中国桔梗rpl13内参基因序列及其引物与应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因以及中国桔梗不同组织部位间目标基因进行表达分析的rpl13内参基因序列及其引物与应用。
背景技术：2.中国桔梗(platycodon grandiflorus)为桔梗科(campanulaceae)桔梗属(platycodo n l.)多年生草本植物，别名包袱花、铃铛花、僧帽花等，原产我国，广布华南至东北。桔梗属仅中国桔梗一种。作为卫生部公布的第一批药食同源目录品种，中国桔梗具有很高的药用和食用价值。除了药食以外，中国桔梗因其花开似铃铛，有蓝、紫、白等花色，单瓣、重瓣等花型，植株挺拔优美，花朵色彩清新淡雅，作为一种很好的园林观赏植物。对中国桔梗的研究主要集中在栽培应用、药用成分检测及功能分析等方面，近年来随着生物技术的迅猛发展，开展了诸如目标基因筛选克隆、转录组分析、基因组测序等分子生物学领域的研究工作，但与其做为一种药、食、观赏兼用的多用途经济作物的重要性来比，分子方面的研究相对还较少，关于中国桔梗目标基因表达分析内参基因的相关研究更是鲜见报道。
3.基因表达分析是阐明植物生命周期中的遗传、信号传导及代谢途径等复杂调控过程的重要工具。目前，转录组测序技术已成为分析生物体基因转录表达水平的普遍方法之一。实时定量pcr(quantitative real-time pcr，qrt-pcr)由于具有定量准确，特异性强，敏感度高，重复性好等特点，被广泛应用于基因表达定量和转录组数据验证等研究工作。然而，由于在试验中受rna质量、反转录效率、引物特异性、样品量以及扩增效率等因素的影响，容易造成qrt-pcr结果与目标基因的真实表达量之间存在一定误差。为了提高qrt-pcr结果的准确性，需利用内参基因进行标准校正，内参基因的稳定性对qrt-pcr结果的准确性具有决定性影响。一般以在生物体的各个组织及各个生长阶段表达水平都较为稳定的看家基因(house-keeping gene)如：肌动蛋白基因(actin，act)、亲环蛋白基因(cyclophilin，cyp)、转录延伸因子基因(elongation factor，ef)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glycer aldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh)、组蛋白基因(histone，his)、18s核糖体rna基因(18s ribosomal rna，18srrna)、微管蛋白基因(tubulin，tub)、多聚泛素酶基因(polyubiquitin，ubq)等作为内参基因。理想的内参基因应该是在所有的细胞、生理特性和样品类型中都稳定表达，但是目前尚未发现这样理想化的内参基因。大量的实验研究表明，在不同的植物、组织及生理状态条件下，内参基因的表达量并不是始终稳定表达。而且选择不适当的内参基因往往会导致错误结论。因此，根据具体的物种、材料及试验条件筛选合适的内参基因至关重要。
4.对于植物类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因的表达谱分析，由于不同研究者分析所用的物种、样品组织及实验条件等的差异较大，所选用的内参基因也有较大差异，另外关于适用于中国桔梗的内参基因鲜见报道。所以有必要筛选出适合用来对中国桔梗类黄酮/花青素色素合成途径中的色素合成相关基因或其它目标基因进行基因表达
谱分析的内参基因。
技术实现要素：5.本发明主要目的是为了解决在对现有野生中国桔梗中的类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因进行表达情况分析时，缺少合适且稳定的内参基因及qrt-pcr分析用内参引物的问题。本发明提供一个长为570bp的中国桔梗rpl13基因序列，可以做为内参基因，根据研究需要设计相应的rt-pcr、qrt-pcr及northern blot等分析对应的扩增引物来对中国桔梗以及与其亲缘关系相近的同科其它植物的不同花色材料的类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因的表达情况进行分析。同时，该内参基因也可用做对中国桔梗及其亲缘关系较近同科的其它植物的茎、叶及花等不同组织部分中的目标基因表达情况进行分析时的内参基因。所提供的一对qrt-pcr分析用内参引物可以直接用做对中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官之间的类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因的表达情况进行分析的qrt-pcr内参引物，也可做为中国桔梗茎、叶及蓝、紫、白不同花色花器官等不同组织部分中的目标基因表达情况进行分析的qrt-pcr内参引物。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
7.本发明第一方面提供中国桔梗rpl13内参基因，核苷酸序列如seq id no：1所示。
