一种靶向TRBC1CAR-T细胞的制备方法与应用与流程

一种靶向trbc1 car-t细胞的制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种靶向trbc1 car-t细胞的制备方法。


背景技术：

2.嵌合抗原修饰的t细胞(chimericantigen receptor modifiedt cell，car-t) 是一种经过基因改造的t细胞，利用基因转导技术将含有肿瘤抗原特异性识别单链抗体(scfv)和t细胞激活基序的car导入患者t细胞，使得这些转导了car的t细胞能直接识别癌细胞表面抗原而活化，进而杀死癌细胞。正是因为car-t细胞杀伤癌细胞不需要借助抗原递呈，而大大提高癌细胞杀伤效率。
3.2012年美国宾夕法尼亚大学carl june教授使用靶向cd19的嵌合抗原受体修饰的t细胞治愈白血病患儿emilywhitehead，2017年美国fda又突破性批准两款car-t细胞药物用于b细胞白血病和淋巴瘤治疗，成为细胞治疗领域的一个里程碑。


技术实现要素：

4.本发明主要解决的技术问题是提供一种靶向trbc1 car-t细胞的制备方法与应用，该car-t细胞表达trbc1-car同时可以分泌抗体或细胞因子，能更好的克服肿瘤微环境的免疫抑制，增强car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种靶向trbc1 car-t细胞的制备方法，包括如下步骤：
6.(1)构建携带trbc1-car及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒；
7.(2)将携带trbc1-car及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染t细胞的重组慢病毒载体；
8.(3)从供者提供的外周血中分离pbmc，使用磁珠分离、活化t细胞；
9.(4)将步骤(2)所得的重组慢病毒载体转导进入t细胞，产生表达 trbc1-car的同时分泌抗体或细胞因子的car-t细胞；
10.(5)将步骤(4)所得细胞体外培养；
11.(6)将步骤(5)所得细胞大量扩增；
12.(7)收集表达trbc1-car的同时分泌抗体或细胞因子的car-t细胞。
13.进一步地说，所述抗体为pd-1抗体。
14.进一步地说，所述细胞因子为il18细胞因子。
15.进一步地说，所述trbc1-car所包含的scfv区域为优化密码子后得到的序列，如seq id no.1所示。
16.进一步地说，所述重组慢病毒质粒是靶向trbc1抗原且分泌il18细胞因子的慢病毒转基因质粒。
17.进一步地说，所述重组慢病毒质粒是第三代慢病毒转基因质粒。
18.进一步地说，所述重组慢病毒载体依此包含cmv启动子序列、trbc1 单链抗体、c-myc表位标记、cd8α嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区、ef1 启动子序列、il2ss序列、pd-1抗体序列。
19.进一步地说，步骤(2)中所述的重组慢病毒载体将靶向trbc1抗原的嵌合抗原受体表达在t细胞表面，同时能够分泌il18细胞因子。
20.进一步地说，所述宿主细胞为293ft细胞或293t细胞。
21.一种靶向trbc1 car-t细胞，用于制备抗肿瘤的细胞治疗药物，特别是靶向trbc1阳性的肿瘤干细胞的细胞治疗药物。
22.本发明的有益效果：
23.本发明通过表达trbc1-car而识别和结合肿瘤细胞表面高表达的 trbc1的糖蛋白，并通过胞内信号传导区将信号传入t细胞，从而活化t细胞，促进t细胞分泌细胞因子，该细胞因子进而可以杀伤高表达trbc1的肿瘤细胞。此外，构建一种car-t细胞还可以分泌pd-1抗体，阻断pd-1对效应细胞活性的抑制。
具体实施方式
24.下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
25.实施例1制备表达trbc1-car的同时分泌pd-1抗体的car-t细胞
26.制备方法如下：
27.一、优化密码子：准备trbc1嵌合抗原受体(car)，进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为seq id no.1所示的核苷酸序列。
28.二、构建携带trbc1-car及抗体基因的慢病毒质粒：
