一种稳定同位素标记啶酰菌胺内标试剂的制备方法与流程

1.本发明涉及一种食品安全检测用稳定同位素标记啶酰菌胺内标试剂的制备方法，属于食品安全检测用标准物质研发领域。


背景技术：

2.啶酰菌胺(boscalid，cas no.：188425-85-6)属于新型烟酰胺类杀菌剂，作用于病菌线粒体呼吸链复合体ii，抑制琥珀酸脱氢酶的活性，阻断病菌能量合成，强烈抑制孢子萌发与菌丝生长，与其他线粒体电子传递链抑制剂无交互抗性。同时具有一定的广谱性，可高效防治果蔬和其他作物上由子囊菌和半知菌引起的多种病害，如灰霉病、白粉病、菌核病、早疫病、叶斑病、褐腐病等，主要用于包括蔬菜、果树和大田作物等病害的防治。由于其特有的作用机理不易产生交互抗性，加之对作物安全、与环境相容性良好，是应用前景很好的两种新型酰胺类杀菌剂，基于安全考虑，cac、欧盟和日本等国家规定啶酰菌胺在各类食品中最高残留限量在nd～40mg/kg之间，我国也在《gb 2763-2021食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了啶酰菌胺在各类食品中最高残留限量。同时，我国相关的检测该物质的标准有《gb 23200.121-2021食品安全国家标准植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱联用法》、《gb 23200.50-2016食品安全国家标准食品中吡啶类农药残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》、《sn/t 4886-2017出口干果中多种农药残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》等。因国内无相对应的稳定同位素标记内标化合物供应，国外产品进口价格昂贵、供货周期长且供应不稳定，目前只能用外标法来进行检测。因为稳定同位素稀释质谱法是国际上公认的痕量检测的“金标准”，所以，最好是使用该化合物对应的稳定同位素标记的化合物作为内标使用内标法来进行检测定量。目前尚未发现有稳定同位素标记啶酰菌胺制备文献报导，因此，研制稳定同位素标记啶酰菌胺内标试剂对于我国品安全监管检测工作相关领域打破国外垄断、填补国内空白；做到核心产品自主研发、自主可控具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种适用于食品安全检测用稳定同位素标记啶酰菌胺内标试剂的制备方法。该制备方法所需原料及中间体简单易得，反应条件温和，硝基还原避免使用催化加氢，降低实验室合成难度及危险性，对氯苯基重氮氟硼酸盐直接偶联，缩短反应步骤，提高产品总收率，目标产物稳定同位素标记啶酰菌胺化学纯度可达99％以上，同位素丰度可达99％以上，并且最终产品收率高，同位素丰度不稀释，有效降低了产品成本。
4.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
5.一种食品安全检测用稳定同位素标记啶酰菌胺的制备方法，该稳定同位素标记的啶酰菌胺的化学结构如式(labeled boscalid)所示：
[0006][0007]
其中，r为h或d，*为
12
c或
13
c，其合成步骤总路线为：
[0008][0009]
其中，r为h或d，*为
12
c或
13
c；
[0010]
(1)在有机溶剂存在条件下，加入稳定同位素标记4-氯硝基苯，然后加入对还原剂和添加剂，在-5℃～50℃条件下，反应0.5～6小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记4-氯苯胺；
[0011]
该步骤反应如下所示：
[0012][0013]
其中稳定同位素标记4-氯硝基苯的化学结构如式(i)所示，稳定同位素标记4-氯苯胺的化学结构式如式(ii)所示，其中，r为h或d，*为
12
c或
13
c；
[0014]
(2)将步骤(1)所得稳定同位素标记4-氯苯胺加入氟硼酸中，加入重氮化试剂在-10℃～10℃条件下，反应0.5～6小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，过滤，少量水漂洗，将所得固体加丙酮溶清，滴加乙醚析出固体，过滤，减压干燥，得到稳定同位素标记4-氯苯基氟硼酸重氮盐；
[0015]
该步骤反应如下所示：
[0016][0017]
其中稳定同位素标记4-氯苯基氟硼酸重氮盐的化学结构如式(iii)所示，其中，r为h或d，*为
12
c或
13
c；
[0018]
(3)将步骤(2)所得稳定同位素标记4-氯苯基氟硼酸重氮盐溶于有机溶剂中，加入催化剂、配体、2-氨基苯硼酸，在氮气保护下，在20℃～120℃条件下继续反应2～12小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到纯品稳定同位素标记4