8.本发明第二方面提供中国桔梗rpl13内参基因在中国桔梗茎、叶及蓝色、紫色、白色不同花色、不同组织部位的目标基因进行表达谱分析研究中的应用。
9.进一步，优选的是，该内参基因做为分析中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因表达情况的内参基因。
10.进一步，优选的是，分析采用qrt-pcr法。
11.进一步，优选的是，采用qrt-pcr法分析时，所用的内参引物如下：
12.正向引物：5
’‑
gtccaaggctggtgattc-3’；
13.反向引物：5
’‑
cgcggactattggtaaataag-3’。
14.进一步，优选的是，qrt-pcr法分析时，扩增体系为：
15.cdna 1μl，green qpcr supermix 5μl，上游引物10μmol
·
l-1 0.2μl，下游引物10μmol
·
l-1 0.2μl，nuclease-free h2o 3.6μl，总计10μl；
16.扩增程序为：94℃预变性30s；95℃变性6s，60℃退火+延伸30s，共45个循环。
17.本发明第三方面提供中国桔梗类花色素合成基因表达情况分析的内参引物，所述的内参引物如下：
18.正向引物：5
’‑
gtccaaggctggtgattc-3’；
19.反向引物：5
’‑
cgcggactattggtaaataag-3’。
20.申请人在已完成的中国桔梗蓝、紫、白3种不同花色花器官组织的转录组测序结果数据，根据unigene表达量fpkm值在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官各3个生物学重复共9个不同样本中的一致性筛选了9个较常用的内参基因进行稳定性分析，9个常用内参基因分别为aquaporin(aqp)，
ɑ-tubulin(
ɑ-tub)，β-actin(β-act)，cyclophilin(cyp)，elongation factor 1-α(ef-1α)，histone(his)，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(gapdh)，60s ribosomal protein l13-1(rpl13)和polyubiquitin(ub q)。利用genorm、normfider和bestkeeper3个软件分析这9个候选内参基因在中国桔梗的蓝、
紫、白3种花色单瓣花器官、紫色重瓣花器官及蓝色单瓣花植株的茎和叶共6种不同材料各3次重复总18个样品中的稳定性，根据软件分析结果再采用几何平均值计算候选内参基因表达稳定性的综合排名，通过综合排名筛选出表现最稳定的候选基因为rpl13基因，再以rpl13做为内参基因对中国桔梗蓝、紫、白3种不同花色花器官组织转录组测序结果中类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因的表达情况进行qrt-pcr分析验证。验证结果发现利用rpl13基因的qrt-pcr内参引物对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中10个色素合成相关基因表达谱的分析结果与转录组测序的分析结果完全一致。综上，通过对候选内参基因qrt-pcr结果稳定性综合评价，再结合对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因的验证结果证明：rpl13基因在中国桔梗的蓝、紫、白3种花色的单瓣花器官、紫色重瓣花器官及蓝色单瓣花器官植株的茎和叶6种不同材料各3次重复总18个样品中的表达差异最小，表现最稳定；rpl13基因的一对qrt-pcr内参引物，可用来做为对中国桔梗蓝、紫、白3种不同花色花器官中的类黄酮/花青素合成途径中的花色素合成相关基因的表达情况进行分析的内参引物。
21.本发明与现有技术相比，其有益效果为：
22.1、本发明公开了来自于中国桔梗(platycodon grandiflorus)中的一个rpl13基因的核苷酸序列以及根据该核苷酸序列设计的内参引物，为首次报道的可做为中国桔梗类黄酮/花青素合成途径相关基因表达分析时的内参基因及qrt-pcr分析用内参引物。该内参引物可直接做为对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的基因表达情况进行qrt-pcr分析时的内参引物。另外，由于该rpl13基因在中国桔梗的蓝、紫、白色单瓣花器官、紫色重瓣花器官及蓝色单瓣花器官植株的茎、叶共6种不同的组织部位中表达非常稳定，因此该rpl13基因也可做为中国桔梗以及与中国桔梗亲缘关系较近同科其它植物的某一目标基因在中国桔梗以及与中国桔梗亲缘关系较近同科其它植物的茎、叶及蓝、紫、白不同花色花器官进行基因表达情况分析时的内参基因。