29.通过基因合成获得trbc1-cd8-cd28-4-1bbl-cd3ζ+ef1+anti pd1基因，且基因两端分别带有sanb1/sall酶切位点。所述trbc1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，ef1基因的核苷酸序列如seq id no.7所示，cd8、 cd28、4-1bbl、cd3ζ等基因的核苷酸序列分别如seqid no.2、seq idno.3、seq id no.4、seq id no.5所示。snab1/sall双酶切 pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp载体，通过in-fusion技术将各基因片段克隆至载体中，挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。获得靶向trbc1且分泌pd-1抗体的慢病毒载体，命名为pcdh-cmv-trbc1-myc-ef1
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anti-pd1-3rd质粒。
30.三、携带trbc1-car及抗体基因的重组慢病毒质粒感染293ft细胞，制备可感染t细胞的重组慢病毒载体；
31.1. 293ft细胞长到80％时，提前1h换无双抗培养液；
32.2.配置lipo2000(40μl)+1.5ml optimmem，混匀，静置5min；
33.3.配置质粒混合液：准备一支无菌的5ml离心管加入1.5ml无血清 opti-mem培养液、辅助质粒(prsv-rev、pcmv-vsv-g、pmdlg-prre，和慢病毒表达质粒pcdh-cmv-trbc1-myc-ef1-anti-pd1-3rd，充分吹打混匀；
34.4.coating dish：10％ploy-l-lys+80％pbs，3ml/10cm dish，37℃10 min；
35.5.将lipo2000和质粒一起混匀，静置20min；
36.6. 1x te消化293ft细胞，37℃消化1min；
37.7. 1000rpm离心3min收集细胞，pbs或dmem清洗一次；
38.8.将ploy-l-lys coating好的dish用pbs清洗3次；
39.9.向coating好的dish中加入5ml dmem；
40.10.向每个dish中加入3ml lipo2000和质粒的混合液；
41.11.向每个dish中加入3ml用dmen重悬的293ft细胞，充分混匀，均匀铺版，37℃培养；
42.12. 12h后换液，dmem含10％fbs，无双抗；
43.13. 36h后观察细胞中荧光表达情况；
44.14.收集细胞培养液，4℃保存；
45.15.向培养皿中加入8ml培养液，继续37℃培养，生产病毒；
46.16. 36h后收集培养液；
47.17. 4500rpm离心5min；
48.18. 0.45μm滤膜过滤；
49.19.将滤液放入超速离心管中，18000rpm离心3h；
50.20.弃上清，沉淀用dmem重悬；
51.21.再用1ml dmen洗一次，将重悬液加入真空超速离心管中，共6-7ml；
52.22.向离心管底部加3ml 20％蔗糖溶液；
53.23. 24000rpm离心2h；
54.24.弃上清，吸干液体；
55.25.用100μl pbs重悬沉淀；
56.26. 4℃摇床溶解；
57.27.-80℃保存；
58.28.有限稀释法感染293ft细胞测定包装有重组载体的慢病毒滴度。
59.四、从供者提供的外周血中分离pbmc；
60.1.用抗凝管采集健康人外周血15ml，室温静止30min；
61.2. 400g离心30min，吸出血浆备用；
62.3.用pbs稀释抗凝血(1:1)混匀，依据样品体积取15ml离心管，按1:2 加入淋巴细胞分离液(ficoll)，血液样本缓慢加入ficoll，速度尽量缓慢，450g 离心，25min；
63.4.离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层，转入一个新的 15ml离心管中，加入pbs，300g离心10min，弃上清；
64.5.再次加入10ml pbs重悬细胞，160g离心15min，弃上清；
65.6.最后加入10ml的rpmi培养基重悬，300g离心10min，弃上清即得到pbmc。
66.五、使用磁珠分离、活化t细胞：
67.1.以约1
×
106/ml密度加入淋巴细胞培养液培养，并按照磁珠：细胞比例为1:1加入同时包被有抗cd3和cd28抗体的磁珠和终浓度为300u/ml的重组人il-2刺激培养48h；
68.2.retronectin包被24孔板，每孔加入380μl 5μg/ml的retronectin溶液 (pbs)，4℃孵育过夜；
69.3.去除24孔板中的retronectin溶液(pbs)，1ml pbs洗2次。
70.六、采用步骤(3)所得的重组慢病毒载体转导进入t细胞，产生表达 trbc1-car的
同时分泌pd-1抗体的car-t细胞：
71.1.在转染前1h，步骤(5)所得培养液中补加终浓度为10μg/ml的 polybrene以提高转染效率，将细胞接种于包被了retronectin的24孔板中，每孔细胞数目3
×
105，培养液体积600μl；
