的研发了一种灵敏度高、特异性好的，专用于胎儿fga基因检测的试剂，即六组fga基因特异性引物。通过本发明的六组fga基因特异性引物，能够对胎儿fga基因上常见的17个snp位点进行检测，很好的满足临床使用需要。
8.优选的，本发明的试剂还包括看家基因特异性引物。
9.优选的，所述看家基因特异性引物的上游引物为seq id no.13所示序列，下游引物为seq id no.14所示序列。
10.优选的，本发明的试剂还包括通用引物，所述通用引物由第一引物和第二引物组成，所述第一引物为seq id no.15所示序列，所述第二引物为seq id no.16所示序列。
11.优选地，所述第一引物的5’端具有磷酸化修饰。
12.本发明还公开了一种检测胎儿fga基因突变的试剂盒，其包括本发明的试剂。
13.优选地，所述试剂盒中还包括孕妇血液游离rna提取试剂。
14.优选地，所述试剂盒中还包括逆转录试剂。
15.优选地，所述试剂盒中还包括pcr扩增试剂。
16.优选地，所述试剂盒中还包括核酸纯化试剂。
17.以上试剂的加入主要是为了使用方便，如果不加入试剂盒中，也可以单独另行购买。
18.本发明的有益效果在于：
19.本发明的试剂，能够直接对孕妇血浆中胎儿的游离核酸进行检测，并获得胎儿fga基因的突变信息，解决了孕妇血浆中大量的母体基因组背景导致胎儿基因无法进行突变检测的问题，为胎儿fga基因突变检测提供了一种新的方案和途径。
具体实施方式
20.下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。
21.实施例
22.本试验针对fga基因，覆盖常见的fga突变位点，设计了六组fga基因特异性引物。与此同时，针对看家基因β-actin设计特异性引物。所有引物序列见表1，所有引物由上海生工合成。
23.表1引物序列
[0024][0025][0026]
表1中f表示上游引物，r表示下游引物。表1的序列是最终筛选获得的，能够满足多重pcr扩增使用需求的引物；特别是看家基因的选择和引物，也是考虑到配合六组fga基因特异性引物进行多层pcr扩增而特别设计。
[0027]
本试验的六组fga基因特异性引物覆盖17种fga基因snp突变，具体包括：rs78506343、rs121909613、rs121909612、rs587777761、rs121909611、rs121909610、
rs121909615、rs6050、rs606231225、rs146387238、rs121909614、rs121909608、rsl21909609、rs121909607、rs121909606、rs121909605和rs121909604。
[0028]
实验样本：本试验采用了两个孕妇血浆样本，一个是正常胎儿的孕妇样本，一个是胎儿为先天性无纤维蛋白原血症的孕妇样本，每个孕妇样本的血液5ml。
[0029]
1.孕妇血浆游离核酸提取
[0030]
本试验采用qigen公司的孕妇血浆游离核酸提取试剂盒，按照标准操作流程进行提取，最终得到的游离dna溶解到20μl的水中。
[0031]
2.特异性pcr扩增
[0032]
pcr反应体系：2
×
kapa混合液25μl、10μm混合引物5μl、游离dna 5μl，补充灭菌ddh2o至50μl。每个样本重复3次试验。
[0033]
混合引物中包括六组fga基因特异性引物和看家基因特异性引物，所有上游引物和下游引物的浓度均为10μm。
[0034]
pcr反应条件：95℃2min，在95℃5s、58℃1min、72℃20s进行15个循环，然后72℃10min，4℃保存。
[0035]
pcr扩增产物采用等体积的agencourt ampure xp磁珠纯化，并用25μl灭菌ddh2o复溶纯化的dna。
[0036]
3.测序文库构建
[0037]
采用通用引物对步骤“2.特异性pcr扩增”的扩增产物进行扩增。
[0038]
通用引物由第一引物和第二引物组成，第一引物为seq id no.15所示序列，第二引物为seq id no.16所示序列，第一引物的5’端具有磷酸化修饰。
[0039]
seq id no.15：5
’‑