23.2、理想的内参基因在各种类型的组织、细胞和各种实验因素条件下应均恒定表达。然而许多研究表明并没有表达绝对稳定的内参基因，任何一种内参基因所谓的恒定表达都只是在一定类型植物或实验条件下“有范围”的恒定。因此，前人文献报道的一些来自于其它物种和组织中的色素合成途径相关基因表达分析时所用的内参基因和引物，不一定适合于中国桔梗中的类黄酮/花青素合成途径中的色素合成相关基因表达分析。而且，关于中国桔梗以及其同科其它植物的内参基因鲜见公开报道。本技术提供了一个来自于中国桔梗的rpl13内参基因核苷酸序列及其一对qrt-pcr分析用内参引物，可用来做为对中国桔梗的类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因表达情况进行分析时的内参基因及qrt-pcr分析用内参引物。而且，由于该rpl13基因在中国桔梗的不同组织部位(包括中国桔梗的蓝、紫、白色单瓣花器官、紫色重瓣花器官及蓝色单瓣花器官植株的茎和叶)中表达差异非常小，因此该rpl13基因也可做为中国桔梗的某一目标基因在中国桔梗的茎、叶及蓝、紫、白不同花色或单、重瓣不同花型花器官的不同组织部位中表达情况进行分析时的内参基因。另外，由于亲缘关系较近的同属或同科植物中的同一类内参基因的保守性相对更高，因此rpl13基因也可以进一步做为除中国桔梗之外的与中国桔梗亲缘关系较近的桔梗科其它植物不同花色材料(或品种)间类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因表达情况分析的内参基因及qrt-pcr分析的内参引物。
24.3、与qrt-pcr分析用引物扩增片段相比，半定量rt-pcr和northern blot等分析需要扩增的片段要长的多，所以进行目标基因表达量qrt-pcr分析用内参引物不一定适合rt-pcr和northern blot分析用。本发明不仅提供了一对可以直接用于中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中相关基因qrt-pcr表达分析用的内参引物，而且还提供了该rpl13基因长为570bp的核苷酸序列，研究者可以根据研究需要设计逆转录(reverse transcription pcr，pcr rt-pcr)分析的内参引物，还可以设计扩增合适长度的rpl13基因片段，做为对这些基因表达情况的northern blot分析时的内参基因核酸杂交片段。
附图说明
25.图1为中国桔梗不同组织材料；a、b、c、d、e、f分别为中国桔梗的蓝色单瓣花、紫色单瓣花、白色单瓣花、紫色重瓣花、蓝色单瓣花植株的茎杆和叶片；
26.图2为rpl13和其它8个候选内参基因的qrt-pcr扩增曲线和熔解曲线；
27.图3为rpl13和其它8个候选内参基因的c
t
值分布图；箱体代表c
t
值的集中范围，箱体中央横线代表中位数，箱体上、下边分别代表上四分位数和下四分位数，箱体上、下端分别代表最大值与最小值；
28.图4为以rpl13做为内参基因对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因表达情况的qrt-pcr分析结果。蓝、紫、白分别代表中国桔梗的蓝色、紫色及白色花器官。＊＊＊表示p＜0.001。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
30.本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
31.本发明除非另有说明，否则百分号代表质量百分数。
32.中国桔梗(公知公用材料，吴姝菊，孟玥，野生桔梗的综合开发与利用研究，北方园艺，2010，(24)：219-221)蓝、紫、白色单瓣花器官组织进行转录组测序。根据植物中常用的内参基因名称在转录组测序结果搜索该类基因的gene id及其对应cds序列和核苷酸序列，再根据gene id搜索该基因在中国桔梗蓝、紫、白色单瓣3种不同花色花器官各3个生物学重复总9个样品中的fpkm值，选择fpkm值在9个样品中都大于100且基本一致的内参基因做为候选内参基因。共筛选了9个候选内参基因，其中rpl13内参基因核苷酸序列为(下划线为qrt-pcr分析用内参引物位置)：atggtgaagcataacaatgttatcccaaatggccacttcaagaaacactggcaggagcgtgttcgcacctggttcaaccaaccagcccgtaaaaccaggagaagaattgcaagacaaaagaaggccgtgaagatctttcccaggcctactgctgggccacttcgtcccattgttcatggccagacattgaagtacaacatgaaagtcagggctggacgaggattctctcttgaggagcttaaggcagcaggcattccaaagaagcttgccccgacaattggtatctctgttgatcaccgccgaagaaaccgatctctagaaggtctccagacaaatgttcagaggttgaagacatacaaggccaaattagttgtcttcccaaggcgtgcacgcaagtccaaggctggtgattctgcccctgaggaactggctacagcaactcaagtccaaggtacttatttaccaatagtccgcgagaagccagctgccgagcttgttaagatca
ctgatgaaatgaaatccttcaatgcctatgccaagctgcgtattgagaggacaaatgaacgtcat.