72.2.按照moi＝10，在pbmcs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。
73.七、将步骤(6)所得细胞体外培养：按照moi＝10，在pbmcs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。
74.八、将步骤(7)所得细胞大量扩增：感染后的细胞每隔一天采用5
×
105/ml 的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度为300u/ml的重组人 il-2。
75.九、取部分细胞悬液，加入bfa 24h后，elisa检测上清液中pd-1的分泌情况，与对照组相比实验组分泌pd-1抗体，说明成功制得表达trbc1-car 且分泌pd-1抗体的car-t细胞，将细胞扩大培养并冻存。
76.十、培养7天后收集细胞，获得表达trbc1-car且分泌pd-1抗体的 car-t细胞。
77.实施例2：制备表达trbc1-car的同时分泌il18的car-t细胞
78.制备方法如下：
79.一、优化密码子：准备trbc1嵌合抗原受体(car)，即trbc1-car，进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为seqid no.1所示的核苷酸序列。
80.二、构建携带trbc1-car及细胞因子基因的慢病毒载体骨架。
81.通过基因合成获得trbc1-cd8-cd28-4-1bbl-cd3ζ+nfat+il18基因，且基因两端分别带有sanb1/sall酶切位点。所述nfat基因的核苷酸序列如 seq id no.6所示，cd8、cd28、4-1bbl、cd3ζ等基因的核苷酸序列分别如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq idno.5所示。snab1/sall 双酶切pcdh-cmv-mcs-nfat-copgfp载体，通过in-fusion技术将各基因片段克隆至载体中，挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。获得靶向trbc1且分泌il-12细胞因子的慢病毒载体，命名为 pcdh-cmv-trbc1-myc-nfat-il18-3rd质粒。
82.三、携带trbc1-car及细胞因子基因的重组慢病毒质粒感染293ft细胞，制备可感染t细胞的重组慢病毒载体。
83.1. 293ft细胞长到80％时，提前1h换无双抗培养液；
84.2.配置lipo2000(40μl)+1.5ml optimmem，混匀，静置5min；
85.3.配置质粒混合液：准备一支无菌的5ml离心管加入1.5ml无血清 opti-mem培养液、辅助质粒(prsv-rev、pcmv-vsv-g、pmdlg-prre，和慢病毒表达质粒pcdh-cmv-trbc1-myc-nfat-il18-3rd，充分吹打混匀；
86.4.coating dish：10％ploy-l-lys+80％pbs，3ml/10cm dish，37℃10 min；
87.5.将lipo2000和质粒一起混匀，静置20min；
88.6. 1x te消化293ft细胞，37℃消化1min；
89.7. 1000rpm离心3min收集细胞，pbs或dmem清洗一次；
90.8.将ploy-l-lys coating好的dish用pbs清洗3次；
91.9.向coating好的dish中加入5ml dmem；
92.10.向每个dish中加入3ml lipo2000和质粒的混合液；
93.11.向每个dish中加入3ml用dmen重悬的293ft细胞，充分混匀，均匀铺版，37℃培养；
94.12. 12h后换液，dmem含10％fbs，无双抗；
95.13. 36后观察细胞中荧光表达情况；
96.14.收集细胞培养液，4℃保存；
97.15.向培养皿中加入8ml培养液，继续37℃培养，生产病毒；
98.16. 36h后收集培养液；
99.17. 4500离心5min；
100.18. 0.45m滤膜过滤；
101.19.将滤液放入超速离心管中，18000rpm离心3h；
102.20.弃上清，沉淀用dmem重悬；
103.21.再用1ml dmen洗一次，将重悬液加入真空超速离心管中，共6-7ml；
104.22.向离心管底部加3ml 20％蔗糖溶液；
105.23. 24000rpm离心2h；
106.24.弃上清，吸干液体；
107.25.用100μl pbs重悬沉淀；
108.26. 4℃摇床溶解；
109.27.-80℃保存；
110.28.有限稀释法感染293ft细胞测定包装有重组载体的慢病毒滴度。
111.四、从供者提供的外周血中分离pbmc。
112.1.用抗凝管采集健康人外周血15ml，室温静止30min；
