一种白斑狗鱼性别鉴定的方法

1.本发明属于水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类遗传性别鉴定的分子生物学方法。


背景技术：

2.我国水产养殖业的历史悠久，鱼类的性别决定、分化机制和性别控制技术育种在水产养殖研究和应用方面意义重大，许多鱼类具有性别二态性，半滑舌鳎(cynoglossus semilaevis)、狭鳞庸鲽(hippoglossus stenolepis)等雌性生长速度显著快于雄性，通过性别控制技术实现全雌化养殖是提高其养殖产量的关键技术之一；尼罗罗非鱼(oreochromis mossambicus)则是雄性在生长上显著优于雌性，养殖中期望实现全雄化生产。因此，开展这些鱼类遗传性别检测和性别控制的研究既有重要的科学意义，又有重大的应用潜力和推广前景。
3.白斑狗鱼(esox lucius)，隶属鲑形目(salmoni formes)，狗鱼亚目，狗鱼科，狗鱼属，白斑狗鱼常在亚洲、欧洲以及北美北部的冷水水域自由生长，在我国仅分布于新疆的额尔齐斯河流域。白斑狗鱼肉质坚实、刺少、味美、营养价值极高，兼具观赏性及垂钓娱乐性，使其成为各地进行名优水产养殖的优选品种。近来因对新疆特有经济土著鱼类的开发利用和推广，白斑狗鱼的池塘养殖也陆续在全疆开始普及。
4.因为白斑狗鱼的雌性和雄性在经济价值上存在二态性，雌鱼性成熟明显晚于雄鱼，生长速度远快于雄鱼，且寿命长于雄鱼。无法尽早区分雌雄个体，会导致大量的雄性存在，进而降低了白斑狗鱼的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了白斑狗鱼的推广及养殖产业的形成。
5.分子标记的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。采用的主要方法包括rapd、ssr和aflp等。加拿大西温哥华实验室的devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼y染色体特异的dna片段；匈牙利农业生物技术中心的kovacs等(2000)用rapd扫描非洲鲶鱼雌雄基因池，找到两个雄性性别相关的rapd标记，一个(cgay1)大约2.6kb，另一个(cgay2)458bp，这是首次从鲶鱼中找到性别特异的dna标记。美国新罕布什尔大学的lee等(2004)用分离集团分析法寻找罗非鱼表型性别相连锁的dna标记，找到10个与罗非鱼表型性别连锁的微卫星标记。这些标记可以直接用于不同y染色体等位基因功能的研究和具有一个或者几个y染色体拷贝的亲鱼的鉴定。英国stirling大学的ezaz等(2004)用aflp技术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到三个y染色体连锁(oniy425、oniy382、oniy227)和一个x染色体连锁(onix420)的aflp标记。中国水产科学研究院黄海水产研究所的陈松林(2008)，找到了圆斑星鲽性别特异分子标记，而有关白斑狗鱼性别特异分子标记以及遗传性别鉴定的分子生物学技术，目前国内外均未见报道。因此，本领域技术人员提供了一种白斑狗鱼性别鉴定的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供一种白斑狗鱼性别鉴定的方法，提取白斑狗鱼鳍条dna，采用6#引物(reseqindel49)，
7.将6#引物(reseqindel49)合成和溶解，用pcr扩增反应进行鉴别，
8.6#引物的序列分别为：
[0009]5′
gtgcatgtaggtattgtacctattg3
′
和5
′
ctgtttcaccctgtgacgg3
′
。
[0010]
优选的：白斑狗鱼鳍条dna的提取步骤如下：
[0011] (a)约30mg的经过无水乙醇保存的鳍条样品组织尽可能地剪碎，风干1h；
[0012] (b)加入600μl裂解液，10μl蛋白酶k(20mg/ml)，混匀56℃水浴，裂解细胞2h；
[0013] (c)离心(8000rpm5min)，取上清液约550μl；
[0014] (d)加入550μl酚-氯仿异戊醇手动轻轻混匀10min，13000rpm、4℃离心10min；
[0015] (e)小心吸取400μl上清液(不要吸到中间的蛋白质)于新的ep管；
[0016] (f)加入800μl经过-20℃预冷的无水乙醇，-20℃放置30min，4℃、 13000rpm离心10min；