acacacgacgctcttccgat-3’[0040]
seq id no.16：
[0041]5’‑
agccaaggagttgctgcgtacatttgtcttcctagacgtgtgctcttccgatc-3’。
[0042]
反应体系：2
×
kapa混合液25μl、10μm第一引物2μl、10μm第二引物2μl，“2.特异性pcr扩增”的pcr扩增纯化产物10μl，补充灭菌ddh2o至50μl。
[0043]
反应条件：95℃2min，在95℃5s、58℃1min、72℃20s进行15个循环，然后72℃10min，4℃保存。
[0044]
反应产物采用等体积的agencourt ampure xp磁珠纯化，并用25μl灭菌ddh2o复溶纯化的dna。
[0045]
4.测序
[0046]
采用bgiseq-500对“3.测序文库构建”的产物进行测序，测序类型双端50bp。
[0047]
5.数据分析
[0048]
测序下机数据采用常规的过滤方案进行过滤后，比对到基因组中；统计比对率、目标区域的比例、目标区域的深度，统计目标位点的碱基分布。统计结果见表2。
[0049]
表2测序数据统计结果
[0050][0051]
表2中，原始reads数是指下机数据常规过滤后的reads数量，去接头后剩余reads数是指去除接头后的reads数量，比对上的reads数是指比对到基因组上的reads数量，fga基因reads数是指目标区域fga基因的reads数量。表2的结果显示，采用本试验的引物对胎儿fga基因进行扩增和测序，数据利用率可以达到97％以上，比对率和目标区域比例可以达到98％以上。
[0052]
对六个测序样本中各个特异性引物对以及管家基因扩增引物的覆盖率进行统计，结果显示，所有引物对测序后得到的深度分布均匀，不同引物对的深度差异较小，在5倍以内。
[0053]
对正常胎儿孕妇血浆样本的3个重复测序样本和患儿孕妇血浆样本的3个重复测序样本的重复性进行统计，结果显示，同一样本不同实验得到的各引物的深度稳定性很好，正常胎儿孕妇血浆样本的3个重复的r2＝0.98，患儿孕妇血浆样本的3个重复的r2＝0.99，说明两个样本的重复性都很好。
[0054]
对六个测序样本进行突变分析，结果显示，正常胎儿的孕妇血浆样本的3个重复测序样本，都没有检测出突变；患儿孕妇样本3个重复都有检测到c.1039c＞t突变；以上结果与预期相符。说明本试验能够检测胎儿fga基因突变。
[0055]
6.灵敏度检测
[0056]
采用获取自患儿孕妇血浆样本的游离dna进行灵敏度检测，对dna进行浓度测序和稀释，获得浓度分别为10ng/μl、5ng/μl、2.5ng/μl、1ng/μl的游离dna样本。按照前述方法进行“2.特异性pcr扩增”、“3.测序文库构建”、“4.测序”和“5.数据分析”，分析不同浓度下的胎儿fga基因突变检测情况。
[0057]
结果显示，五个浓度的样本都能够准确的检测获得fga基因的突变信息，即都能够检测到c.1039c＞t突变。说明本试验的引物能够对较低浓度的游离dna，即1ng/μl的游离dna进行胎儿fga基因突变检测。
[0058]
7.实际样本检测
[0059]
本试验分别获取了30个患儿孕妇的血浆样本，按照前述方法进行核酸提取和“2.特异性pcr扩增”、“3.测序文库构建”、“4.测序”和“5.数据分析”；对本试验覆盖的17个snp位点进行检测，结果见表3。
[0060]
表3实际样本检测结果
[0061][0062][0063]
表3的结果显示，本试验的引物的确能够对胎儿fga基因的rs78506343、rs121909613、rs121909612、rs587777761、rs121909611、rs121909610、rs121909615、rs6050、rs606231225、rs146387238、rs121909614、rs121909608、rs121909609、rsl21909607、rs121909606、rs121909605和rs121909604等17种snp进行检测。
[0064]
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。