’‑
氯-2-氨基联苯；
[0019]
该步骤反应如下所示：
[0020][0021]
其中稳定同位素标记4
’‑
氯-2-氨基联苯的化学结构如式(iv)所示，其中，r为h或d，*为
12
c或
13
c；
[0022]
(4)将步骤(3)所得稳定同位素标记4
’‑
氯-2-氨基联苯溶于有机溶剂中，加入2-氯烟酰氯，在氮气保护下，在20℃～80℃条件下继续反应1～8小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到纯品稳定同位素标记啶酰菌胺；
[0023]
该步骤反应如下所示：
[0024][0025]
其中稳定同位素标记啶酰菌胺的化学结构如式(labeled boscalid)所示，其中，r为h或d，*为
12
c或
13
c。
[0026]
所述步骤(1)中，稳定同位素标记的4-氯硝基苯为氘标记的4-氯硝基苯、
13
c标记的4-氯硝基苯；还原剂为硼氢化锂、硼氢化钠，硼氢化钾、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠中的一种或几种；添加剂为氯化亚铜、溴化亚铜、氯化钴、氯化镍中的一种或几种；有机溶剂为四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二氧六环、甲苯、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、二甘醇二甲醚、二
甘醇二乙醚等溶剂中的一种或几种；反应温度为-5℃～50℃；反应时间为0.5～6小时。
[0027]
所述步骤(2)中，重氮化试剂为亚硝酸钠、亚硝酸异戊酯、亚硝酸叔丁酯中的一种或几种；有机溶剂为乙醚、甲基叔丁基醚、丙酮、甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿中的一种或几种；反应温度为-10℃～10℃；反应时间为0.5～6小时。
[0028]
所述步骤(3)中，催化剂为醋酸钯、氯化钯、双(三苯基膦)二氯化钯、四(三苯基膦)钯、双(二苯基膦苯基醚)二氯化钯、双(二苯基膦二茂铁)二氯化钯、乙酰丙酮钯、三氟乙酸钯、双(二苯基磷)乙烷二氯化钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、三(二亚苄基丙酮)二钯氯仿加合物中的一种或几种；配体为1,3-二(2,6-二异丙基苯基)氯化咪唑、1,3-二(2,4,6-三甲基苯基)氯化咪唑、1,3-双(2,4,6-三甲苯基)氯化咪唑鎓、1,3-双(2,6-二异丙苯基)氯化咪唑鎓等中的一种或几种；溶剂为四氢呋喃、二氧六环、甲苯、二甲苯、2-甲基四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、苯、氯苯中的一种或几种；反应温度为20℃～120℃；反应时间为2～12小时。
[0029]
所述步骤(4)中，溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇中的一种或几种；反应温度为20℃～80℃；反应时间为1～8小时。
[0030]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的食品安全检测用稳定同位素标记啶酰菌胺的制备，方法所使用的原料简单易得，稳定同位素标记对硝基苯胺合成过程中硝基还原避免使用催化加氢，降低实验室合成难度及危险性；所得稳定同位素标记4-氯苯基重氮氟硼酸盐与2-氨基苯硼酸直接偶联，缩短反应步骤，提高产品总收率；同时使得最终产品的同位素丰度不稀释，最终产品化学纯度高。该结构稳定同位素标记啶酰菌胺的制备方法目前尚未有文献报道，该方法制备所得的稳定同位素标记啶酰菌胺化学纯度大于99％，同位素丰度大于99％。本制备方法得到的食品安全检测用稳定同位素标记啶酰菌胺对我国的食品安全监管检测工作具有重要意义。
附图说明：
[0031]
图1：4-氯苯胺-d4的lc-ms图
[0032]
图2：4
’‑
氯-2-氨基联苯-d4的1h nmr图
[0033]
图3：4
’‑
氯-2-氨基联苯-d4的lc-ms图
[0034]
图4：啶酰菌胺-d4的1h nmr图
[0035]
图5：啶酰菌胺-d4的lc-ms图
[0036]
图6：啶酰菌胺-d4的hplc图
具体实施方式
[0037]
下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明，但它并不是对本发明的范围的任何限制。
[0038]
实施例1：稳定同位素标记4-氯苯胺-d4的制备
[0039][0040]