[0017] (g)弃上清液，dna是在ep管壁和底部的白色沉淀。加入70％乙醇，轻轻吹打后13000rpm离心5min；
[0018] (h)重复操作步骤g；
[0019] (i)加入70μl ddh2o溶解；
[0020] (j)1.5％琼脂糖凝胶电泳，检验dna提取效果可用全波长酶标仪测定浓度和纯度，根据酶标仪测定的dna浓度，将各个dna样品的浓度稀释调整到50-100ng/μl。
[0021]
优选的：pcr扩增反应：操作步骤如下：
[0022] (a1)pcr反应体系：采用pcr反应预混液(mix)，每个反应12.5μl；
[0023][0024] (b1)pcr反应程序如下：
[0025]
首先是94℃变性10min，然后进行35个循环的反应，具体包括94℃变性30s，然后进行57℃退火30s，退火后72℃延伸1min，反应结束再72℃延伸10min，最后4℃进行保存。
[0026]
优选的：所述pcr扩增反应进行鉴别包括琼脂糖凝胶电泳检测和性别鉴定。
[0027]
优选的：所述琼脂糖凝胶电泳检测和性别鉴定步骤如下：
[0028] (a2)琼脂糖凝胶电泳：
[0029]
利用琼脂糖水平电泳仪在150v的电压下进行2％的琼脂糖凝胶电泳，检测pcr扩增产物，采用dl2000作为电泳maker(其条带其条带由上至下是2000 bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；
[0030] (b2)性别鉴定：
[0031]
6#引物(reseqsnp381)雄性特异条带双末端测序拼接结果如图4所示。该雄性特异条带长度为500bp，序列一端有162个碱基与参考基因组相匹配(10个特异碱基除外)，另一端有224个碱基与参考基因组相匹配(11个特异碱基除外)。
[0032]
优选的：所述测序结果采用chromas进行测序质量的判定，用dnaman进行序列的拼接与比对分析。
[0033]
优选的：所述6#引物(reseqindel49)雄性特异条带双末端测序与雌雄共有条带单末端测序结果进行序列比对。
[0034]
本发明的技术效果和优点：
[0035]
本发明克服现有技术的不足，提供一种基于性别连锁的特异分子标记，可以简单快速地实现遗传性别，大大节省人力物力。
附图说明
[0036]
图1是本甲请实施例提供的白斑狗鱼性别鉴定的方法中4尾雌鱼和4尾雄鱼的dna对有条带的24对引物扩增结果图；
[0037]
图2是本技术实施例提供的白斑狗鱼性别鉴定的方法中6#引物(reseqindel49)雄性特异条带双末端测序拼接结果图；
[0038]
图3是本技术实施例提供的白斑狗鱼性别鉴定的方法中引物(reseqindel49)pcr扩增得到的雌、雄共有条带进行测序结果图；
[0039]
图4是本技术实施例提供的白斑狗鱼性别鉴定的方法中6#引物(reseqindel49)对45尾雌鱼和66尾雄鱼进行pcr扩增结果图。
具体实施方式
[0040]
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
[0041]
在本实施例中提供一种白斑狗鱼性别鉴定的方法，包括如下步骤：
[0042] (1)、提取白斑狗鱼鳍条dna，采用6#引物(reseqindel49)，
[0043]
将6#引物(reseqindel49)合成和溶解，用pcr扩增反应进行鉴别，
[0044]
6#引物的序列分别为：
[0045]5′
gtgcatgtaggtattgtacctattg3
′
和5
′
ctgtttcaccctgtgacgg3
′
。
[0046] (2)、白斑狗鱼鳍条dna的提取步骤如下：
[0047] (a)约50mg的经过无水乙醇保存的鳍条样品组织尽可能地剪碎，风干1h；
[0048] (b)加入600μl裂解液，10μl蛋白酶k(20mg/ml)，混匀56℃水浴，裂解细胞2h；
[0049] (c)离心(8000rpm 5min)，取上清液约550μl；
[0050] (d)加入550μl酚-氯仿异戊醇手动轻轻混匀10min，13000rpm、4℃离心10min；
[0051] (e)小心吸取400μl上清液(不要吸到中间的蛋白质)于新的ep管；
[0052] (f)加入800μl经过-20℃预冷的无水乙醇，-20℃放置30min，4℃、 13000rpm离心10min；