33.其它8个候选内参基因aqp、
ɑ-tub、β-act、cyp、ef-1α、his、gapdh、ubq的核苷酸序列如seq id no.4-seq id no.11所示；及10个中国桔梗类黄酮/花青素合成途径色素合成相关基因dn23871_c1_g5_i5_1、dn25860_c1_g2_i2_1、dn21700_c0_g1_i1_2、dn10067_c0_g1_i1_1、dn18511_c0_g1_i2_1、dn13766_c0_g1_i7_1、dn15424_c0_g1_i1_2、dn20596_c0_g2_i6_2、dn22437_c0_g1_i9_2、dn25292_c0_g2_i1_2的核苷酸序列如seq id no.12-seq id no.21所示。
34.同时，根据转录组测序kegg数据，选取中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因，其中有2个基因在中国桔梗蓝、紫、白色3种花器官之间表现一定差异表达(表1)。根据中国桔梗rpl13基因核苷酸序列，利用roche lcpds2软件设计引物，rpl13基因引物序列如下：
35.正向引物：5
’‑
gtccaaggctggtgattc-3’，(seq id no.2)
36.反向引物：5
’‑
cgcggactattggtaaataag-3’。(seq id no.3)
37.以中国桔梗的蓝、紫、白色单瓣花器官、紫色重瓣花器官、蓝色单瓣花植株的茎杆和叶片共6种不同材料。每个材料3个生物学重复总18个样品组织的cdna为模版进行qrt-pcr扩增。按照mirvana
tm rna isolation kit说明书提取中国桔梗不同材料总rna，取部分总rna利用nanodrop 2000分光光度计检测浓度及od260/od280值，再通过质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性。取0.5μg总rna按照all-in-one fir st-strand cdna synthesis supermix for qpcr说明书反转录合成cdna，合成的cdna稀释10倍后-20℃储存备用。
38.通过480ⅱ型荧光定量pcr仪(罗氏，瑞士)进行qrt-pcr反应，反应体系：cdna 1μl，green qpcr supermix 5μl，上、下游引物(10μmol
·
l-1
)各0.2μl，nuclease-free h2o 3.6μl。反应程序：94℃预变性30s；95℃变性6s，60℃退火+延伸30s，共45个循环。每反应设置3次技术重复。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每℃采集5次荧光信号。
39.利用microsoft excel 2016对原始c
t
值进行统计计算得出平均c
t
值(mean c
t
)。利用genorm、normfider和bestkeeper软件分析候选内参基因在中国桔梗不同样品中的稳定性，genorm和normfinder软件在导入数据时，先将每个样品的原始c
t
值根据公式q＝2c
t
min-c
t sample(c
t min为依次从各候选内参基因中选出的各样品中的最小c
t
值，c
t samp le为该候选内参基因的各样品ct值)转换成相对表达量q，再将q值输入genorm或nor mfinder软件，计算得到各内参基因的平均表达稳定值(m或s)，该值的大小反映了基因稳定性的高低。bestkeeper软件可直接分析各候选内参基因原始ct值之间的标准差(stand ard deviation，sd)和变异系数(co-variance，cv)即可筛选出最适内参基因。sd和cv值越小，基因表达越稳定，若sd值大于1，说明该基因稳定性较差。根据genorm、normf inder和bestkeeper软件分析得到的候选内参基因的稳定性值，再采用几何平均值法计算候选内参基因表达稳定性的综合排名，通过综合排名筛选出表现最稳定的内参基因。
40.以通过综合排名筛选出表现最稳定的候选基因做为内参基因，对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个花色素合成相关基因的表达量进行qrt-pcr分析(qrt-pcr反
应体系及程序与上文所述一致)。qrt-pcr结果采用2(-δδct
)法计算目标基因在中国桔梗不同花色花器官之间的表达变化。统计学分析采用平均数
±
标准差方式，两组样品之间比较采用独立样本t检验(α＝0.01)，p＜0.05被认为具有统计学差异。运用microsoft excel 2016和r 3.2.3软件处理数据，绘制图表。