在250ml三口瓶中，加入4-氯硝基苯-d4(1.61g，10mmol)、乙醇(100ml)、硼氢化钾(3.78g，70mmol)和氯化亚铜(2.97g，30mmol)；在20℃下反应4小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合液减压蒸馏除去溶剂，加入200ml水，用乙酸乙酯萃取(3
×
100ml)；合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤(3
×
100ml)，饱和氯化钠溶液洗涤(3
×
100ml)，加入无水硫酸钠干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记4-氯苯胺-d4(1.1g，收率84％)。lc-ms(esi+)132.10[m+h]，详见附图1。
[0041]
实施例2：稳定同位素标记4-氯苯基氟硼酸重氮盐-d4的制备
[0042][0043]
在100ml三口瓶中，加入稳定同位素标记4-氯苯胺-d4(3.25g，24.3mmol)、50％氟硼酸(8.7ml)和水(10ml)，降温至0℃；将亚硝酸钠(2.5g，36.5mmol)分批加入到上述反应体系中，控制反应体系温度0～5℃，0℃反应3小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，将反应混合溶液过滤，过滤，少量水漂洗，将所得固体加丙酮溶清，滴加乙醚析出固体，过滤，减压干燥，得到稳定同位素标记4-氯苯基氟硼酸重氮盐(3.6g，收率64％)。
[0044]
实施例3：稳定同位素标记4
’‑
氯-2-氨基联苯-d4的制备
[0045][0046]
在100ml三口瓶中，加入稳定同位素标记4-氯苯基氟硼酸重氮盐(2.3g，10mmol)、四氢呋喃(20ml)、催化剂醋酸钯(22mg，0.2mmol)、配体1,3-双(2,4,6-三甲苯基)氯化咪唑鎓(85mg，0.2mmol)、2-氨基苯硼酸(1.5g，11mmol)；在氮气保护下，在30℃下继续反应6小时。tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合液减压蒸馏除去溶剂，加入20ml水，用乙酸乙酯萃取(3
×
20ml)；合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤(3
×
20ml)，饱和氯化钠溶液洗涤(3
×
20ml)，加入无水硫酸钠干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记4
’‑
氯-2-氨基联苯-d4(1.97g，收率95％)。1h nmr(dmso-d6,600m)：δ10.15(s，1h)，8.48(dd，1h)，7.87(dd，1h)，7.6(d，1h)，7.53(dd，1h)，7.46(m，1h)，7.38～7.41(m，2h)，详见附图2；lc-ms(esi+)347.10[m+h]，详见附图3。
[0047]
实施例4：稳定同位素标记啶酰菌胺-d4的制备
[0048][0049]
在50ml三口瓶中，加入稳定同位素标记4
’‑
氯-2-氨基联苯-d4(0.78g，3.76mmol)和异丙醇(10ml)，分批加入2-氯烟酰氯(0.73g，4.14mmol)；在氮气保护下，加热至70℃，并在该温度反应4小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，残留物加入10ml水，用乙酸乙酯(3
×
10ml)萃取；合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤(3
×
10ml)，饱和氯化钠溶液洗涤(3
×
10ml)，加入无水硫酸钠干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记啶酰菌胺-d4(1.01g，收率78％)。1h nmr(dmso-d6,600m)：δ10.15(s，1h)，8.48(dd，1h)，7.87(dd，1h)，7.6(d，1h)，7.53(dd，1h)，7.46(m，1h)，7.38～7.41(m，2h)，详见附图3；lc-ms(esi+)347.10[m+h]，详见附图4；hplc测得化学纯度＝99.25％，详见附图5。同位素丰度＝99.59％d，详见表1。
[0050]
表1啶酰菌胺-d4的同位素丰度
[0051][0052]
质量标准满足食品安全检测用液相色谱串联质谱法所需稳定同位素内标试剂要求。
[0053]
13
c标记和氘和
13
c双标记的啶酰菌胺合成步骤同上述实施例中啶酰菌胺-d4合成路线。
[0054]
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。