[0053] (g)弃上清液，dna是在ep管壁和底部的白色沉淀。加入70％乙醇，轻轻吹打后13000rpm离心5min；
[0054] (h)重复操作步骤g；
[0055] (i)加入70μlddh2o溶解；
[0056] (j)1.5％琼脂糖凝胶电泳，检验dna提取效果可用全波长酶标仪测定浓度和纯度，根据酶标仪测定的dna浓度，将各个dna样品的浓度稀释调整到50-100ng/μl。
[0057]
实施例1
[0058]
pcr反应试验操作步骤如下：
[0059] (a1)、pcr反应采用天根生化科技北京有限公司的pcr反应预混液(mix)，每个反应12.5μl，具体的反应体系见表1。
[0060][0061] (b1)、pcr反应程序如下：首先是94℃变性10min，然后进行35个循环的反应，具体包括94℃变性30s，然后进行57℃退火30s，退火后72℃延伸1min，反应结束再72℃延伸10min，最后4℃进行保存。
[0062]
琼脂糖凝胶电泳检测和性别鉴定：
[0063] (a2)琼脂糖凝胶电泳：
[0064]
利用琼脂糖水平电泳仪(北京六一，dycp-31dn)在150v的电压下进行 2％的琼脂糖凝胶电泳，检测pcr扩增产物，采用dl2000作为电泳maker(其条带其条带由上至下是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
[0065] (b2)性别鉴定：
[0066]
6#引物(reseqsnp381)雄性特异条带双末端测序拼接结果如图4所示。该雄性特异条带长度为500bp，序列一端有162个碱基与参考基因组相匹配(10个特异碱基除外)，另一端有224个碱基与参考基因组相匹配(11个特异碱基除外)。
[0067]
pcr扩增产物的测序与分析
[0068]
pcr扩增产物进行测序，其中对引物扩增出来的雌、雄共有条带进行单末端测序，对引物扩增出来的性别特异条带进行双末端测序。测序结果采用chromas进行测序质量的判定，用dnaman进行序列的拼接与比对分析。
[0069]
将该序列与雌雄共有条带单末端测序结果进行序列比对，结果如图2所示。图中在24号染色体(nc_025991.4)的734304bp-735909bp位置多扩增出来的这个片段是引物设计序列的剪短版本，自51bp-324bp为缺失片段，缺失了273bp。
[0070]
6#引物(reseqsnp381)雄性特异条带双末端测序拼接结果如图3所示。该雄性特异条带长度为500bp，序列一端有162个碱基与参考基因组相匹配(10 个特异碱基除外)，另一端有224个碱基与参考基因组相匹配(11个特异碱基除外)。
[0071]
将该序列与雌雄共有条带单末端测序结果进行序列比对，结果如图3所示。图中在24号染色体(nc_025991.4)788638bp-789167bp位置insertion 位点多扩增出来的这个片段是引物设计序列的增长版，自162bp-301bp为插入片段，插入了139bp。该结果也证明了已报道的白斑狗鱼雄性异型性别决定类型。
[0072]
图4显示的是6#引物(reseqindel49)对45尾雌鱼和66尾雄鱼dna进行 pcr扩增结果，该引物来自位于24号染色体(nc_025991.4)的789004bp位置的insertion位点侧翼序列。从图中可以看出，6#引物(reseqindel49)在 45尾雌鱼和66尾雄鱼的扩增结果与4#引物(reseqsnp381)非常相似，引物设计的预定产物是雌雄共有条带，大小为530bp，在雄鱼dna多扩增出来一个大小约650bp的条带。在45尾雌鱼中有两个条带和66尾雄鱼中有2尾只有一个条带的个体与4#引物(reseqsnp381)相同，通过卡方检验对双条带与雄性表型的相关性进行计算，得到x2＝91.17，p＝1.3e-21。
[0073]
6#引物(reseqindel49)对45尾雌鱼和66尾雄鱼dna进行pcr扩增结果都表现出非常强的性别相关性，雌性个体的单条带的比率为42/44(95.5％)，雄性个体的单条带的比率为64/67(4.5％)。双条带与雄性表型具有高度的相关性。
[0074]
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域及相关领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。本发明中未具体描述和解释说明的结构、装置以及操作方法，如无特别说明和限定，均按照本领域的常规手段进行实施。