41.表1中国桔梗3种不同花色花器官转录组测序结果中筛选到的9个候选内参基因及10个类黄酮/花青素合成途径相关基因的fpkm值
[0042][0043][0044]
表2 9个候选内参基因及10个类黄酮/花青素合成途径相关基因表达qrt-pcr分析引物
[0045][0046][0047]
表3 9个候选内参基因c
t
值分析
[0048]
排序内参基因平均值(md)标准差(sd)变异系数(cv)1cyp24.0630.3761.561％2gapdh20.2720.5202.565％3rpl1322.1870.7473.356％4his20.3850.7013.441％
5β-act21.2890.9234.335％6ubq22.2170.9754.387％7ef-1α23.2491.1484.938％8
ɑ-tub22.0081.2165.525％9aqp23.2771.7867.673％
[0049]
表4 9个候选内参基因稳定性分析
[0050][0051]
表5 9个候选内参稳定性综合排序分析
[0052]
排序内参基因几何平均数1rpl131.5872β-act2.7143cyp3.6343his3.6345gapdh3.6846ubq3.7807
ɑ-tub6.5928ef-1
α
7.3199aqp9.000
[0053]
从表1可以看出：根据转录组测序结果中筛选到的包括rpl13在内的9个候选内参基因在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官共9个样品中的fpkm值都超过100且基本一致。中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因有2个在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官表现一定差异表达：其中dn23871_c1_g5_i5_1在中国桔梗的蓝色、紫色花器官中相对中国桔梗白色花器官都表现为上调表达，在中国桔梗的紫色花器官中相对蓝色花器官也表现为上调表达；dn25860_c1_g2_i2_1在中国桔梗紫色花器官中相对白色和蓝色花器官表现为上调表达，在蓝色和白色花器官之间表现为无差异；其它7个候选内参基因在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官中的表达无明显差异。
[0054]
从图2可以看出：包括rpl13在内的9个候选内参基因的qrt-pcr的熔解曲线均为明
显的单一峰，不存在引物二聚体，说明9个内参基因引物的特异性都较好，专一性高，结果准确可靠，符合qrt-pcr标准。
[0055]
从图3和表3可以看出：9个候选内参基因在中国桔梗不同组织样品中的c
t
平均值最低的为gapdh，最高的为cyp，波动范围相对较小。单个候选内参基因在不同样品间的c
t
值差异最小的为cyp，最大的为aqp。c
t
值与表达量成反比，因此gapdh的表达量最高，cyp表达量最低，其它候选内参基因c
t
值介于二者之间。9个候选内参基因中cyp变异系数最低(1.561％)，其稳定性也最好，而aqp的稳定性相对最差(cv为7.673％)。
[0056]
从表4可以看出：genorm和normfider软件分析结果显示rpl13基因在9个候选内参基因中稳定性最好，而aqp的稳定性最差。bestkeeper软件分析得出的结果则是cyp的稳定性最好，但也是aqp的稳定性最差。
[0057]
从表5可以看出：利用excel对genorm、normfider和bestkeeper 3个软件分析出的9个候选内参基因的稳定性综合性评价结果表明rpl13的稳定性最好，因此rpl13最适合做为本研究的内参基因。
[0058]
以通过稳定性综合分析筛选出的rpl13通过对中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因的表达量进行qrt-pcr分析，对筛选到的rpl13的稳定性进行验证。
[0059]
从图4可以看出：中国桔梗类黄酮/花青素合成途径中的10个色素合成相关基因中有2个基因在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官中的表达水平表现一定差异表达，其它10个表达无差异。qrt-pcr表达分析结果与转录组测序分析结果相一致。通过验证结果再次证明rpl13在中国桔梗的蓝、紫、白3种不同花色花器官中的表达稳定，可以用来做为对中国桔梗不同花色花器官材料间的类黄酮/花青素合成途径中色素合成相关基因qrt-pcr分析的内参基因。
[0060]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。