113.2. 400g离心30min，吸出血浆备用；
114.3.用pbs稀释抗凝血(1:1)混匀，依据样品体积取15ml离心管，按1:2 加入淋巴细胞分离液(ficoll)，血液样本缓慢加入ficoll，速度尽量缓慢，450g 离心，25min；
115.4.离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层，转入一个新的 15ml离心管中，加入pbs，300g离心10min，弃上清；
116.5.再次加入10ml pbs重悬细胞，160g离心15min，弃上清；
117.6.最后加入10ml的rpmi培养基重悬，300g离心10min，弃上清即得到pbmc。
118.五、使用磁珠分离、活化t细胞。
119.1.以约1
×
106/ml密度加入淋巴细胞培养液培养，并按照磁珠：细胞比例为1:1加入同时包被有抗cd3和cd28抗体的磁珠和终浓度为300u/ml的重组人il-2刺激培养48h；
120.2.retronectin包被24孔板，每孔加入380μl 5μg/ml的retronectin溶液(pbs)，4℃孵育过夜；
121.3.去除24孔板中的retronectin溶液(pbs)，1ml pbs洗2次。
122.六、采用步骤三所得的重组慢病毒载体转导进入t细胞，产生表达 trbc1-car的同时分泌细胞因子il18的car-t细胞。
123.1.在转染前1h，步骤(5)所得培养液中补加终浓度为10μg/ml的 polybrene以提高转染效率，将细胞接种于包被了retronectin的24孔板中，每孔细胞数目3
×
105，培养液体积600μl；
124.2.按照moi＝10，在pbmcs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。
125.七、将步骤六所得细胞体外培养：按照moi＝10，在pbmcs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中培养。
126.八、将步骤七所得细胞大量扩增：感染后的细胞每隔一天采用5
×
105/ml 的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度为300u/ml的重组人 il-2。
127.九、取部分细胞悬液，与靶细胞u251-trbc1共培养后，再用pma刺激两天，elisa检测上清液中il18的分泌情况，与对照组相比il18的分泌增强，说明成功制得表达trbc1-car且分泌细胞因子il-12的car-t细胞。
128.十、培养7天后收集细胞，获得表达trbc1-car且分泌细胞因子il-12 的car-t细胞。
129.实施例3制备的表达trbc1-car的同时分泌il18的car-t细胞和表达trbc1-car的同时分泌pd-1抗体的car-t细胞体外杀伤验证
130.分别培养raji细胞和效应细胞表达trbc1-car的同时分泌il18的 car-t细胞和表达trbc1-car的同时分泌pd-1抗体的car-t细胞和表达 trbc1-car的car-t细胞。
131.收集靶细胞raji4
×
105cells和效应细胞(car-t细胞)各3
×
106cells， 300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；用1ml pbs溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；重复一次；用700μl培养基(aim-v培养基+10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基 +10％fbs)重悬靶细胞。
132.设置效靶比为0.31:1、0.63:1、2.5:1、5:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔，37℃5％co2培养箱中培养2h；500g，离心5min，慢升慢降平板离心；取每个孔的20μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液，室温避光孵育15min；每孔加入50μl终止液，酶标仪检测490nm吸光度。不同效靶比条件下，表达trbc1-car的同时分泌il18的car-t细胞和表达trbc1-car的同时分泌pd-1抗体的car-t细胞在raji靶细胞中杀伤效率明显强于表达trbc1-car的car-t细胞，当效靶比为5:1时，本发明制得的表达trbc1-car的同时分泌il18的car-t细胞和表达trbc1-car 的同时分泌pd-1抗体的car-t细胞肿瘤杀伤能力分别为56％和60％。
133.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
134.135.136.137.